傳染性喉氣管炎病毒gD蛋白多克隆抗體制備與運用

張曉彩，趙妍，張雪梅，劉勝旺

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，禽呼吸道病創(chuàng)新團隊，哈爾濱 150001）

傳染性喉氣管炎病毒gD蛋白多克隆抗體制備與運用

張曉彩，趙妍，張雪梅，劉勝旺*

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，禽呼吸道病創(chuàng)新團隊，哈爾濱 150001）

雞傳染性喉氣管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一種急性接觸性上部呼吸道病。ILTV表面糖蛋白gD能刺激機體產(chǎn)生良好體液和細胞免疫應答，編碼該蛋白的gD基因是ILTV主要抗原性基因之一。以ILTV-LJS09株基因組為模板，PCR擴增gD基因主要抗原區(qū)域（54～344 aa）及gD基因，分別亞克隆至pGEX-6P-1和pCAGGS載體，構(gòu)建原核表達載體pGEX-6P-1-gD163/1032和真核表達載體pCAGGS-gD。利用純化ILTV、原核表達純化獲得重組蛋白r-gD和真核質(zhì)粒pCAGGS-gD，對新西蘭大白兔進行免疫與加強免疫，制備兔抗ILTV gD多克隆抗體。通過間接免疫熒光試驗確定ILTV gD多克隆抗體和ILTV感染的雞肝癌細胞表達蛋白發(fā)生反應，表明制備的ILTV gD多克隆抗體能識別ILTV天然抗原表位，最佳稀釋度為1 ? 1 000；用ILTV感染的LMH細胞培養(yǎng)物進行Western Blot分析，在40 ku左右出現(xiàn)一條特異性條帶，與預期ILTV gD蛋白大小相符。激光共聚焦定位感染雞肝癌細胞中ILTV gD蛋白，發(fā)現(xiàn)ILTV gD蛋白主要表達于感染細胞胞漿及融合細胞交界處。

ILTV gD蛋白；原核表達與純化；真核表達；多克隆抗體；細胞定位

張曉彩,趙妍,張雪梅,等.傳染性喉氣管炎病毒gD蛋白多克隆抗體制備與運用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(5):69-75.

Zhang Xiaocai,Zhao Yan,Zhang Xuemei,et al.Preparation of polyclonal antibodies against gD protein of ILTV and application[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(5):69-75.(in Chinese with English abstract)

雞傳染性喉氣管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一種急性呼吸道傳染病[1]。以呼吸困難、喘氣、咳出血樣分泌物、受侵害氣管黏膜細胞腫脹和水腫、出血并導致糜爛為特征，在急性暴發(fā)時發(fā)病率為100%，死亡率高達70%，導致雞死亡和產(chǎn)蛋量下降，是危害養(yǎng)禽業(yè)重要疫病之一[2]。

ILTV屬于α-皰疹病毒亞科，基因組大小為155 kb，由一個長獨特區(qū)（UL，110 kb）和一個短獨特區(qū)（US，14 kb），及US區(qū)兩側(cè)的反向重復序列（IRS和TRS，各15 kb）組成[3]。ILTV僅一種血清型，但可表現(xiàn)不同毒力，與其他皰疹病毒不同，ILTV宿主范圍窄，只感染雞，偶爾感染野雞，火雞不能被自然感染，其他種類宿主未知。

gD糖蛋白由ILTV保守區(qū)US6基因編碼，是ILTV病毒粒子表面和病毒感染細胞主要分子之一，在病毒復制和誘導宿主體內(nèi)發(fā)生免疫應答反應時必需，且在皰疹病毒糖蛋白中g(shù)D蛋白較gB和gC能引起更持久免疫反應[4]。Johnson等報道ILTV SA-2株gD基因序列[5]，但gD基因功能不明，有關(guān)糖蛋白gD研究很少，感染細胞分布部位和功能尚待研究。范薇對鴨瘟病毒gD蛋白進行亞細胞定位研究，發(fā)現(xiàn)gD蛋白主要定位在細胞核以外部分[6]，孫永珍等研究ILTV gC蛋白定位，發(fā)現(xiàn)gC蛋白存在于細胞漿和細胞膜上[7]。但目前尚未對ILTV gD蛋白定位展開研究。

由于目前尚無針對ILTV gD蛋白商品化抗體，因此本研究以純化ILTV、原核表達純化獲得重組蛋白r-gD和真核質(zhì)粒pCAGGS-gD為免疫原，免疫新西蘭大白兔，制備ILTV gD多克隆抗體。利用激光共聚焦方法初步鑒定ILTV gD蛋白在感染雞肝癌細胞（Hepatocellular carcinoma epithelial cell line，LMH）中定位。本研究制備ILTV gD多克隆抗體在病原生物學特性及抗原性研究、檢測與鑒別診斷等方面具有重要價值，為ILTV gD蛋白生物學特性及ILTV感染機制研究提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康清潔級新西蘭雄性大白兔2只，體重2 kg·只-1，購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 病毒及陽性血清

ILTV-LJS09毒株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽呼吸道病創(chuàng)新團隊分離并保存；ILTV陽性血清由本研究所制備。

1.3 菌株、載體、細胞及主要試劑

大腸桿菌TG1、BL21感受態(tài)細胞、pGEX-6P-1、pCAGGS載體、幼倉鼠腎細胞（A BHK-derived cell line，BSR）和雞肝癌細胞（LMH）由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽呼吸道病創(chuàng)新團隊保存。Protein Ladder購自Thermo公司；T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司；兔源GST抗體、紅外標記山羊抗兔IgG、紅外標記兔抗雞IgY，F(xiàn)ITC-羊抗兔IgG，TRITC-山羊抗兔IgG、FITC-兔抗雞IgY等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。GST樹脂購自MERCK公司，蛋白裂解液、5×SDS-PAGE Loading Buffer購自碧云天公司。

1.4 病毒增殖與基因組提取

ILTV-LJS09毒株感染單層LMH細胞，當細胞病變達到80%時收集細胞培養(yǎng)物，凍融3次后按照基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設計與基因擴增

根據(jù)本研究所對ILTV-LJS09毒株全基因組序列（登錄號：JX458822.1）測定結(jié)果，利用DNAStar protean軟件分析gD蛋白抗原性、親水性和表面可及性（見圖1），選擇抗原性強區(qū)段原核表達，gD基因全長擴增用于構(gòu)建真核表達載體。采用PrimerPrimer 5.0軟件設計引物（詳見表1）序列中劃線部分為引入酶切位點。引物由華大科技有限公司合成。

以提取ILTV-LJS09株基因組DNA為模板分別PCR擴增gD163/1032片段和gD基因全長。反應體系：10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol·L-1）2.0 μL，引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，模板（300 ng·μL-1）4 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，加ddH2O至25 μL。反應條件：95℃5 min；94℃10 s；59.3℃12 s；72℃1min，35個循環(huán)；72℃7 min；4℃∞。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

圖1 目的基因抗原性分析Fig.1Antigenic analysis of the gD gene

表1 gD擴增引物Table 1Primers for gD

1.6 原核表達載體pGEX-6P-1-gD163/1032和真核表達載體pCAGGS-gD構(gòu)建與鑒定

將純化后gD163/1032和gD全基因分別以XhoⅠ和Eco RⅠ酶切、連接到以相同酶切處理原核表達載體pGEX-6P-1和真核表達載體pCAGGS中。獲得質(zhì)粒分別命名為pGEX-6P-1-gD163/1032和pCAGGS-gD，由華大科技有限公司序列測定。

1.7 原核表達載體pGEX-6P-1-gD163/1032誘導表達、純化及鑒定

將陽性重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-gD163/1032轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑取單個菌落，次日以1 ? 100比例接入新鮮LB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)OD600至0.4時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，誘導表達4 h。離心收集菌體，加適量PBS將菌體重懸，超聲破碎后，離心分別收集上清和沉淀，將獲得重組蛋白r-gD進行SDS-PAGE分析。將蛋白凝膠轉(zhuǎn)印硝酸纖維素（NC）膜，過夜封閉后Western Blot分析。以5%脫脂乳封閉過夜，一抗分別為兔抗GST抗體（1 ?5 000）和ILTV陽性血清（1 ?100），37℃2 h，二抗分別為紅外標記山羊抗兔IgG和紅外標記兔抗雞IgY，37℃作用1 h，以紅外熒光掃描成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

GST樹脂按說明書要求處理平衡后，將超聲后離心過濾重組蛋白上清倒入樹脂中，每5 min旋轉(zhuǎn)一次柱子，1 h后用10倍柱體積PBS洗滌樹脂，并以適量Elution Buffer洗脫目的蛋白，測定蛋白濃度，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 真核表達載體pCAGGS-gD大量制備純化與瞬時表達的IFA鑒定

SDS堿裂解法大量制備真核表達載體pCAGGS-gD，并測定純度與濃度。將純化pCAGGS-gD轉(zhuǎn)染BSR細胞，48 h后無菌PBS洗4次，然后用冰冷無水乙醇4℃條件固定細胞，20 min后含Tween-20 PBS洗4次，ILTV陽性血清（1 ? 100）作為一抗，F(xiàn)ITC-兔抗雞IgY（1 ? 5 000）為二抗，倒置熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。

1.9 多克隆抗體制備

首先將純化ILTV（哈爾濱獸醫(yī)研究所禽呼吸道病創(chuàng)新團隊制備）以背部分點注射方式免疫新西蘭大白兔，免疫前采血，分離陰性血清備用。2周后，將純化重組蛋白r-gD與弗氏完全佐劑等量混合，以相同方式免疫，1 mg·只-1。2周后，以大量制備并純化的pCAGGS-gD 0.5 mg·只-1按相同的免疫方式進行第三次免疫。三次免疫后，再以純化重組蛋白r-gD加強免疫，并于加強免疫后第7天心臟采血，分離血清，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 IFA檢測ILTV gD多克隆抗體與LMH細胞中ILTV反應

ILTV-LJS09感染單層LMH細胞，待80%病變后固定細胞，以10倍倍比稀釋gD多克隆抗體作一抗，以FITC-羊抗兔IgG為二抗，同時設置未接毒細胞作陰性對照，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，確定抗體最佳稀釋度。

1.11 Western Blot測定ILTV gD多克隆抗體特異性

ILTV-LJS09感染單層LMH細胞，待80%病變后收集細胞，12 000 r·min-1離心10 min，加適量蛋白裂解液作用15 min，然后加5×SDS-PAGE Loading Buffer沸水中煮5 min，SDS-PAGE分析。將蛋白凝膠轉(zhuǎn)印NC膜，過夜封閉后Western Blot分析。以ILTV gD多抗作為一抗，紅外標記的山羊抗兔IgG（1 ? 15 000）為二抗，用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，確定抗體最佳稀釋度。

1.12 ILTV gD蛋白在LMH細胞定位

在烏龍磯水庫除險加固工程設計中，對棄土棄渣場布局進行了合理規(guī)劃，以減少對環(huán)境的影響。棄土棄渣結(jié)束后，進行覆土、整平等土地整治，覆土土料來源為棄土和棄渣場原有表土，棄土棄渣時要求下渣上土，以滿足植被恢復的基本要求。棄土棄渣場土地整治完成后，采取栽種植物進行植被恢復，根據(jù)棄渣形態(tài)和成分，種植較易成活的樹種和覆蓋草皮。

ILTV-LJS09感染LMH細胞，待感染細胞出現(xiàn)明顯病變后，PBS洗3次，以80%丙酮于-40℃固定細胞30 min，gD多克隆抗體（1 ?100）一抗，TRITC-山羊抗兔IgG（1 ? 200）為二抗，DAPI染細胞核，將未感染病毒細胞作對照，激光共聚焦掃描系統(tǒng)并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ILTV gD蛋白抗原性分析結(jié)果

DNAStar軟件中protean分析gD蛋白親水性、抗原性和表面可及性（見圖1），選擇抗原性強區(qū)段原核表達。

2.2 目的基因gD163/1032和gD的PCR擴增結(jié)果

ILTV-LJS09毒株基因DNA為模板，分別PCR擴增gD163/1032（見圖2A）和gD基因（見圖2B），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果可見gD基因PCR擴增為1 100 bp左右的片段，gD163/1032擴增為880 bp片段，條帶均與預期結(jié)果相符。

圖2 gD163/1032與gD基因PCR擴增Fig.2Amplification of gD163/1032 and gD gene by PCR

2.3 原核表達載體pGEX-6P-1-gD163/1032和真核表達載體pCAGGS-gD構(gòu)建與鑒定結(jié)果

2.4 原核表達載體pGEX-6P-1-gD163/1032誘導表達、純化及鑒定

SDS-PAGE分析表明，重組蛋白大小約為58 ku，與預期序列一致；重組蛋白存在于超聲上清中，說明重組蛋白以可溶性蛋白形式存在（見圖4）；經(jīng)GST標簽樹脂純化得到重組蛋白r-gD。重組蛋白與GST標簽抗體（見圖5A）和ILTV陽性血清（見圖5B）發(fā)生特異性反應，出現(xiàn)一條明顯反應條帶，表明表達產(chǎn)物具有良好反應原性。

2.5 真核表達載體pCAGGS-gD瞬時表達IFA鑒定結(jié)果

通過在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染真核表達載體pCAGGS-gD的BSR細胞與ILTV全病毒抗血清作用后出現(xiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pCAGGS載體的BSR細胞對照未見綠色熒光，結(jié)果表明：真核表達載體pCAGGS-gD能在BSR細胞中高效表達gD蛋白（見圖6）。

2.6 IFA檢測ILTV gD多克隆抗體與LMH細胞中ILTV反應

將制備的ILTV gD多抗10倍倍比稀釋進行IFA檢測，結(jié)果表明，ILTV gD多克隆抗體可和ILTV感染的LMH細胞表達的蛋白發(fā)生反應，并且ILTV gD多克隆抗體在1 ? 10、1 ? 100、1 ? 1 000、1 ? 10 000稀釋時均可以和ILTV蛋白發(fā)生反應，確定用于IFA分析時一抗最佳稀釋倍數(shù)是1 ?1 000（見圖7），ILTV gD多克隆抗體效價大于1 ? 1 000。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-gD163/1032和pCAGGS-gD鑒定Fig.3Identification of plasmids pGEX-6P-1-gD163/1032 and pCAGGS-gD by digestion and PCR

圖4 重組蛋白r-gD表達及純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4SDS-PAGE analysis of the expressed and purified recombinant protein r-gD

圖5 不同抗體鑒定重組蛋白r-gD的Western Blot分析Fig.5Western Blot analysis of recombinant protein r-gD by different antibodies

圖6 IFA檢測pCAGGS-gD瞬時表達Fig.6Identification of the transient expression of plasmid pCAGGS-gD by IFA

圖7 IFA檢測ILTV gD多克隆抗體最佳稀釋度Fig.7gD antibody best dilution determined by immunofluorescence assay

2.7 Western Blot分析ILTV gD多克隆抗體特異性

將感染ILTV-LJS09的LMH細胞刮下，以制備的多抗為一抗進行Western Blot分析，結(jié)果顯示在40 ku左右出現(xiàn)一條特異性條帶（見圖8），大小與預期ILTV gD蛋白相符。

2.8 ILTV gD蛋白在LMH細胞的定位分析

ILTV-LJS09感染LMH細胞，待出現(xiàn)病變后將細胞固定，免疫熒光染色，DAPI染核，在激光共聚焦成像系統(tǒng)觀察gD蛋白在細胞中定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gD蛋白主要表達于感染細胞胞漿及融合細胞胞漿中（見圖9）。

圖8 Western Blot檢測ILTV gD多克隆抗體特異性Fig.8Western Blot analysis of gD antibody specificity

圖9 激光共聚焦檢測ILTV-LJS09 gD蛋白在LMH上分布Fig.9LSCM observation of ILTV-LJS09 gD protein in LMH cells

3 討論

本試驗應用DNAStar軟件分析gD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性，選擇抗原性較強區(qū)域作目的片段，比較分析15株ILTV gD氨基酸序列，選擇氨基酸相對較保守區(qū)域（gD 54～344 aa）制備多克隆抗體，獲得的ILTV gD多克隆抗體具有廣譜性。IFA試驗結(jié)果表明，本研究獲得的ILTV gD多克隆抗體與ILTV感染LMH細胞表達的蛋白發(fā)生反應，表明制備的ILTV gD多克隆抗體能識別ILTV天然抗原表位，所獲抗體在1 000倍稀釋時檢測效果最佳；用ILTV感染LMH細胞培養(yǎng)物進行Western Blot分析，結(jié)果表明，僅40 ku出現(xiàn)特異性條帶，與預期ILTV gD蛋白大小相符，證明本研究制備多克隆抗體主要識別ILTV gD蛋白。大部分學者在制備多克隆抗體時采用直接免疫蛋白或免疫質(zhì)粒，本研究首次嘗試通過三種不同形式抗原交替免疫方式，即ILTV、純化r-gD重組蛋白、真核表達載體，首次免疫使用純化ILTV，使機體產(chǎn)生能識別ILTV天然抗原表位抗血清，再利用重組蛋白r-gD和真核表達質(zhì)粒pCAGGS-gD加強免疫，針對ILTV gD蛋白抗體含量顯著提高，試驗結(jié)果證明該免疫程序可以獲得高效價、高特異性多克隆抗體。本試驗利用激光共聚焦檢測gD蛋白在細胞中分布，發(fā)現(xiàn)gD蛋白在分散的單個細胞中含量少，在融合細胞的細胞漿和細胞膜上分布較多且集中。gD蛋白在LMH細胞中定位與皰疹病毒糖蛋白在感染細胞中分布一致[8-10]。

ILT作為危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，對該病毒生物學特性研究及新型診斷試劑研發(fā)尤為必要。本研究制備ILTV gD多克隆抗體為研究gD蛋白的生物學特性，ILTV感染機制，ILT臨床診斷及診斷試劑盒研發(fā)奠定基礎，也為ILTV gD基因工程重組疫苗和基因缺失疫苗鑒別診斷提供試驗材料，應用前景廣闊。

4 結(jié)論

本研究利用三種不同形式抗原，即純化病毒，純化r-gD蛋白，gD真核表達質(zhì)粒，交替免疫新西蘭大白兔，制備高效價、高特異性ILTV gD多克隆抗體。

[1]殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997.

[2]Bagust T J.Laryngotracheitis(Gallid-l)herpesvirus infection in the chicken:Latency establishment by wild and vaecines strainsof lLT virus[J].Avian Pathol,1986,15:581-95.

[3]Guy J S,Bagust T J.Laryngotracheitis[M]//Saif Y M,Barnes H J, Glisson J R,et al.Disease of poultry 11th ed.Iowa,Iowa:Iowa State University Press,2003:121-134.

[4]Johnson M A,Prideaux C T,Tyack S G,et al.Sequence characteristics of a gene in infectious laryngotracheitis virus homologous to glycoprotein D of herpes simplex virus[J].Arch Virol,1994,125:221-233.

[5]Johnson M A,Tyack S G,Prideaux C T,et al.Sequence characteristics of agene infectious laryngotracheitis virus homologous to glycoprotein D of herpes simplex virus DNA sequence[J]. DNA Seq,1995,5:191-4.

[6]范薇.鴨瘟病毒基因發(fā)現(xiàn)及重組蛋白應用研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學,2012.

[7]孫永珍,趙妍,崔紅玉,等.雞傳染性喉氣管炎病毒蛋白的多抗制備、細胞定位及功能研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2014,45(8): 1309-1316.

[8]劉琰.鴨腸炎病毒gD蛋白亞細胞定位及其對病毒感染相關(guān)作用的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2012.

[9]劉慶偉,邱亞峰,王曉杜,等.抗偽狂犬病毒gC抗體制備及其gC蛋白表達[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(3):108-112.

[10]劉峰源.鴨腸炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表達及部分功能的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2008.

Preparation of polyclonal antibodies against gD protein of ILTV and application

ZHANG Xiaocai,ZHAO Yan,ZHANG Xuemei,LIU Shengwang

(Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Group of Avian Respiratory Disease,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China)

Infectious Laryngotracheitis(ILT)is a highly contagious respiratory system disease caused by Infectious Laryngotracheitis Virus(ILTV).The ILTVgDgene was one of the main antigenic genes of ILTV,which can stimulate humoral immunity and cellular immune responsein vivo.The major antigenic region ofgDgene(54-344 aa)and the completedgDgene were amplified from ILTV-LJS09. The two fragments were subsequently inserted into pGEX-6P-1 and pCAGGS,respectively.The two expression vector were named pGEX-6P-1-gD163/1032 and pCAGGS-gD.The purfied ILTV,recombinant protein r-gD,and pCAGGS-gD plasmid were used as antigen to prepare polyclonal antibody.The immunofluorescence assay showed that ILTV gD polyclonal antibody could react with ILTV infected LMH cell cultures and demonstrated that ILTV gD polyclonal antibody could identify natural antigen epitope of ILTV.The best dilution was 1 ? 1 000 determined by immunofluorescence assay.Western Blotresult revealed a specific band approximately 40 ku,which was consistent with ILTV gD.The result showed that the polyclonal antibody has specificity.Detecting the location of gD protein in ILTV infected LMH showed that gD protein expressed in cytoplasm and the junction of fused cells.

ILTV gD protein;prokaryotic expression and purification;eukaryotic expression; polyclonal antibody;cellular location

S852.65+9.1

A

1005-9369（2016）05-0069-07

2016-04-27

農(nóng)業(yè)部蛋雞科技創(chuàng)新體系項目（CARS-41-K12）

張曉彩（1990-），女，碩士研究生，研究方向為雞痘病毒。E-mail:zhangxiaocaijy@163.com

*通訊作者：劉勝旺，研究員，博士生導師，研究方向為傳染性支氣管炎病毒流行病學調(diào)查。E-mail:swliu@hvri.ac.cn

時間2016-5-27 14:15:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160527.1415.020.html