涂膜和熱處理對葡萄能量和貯藏生理及品質(zhì)的影響

張 群，周文化，譚 歡，楊明之，劉細(xì)霞

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，長沙 410004； 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長沙 410125；3. 湖南省長沙縣第一中學(xué)，長沙 410125； 4. 湖北省野生植物資源重點實驗室，黃石 435002）

涂膜和熱處理對葡萄能量和貯藏生理及品質(zhì)的影響

張 群1,2，周文化1※，譚 歡2，楊明之3，劉細(xì)霞4

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，長沙 410004； 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長沙 410125；3. 湖南省長沙縣第一中學(xué)，長沙 410125； 4. 湖北省野生植物資源重點實驗室，黃石 435002）

研究不同處理對歐亞種“維多利亞”葡萄組織能量水平和生理品質(zhì)的影響。采后葡萄經(jīng)鈣聯(lián)合涂膜和熱處理，即在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%CaCl2和1%殼聚糖中浸泡20 min，45℃的0.2%CaCl2溶液中浸泡20 min，晾干后(4±0.5)℃貯藏，每10 d測定果實的呼吸強度、褐變指數(shù)（browning index，BI）、腐爛率、硬度、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）的含量，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和超氧化物歧化酶（soperoxide dismutase，SOD）活性變化，以未處理為對照。結(jié)果顯示對照組葡萄組織中能量物質(zhì)處于虧損狀態(tài)，呼吸強度減弱，細(xì)胞膜氧化增加，膜透性、BI、腐爛率增加，PPO、POD和LOX活性增加，SOD降低，果實軟化。鈣聯(lián)合熱和涂膜處理較好維持了果實的能量水平和生理品質(zhì)，且涂膜優(yōu)于熱處理。ATP與硬度、SOD顯著正相關(guān)（r=0.938，0.930，P<0.01），與MDA、膜透性、LOX顯著負(fù)相關(guān)（r=?0.896，?0.932，?0.940，P<0.01）；能荷（energy charge，EC）值與膜透性、LOX負(fù)相關(guān)（P<0.05），與呼吸強度和SOD活性正相關(guān)（P<0.05）。隨貯藏時間的延長，葡萄組織的能量水平處于虧損狀態(tài)，能量水平顯著影響生理品質(zhì)。經(jīng)適當(dāng)?shù)牟珊筇幚砜裳泳從芰刻潛p，涂膜優(yōu)于熱處理。

貯藏；酶；品質(zhì)控制；葡萄；能量水平；涂膜處理；熱處理；生理指標(biāo)

0 引言

葡萄（Vitis vinifera L.）屬漿果類，落葉藤本植物，營養(yǎng)豐富，具有很高的食用價值及醫(yī)療保健價值。葡萄采后在貯藏中極易發(fā)生生理品質(zhì)劣變，如質(zhì)地軟化、褐變、腐爛及霉變等[1]。大量研究表明，園藝作物的衰老褐變和細(xì)胞膜透性的增加可能與能量合成下降而造成的細(xì)胞能量虧缺有關(guān)[2-8]。果實組織細(xì)胞的能量狀態(tài)對保持細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮了重要作用。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物體機體的能量來源，在細(xì)胞代謝中占有重要地位。其中ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）3種能量物質(zhì)所占比例可以反映細(xì)胞的能荷變化，調(diào)節(jié)組織的代謝活動，細(xì)胞組織中許多呼吸代謝關(guān)鍵性酶的活性都依賴于能荷變化的調(diào)節(jié)[3-4]。果實采后的衰老程度與ATP含量和能荷值呈負(fù)相關(guān)性[3,7-8]，如Saquet等研究發(fā)現(xiàn)，梨果實組織能量狀態(tài)在維持細(xì)胞膜的完整性中起重要作用，低ATP含量和低比例的ATP：ADP導(dǎo)致褐變發(fā)生[3-4]。荔枝純氧處理后減少褐變和膜透性，與高含量的ATP和ADP有關(guān)，與AMP含量無關(guān)[7]。采用外源ATP處理可提高荔枝果皮組織的能量水平，從而減輕褐變[5]。通過適當(dāng)?shù)奶幚砜蓽p緩果蔬新陳代謝，減少能量虧損，延緩果蔬衰老和品質(zhì)劣變[6-8]。對葡萄采后處理方法有較多的研究[9-10]，但葡萄貯藏過程中其組織細(xì)胞的能量水平變化及果實組織的能量水平對生理品質(zhì)劣變的影響還未見報道。湖南葡萄產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，但葡萄成熟和采收出現(xiàn)在多雨季節(jié)，不耐貯藏，這可能與葡萄質(zhì)地和品質(zhì)有關(guān)。作者根據(jù)前期的試驗基礎(chǔ)對葡萄采后采用加鈣結(jié)合其他處理進行采后處理，可以較好延長貯藏期。本文研究采用歐亞種“維多利亞”葡萄（Victoria）為研究對象，對其進行鈣聯(lián)合涂膜和熱處理，以未處理為對照，探析貯藏期葡萄組織細(xì)胞能量水平和生理品質(zhì)的變化規(guī)律及相關(guān)性，以期通過調(diào)控能量狀態(tài)來控制采后葡萄果實的生理品質(zhì)、延長果實保鮮期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄（品種為歐亞種“維多利亞”Victoria葡萄），八至九成熟，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～12%，2013 年8月13日采自湖南省澧縣張公廟鎮(zhèn)葡萄園，采前10 d停止施水，采收時間為7:00—9:00，采收無病害、無霉變、無機械損傷的果實，采收后裝入透氣的塑料筐內(nèi)，并于采收當(dāng)日運回中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院進行風(fēng)冷12 h，去除田間熱,于次日進行不同處理。

5′-磷酸腺苷鈉鹽（adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate)：純度大于98.5%；5′-二磷酸腺苷鈉鹽（adenosine 5′-diphosphate sodium salt）：純度大于95%；5′-單磷酸腺苷鈉鹽（adenosine 5′-monophosphate disodium salt）：純度大于99.0%，美國Sigma-Aldrich公司；乙腈：色譜純，美國天地公司；三羥甲基氨基甲烷、考馬斯亮藍(lán)G250和牛血清蛋白：生化試劑，美國Sigma公司；亞油酸鈉、核黃素、氮藍(lán)四唑、愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚：生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣（食品級）；殼聚糖（食品級）；實驗室用水（18 M?）由Millipore Milli QRG超純水系統(tǒng)制備。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司，型號為PDA 2010AT；TPA質(zhì)構(gòu)儀（textural profile analysis）：美國Brookfield公司，型號為CT3；高效冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司，型號為Avanti J-26XP；紫外分光光度計：日本Shimadzu公司，型號為UV7100；電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號為Mettler Toledo AL204；電導(dǎo)率儀：上海雷磁儀器有限公司，型號為DDS-11A；pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號為Mettler Toledo Delta 320。

1.3 方 法

1.3.1 果實采后處理方法

根據(jù)前期的試驗結(jié)果（表1），僅采用涂膜和熱水處理，葡萄的腐爛率高于鈣聯(lián)合涂膜和熱水復(fù)合處理。

對照組（CK）：對果實不做處理。

涂膜處理（coating treatment）：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%殼聚糖和0.2% CaCl2溶液中浸泡20 min，果實全部浸沒，晾干備用。

表1 前期貯藏試驗腐爛率的結(jié)果Table 1 Results of preliminary storage test on decay rate %

熱處理（heat treatment）：于45℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% CaCl2溶液中浸泡20 min，果實全部浸沒，晾干備用。

每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)3個托盤，每個托盤裝果2.5 kg，表面覆上保鮮膜，入(4±0.5)℃冷庫冷藏。

每隔10 d測定葡萄的感官指標(biāo)、生理指標(biāo)以及衰老指標(biāo)，測定周期為40 d。測定呼吸強度時從每個重復(fù)中取1個托盤，即每個處理組合計3個托盤取果進行測定。能量物質(zhì)、丙二醛和相關(guān)酶活測定從每個重復(fù)中取1個托盤，即每個處理組合計3個托盤葡萄果粒全部液氮粉碎后放于?70℃冰箱內(nèi)保存，取樣進行測定。硬度、褐變指數(shù)、腐爛率、細(xì)胞膜透性測定是從每個重復(fù)中取一個托盤，合計3個托盤的果進行測定。

1.3.2 測定指標(biāo)與方法

呼吸強度：采用靜置法。從每個重復(fù)中取1個托盤，即每個處理組合計3個托盤，在葡萄果穗的不同部位剪取小串葡萄，質(zhì)量約1 kg葡萄置于6 L密閉的干燥器中，干燥器底部放入0.2 mol/L NaOH作為CO2的吸收劑，貯藏溫度下放置5 h，用0.2 mol/L的草酸滴定。結(jié)果以mg/(kg·h)表示。

腐爛率的測定：從每個重復(fù)中取1個托盤，每個處理3個托盤中葡萄作為樣品，每10 d對貯藏葡萄進行質(zhì)量測定，分別測定腐爛果的質(zhì)量，并按下式進行計算：

褐變指數(shù)（browning index，BI）：參照趙穎穎等的方法[11]，稍有修改。隨機取40粒葡萄果粒，按褐變面積占果皮總面積的比例將果皮褐變程度分為4級，分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，無褐變；1級，褐變面積≤25%（輕微褐變）；2級，25%<褐變面積≤50%；3級，50%<褐變面積≤75%；4級，褐變面積>75%。計算公式為

硬度測定：將保留果梗的葡萄試樣橫放于質(zhì)構(gòu)儀夾具正下方進行硬度測試，選用的夾具直徑為50.8 mm，長20 mm的圓柱形探頭TA25/1 000。經(jīng)預(yù)試驗選取合適的測試參數(shù)：目標(biāo)類型為TPA試驗，距離4 mm，觸發(fā)點負(fù)載50N，測試速度0.5 mm/s，循環(huán)2次。由質(zhì)地特征曲線得到表征果實質(zhì)地狀況的力學(xué)參數(shù)，其中硬度以雙峰曲線中第1個峰的最大值表示，單位為N。每次取20粒果實，分別在果實的對角線取2個點，進行測定，取平均值。測試溫度：室溫(18～20)℃。

細(xì)胞膜透性的測定：參照Liu等的方法[12]，稍有修改。隨機取30粒葡萄，用打孔器取30片葡萄果肉圓片（直徑10 mm）。用去離子水洗3次，每次1 min，放入50 mL容量瓶中，且加水到刻度，靜置20min，用電導(dǎo)儀測定初始電導(dǎo)值。煮沸20 min后，補齊蒸發(fā)掉的蒸餾水，冷卻至室溫后再測總電導(dǎo)值，以前后2次電導(dǎo)值之比所得的相對電導(dǎo)率(%)來表示細(xì)胞膜透性的大小。

能量物質(zhì)：參照Liu等[13]方法，略做調(diào)整。取葡萄果肉組織(2 g)（?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的樣品）用液氮研磨后加入10 mL 0.6 mol/L高氯酸冰浴研磨后，提取1 min，16 000×g冷凍（4℃）離心15 min，取5 mL上清液迅速用1.0 mol/L KOH 中和至pH6.5～6.8，冰浴中穩(wěn)定30 min使高氯酸沉淀，之后經(jīng)8 000×g冷凍（4℃）離心5 min，取上清液定容至5 mL，并過0.45 μm微孔濾膜過濾。按Liu等[13]的HPLC法測定ATP、ADP和AMP的含量，色譜條件為 Shimadzu C18反相柱（柱長250 mm，色譜柱內(nèi)徑為4.6 mm，填充物顆粒直徑為5.0 μm）（250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，檢測波長254 nm，流動相pH值為7.0的20 mmol/L磷酸氫二鉀緩沖溶液（A），60%乙腈（B）相，A與B體積比為4∶6，柱溫30℃，流速0.8 mL/min；進樣體積20 μL。定量方法采用外標(biāo)法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間和峰面積進行定性定量[13]，

式中[ATP]，[ADP]，[AMP] 表示果肉組織中的三種能量物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/g。樣品測定結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）的測定：參照Duan等方法[14]稍有修改。5 g（?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的樣品）葡萄果肉組織加25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的三氯乙酸（TCA），冰浴研磨，27 000×g冷凍（4℃）離心10 min，上清液用10%的TCA定容到10 mL。取1 mL上清液加2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%硫代巴比妥酸（TBA）（TBA配制時用10%三氯乙酸定容），混合，沸水浴中煮沸20 min，冷卻至室溫后再次離心，分別測定上清液在450，532和600 nm波長處的吸光度。

式中v為提取液的總體積，mL；Vs為測定所用提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；OD值分別為不同波長下的吸光度。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的測定：參照Liu等的方法[12]稍有修改。取果肉組織5 g（?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的的樣品），加25 mL 100 mmol/L，pH值8.0 Tris-HCl 磷酸緩沖液，冰浴研磨，27 000×g冷凍（4℃）離心10 min，取上清液用于LOX酶活的測定。反應(yīng)液包括2.85 mL pH值6.0 100 mmol/L磷酸鈉緩沖液，50μL 10 mmol/L亞油酸鈉和0.1 mL酶液，空白為2.95 mL pH 值6.0，100 mmol/L磷酸鈉緩沖液和50 μL 10 mmol/L亞油酸鈉，30℃反應(yīng)，在234 nm下測定吸光度。酶活以U/mg表示，其中以每分鐘234 nm下吸光度增加0.001為一個單位。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)）活性的測定：參照Duan等[14]的方法略做修改。果肉組織5 g（?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的的樣品），加入20 mL 50 mmol/L（pH值7.0）的磷酸鈉緩沖液（內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvingypyrrolidone，PVPP）和適量石英砂，冰浴研磨，15 000×g冷凍（4℃）離心20 min，取上清液用于SOD活性氧清除酶活性測定。2.5 mL反應(yīng)液中包含1.5 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.3 mL 10 μmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），0.3 mL 13 mmol/L 核黃素，0.3 mL75 μmol/L氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium, NBT），0.1 mL酶液，空白則以緩沖液代替酶液。反應(yīng)液在光照4 000 lx下進行10 min的光照反應(yīng)，然后用黑暗終止反應(yīng)，立即在560 nm波長下測定吸光度。一個酶活單位為相當(dāng)于引起2.5 mL反應(yīng)液達(dá)到抑制50%所需的酶量。酶活以U/mg表示。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定：酶液提取方法參考李桂峰等[15]。稱取2 g葡萄果肉組織（?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的的樣品），加入10 mL 50 mmol/L pH 值5.5的磷酸鈉緩沖液中，冰浴研磨，15 000×g 冷凍（4℃）離心20 min，取上清液用于過氧化物酶（POD）活性測定。酶活性測定采用愈創(chuàng)木酚法：取一支試管，加入3.0 mL 25 mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液和0.5 mL酶提取液，再加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的H2O2溶液迅速混合啟動反應(yīng)，同時開始計時。將反應(yīng)混合液倒入比色杯中，以蒸餾水為參比，在反應(yīng)30 s 時測其在波長460 nm處的吸光值，并每間隔1 min記錄1次，連續(xù)測定，至少獲得6個點的數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。酶活以U/mg表示，其中以每毫克蛋白質(zhì)在460 nm下每分鐘吸光度增加0.01為一個單位。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的測定：取?70℃冰箱內(nèi)液氮粉碎的的樣品，酶液提取方法同POD提取法。酶活測定采用鄰苯二酚法[15]：取1支試管，加入1.5 mL 50 mmol/L、pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，最后加入1 mL酶提取液，以緩沖液為參比，同時開始計時。在反應(yīng)30 s 時測其在波長398 nm處的吸光值，并每間隔30 s記錄1次，連續(xù)測定，至少獲得5個點的數(shù)據(jù)，重復(fù)3次，酶活以U/mg表示，其中以每分鐘每毫克蛋白質(zhì)在398 nm下吸光度增加0.001為一個單位。

蛋白質(zhì)含量測定：參照考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以上各指標(biāo)測定均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

所有圖表繪制采用Sigmaplot 12.5 和 Excel 2003軟件進行處理；利用SPSS 16.0軟件進行相關(guān)性和ANOVA分析，置信概率為0.95，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂膜和熱處理對葡萄果實貯藏期間能量指標(biāo)的影響

采收時葡萄果肉組織有高水平的ATP、ADP含量和能荷（EC）值（圖1a、b、d），相對低水平的AMP含量（圖1c），這與Duan等對荔枝能量物質(zhì)的研究結(jié)果一致[7]。隨貯藏期的延長，葡萄果肉組織中的ATP、ADP含量和EC值總體下降，在梨和荔枝貯藏過程中也有同樣的結(jié)果[7,12]。

圖1 不同貯藏時間葡萄果實中ATP、ADP、AMP和EC的變化Fig.1 Changes of ATP, ADP, AMP contents and EC of grape fruits at different storage time

在貯藏初期（0～10 d），ATP、ADP含量和EC值下降（圖1a、b、d），AMP含量上升（圖1c）。貯至20 d，各組ATP、ADP和AMP含量快速下降。貯藏20～30 d時，涂膜和熱處理組ATP含量緩慢下降。在整個貯藏期間，對照組與涂膜和熱處理間葡萄組織中ATP含量呈顯著性差異（P<0.05），涂膜與熱處理組ATP含量緩慢下降，但涂膜組ATP含量高于熱處理組。涂膜和熱處理中ADP含量的變化與ATP含量變化類似。貯藏40 d后，涂膜組的葡萄組織ATP為1.84 μg/g，熱處理組1.17 μg/g，對照組為0.65 μg/g（圖1a）。涂膜組中ADP 為2.37 μg/g，熱處理組為1.85 μg/g，對照組為0.30 μg/g（圖1b），涂膜比熱處理能更好的延緩ATP和ADP含量的下降。

葡萄果肉組織中AMP含量在10 d內(nèi)增加，然后呈現(xiàn)下降趨勢。貯至20 d時，葡萄組織呈高水平AMP含量，不同組間呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05），隨后出現(xiàn)下降。貯至30 d時，AMP含量快速下降，并呈現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。在貯藏中后期（10 d后），涂膜和熱處理的葡萄組織中AMP含量要高于對照組，尤其是涂膜組AMP含量最高，最低為對照組。貯藏末期，涂膜組AMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.35 μg/g，熱處理組為0.64 μg/g，對照組為0.56 μg/g（圖1c），在涂膜和熱處理間AMP含量有顯著性差異（P<0.05），但空白與熱處理組間無顯著性差異（P>0.05）。涂膜比熱處理可以更好延緩AMP含量的下降。

采收時葡萄的EC值為0.68。在貯藏期間，不同組葡萄組織中EC值總體呈下降趨勢，貯藏末期EC值低于貯藏初始值。貯藏從10～30 d，能荷EC值有小幅的上升。在整個貯藏期間，能荷EC值的變化為0.49～0.68。在貯藏末期，EC緩慢下降，能荷水平為熱處理組（0.57）＞涂膜組（0.54）＞對照組（0.53）（圖1d）。對照組EC值最低，但涂膜與對照間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 涂膜和熱處理對葡萄果實貯藏期間硬度的影響

葡萄果肉質(zhì)地隨貯期延長逐漸出現(xiàn)軟化，嚴(yán)重影響食用品質(zhì)。由圖2可知，在貯藏期間葡萄果實硬度隨貯藏時間的延長呈顯著性下降（P<0.05），與張昆明等[16]對不同保鮮膜包裝的葡萄進行TPA測試結(jié)果一致。

圖2 不同貯藏時間葡萄果實硬度的變化Fig.2 Changes of hardness of grape fruits at different storage time

圖2顯示葡萄果實經(jīng)不同處理后硬度有所改變，對照組的初始硬度值為（10.63±1.06）N，經(jīng)涂膜和熱處理后，硬度值變?yōu)椋?1.72±1.17）N，（9.18 ±0.91）N，其中涂膜后硬度值最大，熱處理比對照低，熱處理組的初始硬度最低，這與Wu等[10]的研究結(jié)果相同，熱處理降低了葡萄的初始硬度。在貯藏初期（貯至10 d），對照、涂膜處理和熱處理硬度顯著下降（P<0.05），下降幅度分別為30%、23%和10%，對照下降最明顯，其次為涂膜和熱處理。在貯藏后期，下降幅度有所減緩。貯至40 d，對照組大多數(shù)葡萄已經(jīng)腐爛不能進行下一步試驗。在整個貯藏期間，涂膜處理的葡萄果實硬度高于熱處理和對照組，這說明涂膜能夠延緩葡萄果實的軟化。葡萄采后果肉軟化一般認(rèn)為是果膠物質(zhì)和細(xì)胞壁降解所致，與能量物質(zhì)的關(guān)系鮮見報道。涂膜處理可減緩能量水平ATP、ADP和AMP的下降。相關(guān)分析結(jié)果表明，葡萄硬度（y）與能量ATP水平（x）呈極顯著正相關(guān)（y=72.420x+434.033，R=0.938，P<0.01）。不同處理如何維持高水平的能量及保持葡萄硬度的機理，尤其是降解變化規(guī)律待進一步研究。

2.3 涂膜和熱處理對葡萄果實貯藏期間膜滲透性和丙二醛（MDA）含量的影響

隨貯藏時間的延長，葡萄果實膜滲透性逐漸增加（圖3a），與荔枝貯藏結(jié)果一致[12]。對照組的膜滲透性在貯藏10，20，30 d后分別為37.93%, 46.20%和56.25%，涂膜和熱處理顯著（P<0.05）抑制了膜滲透性的上升[9-10]，保持了細(xì)胞膜良好的完整性。

從圖3b可以看出，葡萄果實組織過氧化物MDA含量隨貯藏時間的延長而增加，這與荔枝組織MDA含量隨著貯藏時間的延長而顯著增大結(jié)果一致[14]。在整個貯藏期間，對照組和處理組葡萄組織中MDA含量均快速增加。在貯藏末期，涂膜組MDA含量要顯著低于熱處理組和對照組（P<0.05），對照和熱處理間葡萄組織的MDA含量沒有顯著性差異（P>0.05）。涂膜抑制了果實中MDA含量的上升，抑制膜脂過氧化作用，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。在貯藏中后期，對照組能量物質(zhì)低于涂膜和熱處理組（圖1a、b、c）。ATP參與了脂質(zhì)的合成和脂肪鏈的去飽和影響膜的理化性質(zhì)，有利于保持果實細(xì)胞膜的完整性，延緩衰老。高能量水平可減緩膜透性和過氧化物MDA含量的升高，抑制膜水解酶的活性，減緩膜脂質(zhì)的過氧化，維持膜的完整性[5,14]。這些效應(yīng)的發(fā)揮可能是涂膜和熱處理有利于維持果實組織較高的能量水平。相關(guān)分析結(jié)果表明，葡萄膜透性（y）與能量水平ATP（x）呈極顯著負(fù)相關(guān)（y=?3.837x+54.048，R=0.932，P<0.01）；葡萄MDA含量（y）與能量水平ATP（x）呈負(fù)相關(guān)（y=?6.542x+ 61.441，R=0.896，P<0.01）。

圖3 不同貯藏時間葡萄果實膜透性和MDA的變化Fig.3 Changes of membrane permeability and MDA content in grape fruits at different storage time

2.4 涂膜和熱處理對葡萄果實呼吸強度的影響

葡萄果實的呼吸強度隨貯藏時間的延長而下降（圖4），沒有出現(xiàn)呼吸高峰，與梁麗雅的研究結(jié)果一致[18]。在整個貯藏期間，涂膜和熱處理的呼吸強度均低于對照組，大小依次為對照組＞熱處理組＞涂膜組。涂膜組呼吸強度顯著低于對照組和熱處理組（P<0.05），對照組和熱處理組則差異不顯著（P>0.05）。呼吸強度越大，果實的營養(yǎng)物質(zhì)消耗越快，果實衰老加速，貯藏壽命縮短。呼吸作用增加不利于較低溫度下長時間貯藏果蔬，涂膜和熱處理通過抑制呼吸強度而實現(xiàn)延長貯藏期的目的。涂膜后在果實表面形成一層膜，內(nèi)部自成一個微小的氣調(diào)環(huán)境，減緩呼吸損耗，維持優(yōu)良品質(zhì)[9]；熱水處理可減緩呼吸代謝和乙烯的生成，減緩果膠降解，增加抗氧化能力[10]。能量由呼吸作用產(chǎn)生，能量的生成速率和效率決定于呼吸強度和各種呼吸途徑的實際運行量[2]。能量水平與呼吸活性密切相關(guān)，參與采后衰老和品質(zhì)變化[2]。常溫下呼吸作用加強有利于物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，Duan等[7]認(rèn)為荔枝純氧處理后呼吸作用加強，ATP含量和能荷水平較高，有利于保持膜的完整性，延緩了荔枝果皮的褐變。在本研究中發(fā)現(xiàn)呼吸強度下降（圖4），ATP、ADP含量也下降（圖1a、b），顯示出一定的正相關(guān)性。相關(guān)分析結(jié)果表明，葡萄呼吸強度（y）與能量水平ATP（x）正相關(guān)（y=0.680x+1.364，R=0.881，P<0.01）。

圖4 不同貯藏時間葡萄果實呼吸強度的變化Fig.4 Changes of respiratory of grape fruits at different storage time

2.5 涂膜和熱處理對葡萄果實貯藏期間褐變指數(shù)（BI）和腐爛率的影響

隨貯藏時間的延長，葡萄果皮BI快速增加，與荔枝貯藏結(jié)果一致[7]。在整個貯藏期間，對照組的BI高于涂膜和熱處理組，涂膜和熱處理緩解葡萄果皮褐變的發(fā)生，且三組間葡萄果皮的BI呈顯著性差異（P<0.05）。貯至10 d時，涂膜和熱處理組葡萄未出現(xiàn)果皮褐變，但對照組葡萄果皮的BI為1.27%；貯至20 d時，對照組BI達(dá)一個高水平（13.2%），涂膜和熱處理組的BI分別為4.98% 和10.86%，涂膜可明顯抑制褐變；貯至30 d時，對照組的BI為29.97%，但涂膜和熱處理組分別為16.68%和24.83%。結(jié)果顯示涂膜和熱處理可抑制褐變的發(fā)生，且涂膜效果優(yōu)于熱處理。Qu等[8]在對荔枝研究中發(fā)現(xiàn)ATP含量與BI負(fù)相關(guān)，蘋果和梨發(fā)生褐變是由于ATP供應(yīng)不足，低比例的ATP：ADP，低EC[3]，高能荷可減少梨的生理失控和褐變[4]。對照組能量物質(zhì)下降趨勢比涂膜和熱處理組明顯（P<0.05），且含量處于低水平，褐變嚴(yán)重，與Saquet對梨的研究結(jié)果相同[4]。涂膜和熱處理的能量物質(zhì)ATP含量高于對照組（P<0.05），涂膜組高于熱處理組（P<0.05），BI與ATP含量顯示出負(fù)相關(guān)。ATP含量高，維持細(xì)胞的區(qū)室化結(jié)構(gòu)，降低酶與底物接觸氧化的幾率。

隨貯藏時間的延長，葡萄腐爛率呈上升趨勢。涂膜和熱處理組葡萄貯至20 d前未發(fā)現(xiàn)腐爛，但對照組則出現(xiàn)了12.3%的腐爛率，這可能是涂膜和熱處理增加了果皮和果肉中抗真菌基因的表達(dá)誘導(dǎo)和激活耐腐機制，抑制葡萄果實表面微生物的生長繁殖[9-10]。但貯至30 d時，涂膜和熱處理組腐爛率分別達(dá)10.8%和16.9%，對照組達(dá)34.6%，是處理組的2倍多。貯至40 d時，各組的腐爛率均快速上升，對照組達(dá)71.5%，且大多葡萄已不能食用；涂膜組達(dá)39.23%，熱處理組達(dá)49.24%，熱處理組比涂膜組高約10%。貯藏至30d時，不同組間腐爛率差異顯著性（P<0.05）。貯藏末期，對照組與處理組間差異顯著（P<0.05），但涂膜和熱處理間差異不顯著（P>0.05）。涂膜組的延遲效果要高于熱處理組，可能熱處理后葡萄果實的起始硬度下降，加速果實的軟化和腐爛。在能量物質(zhì)方面，涂膜組的ATP、ADP含量比熱處理組要高，能量物質(zhì)水平高，腐爛率低，部分原因可能是由于經(jīng)過處理后葡萄果實中碳水化合物代謝的酶活增加，加強了能量物質(zhì)的供應(yīng)[10]。

圖5 不同貯藏時間葡萄果實的BI和腐爛率的變化Fig.5 Changes of BI and decay percentage of grape fruits at different storage time

2.6 涂膜和熱處理對葡萄果實貯藏期間酶活性的影響

圖6a中顯示，各組葡萄果肉組織的LOX活性均呈上升趨勢，番茄、獼猴桃、草莓和辣椒等在后熟衰老中LOX活性也逐漸上升[19]。本研究中LOX活性的大小依次為對照＞熱處理＞涂膜。在貯藏期間LOX活性上升，對照組的LOX活性高于涂膜和熱處理組。貯藏初期和末期，對照組與處理組間LOX活性有顯著性差異（P<0.05），但涂膜和熱處理間差異不顯著（P>0.05）。在貯藏中期（20-～30 d），三組LOX活性差異不顯著（P>0.05）。涂膜和熱處理可保持果實較高的能量水平，延緩膜脂過氧化進程，緩解LOX活性的增加，減緩衰老。葡萄能量短缺，LOX活性增加，引發(fā)膜完整性破壞，細(xì)胞間隔消失，加速褐變和品質(zhì)劣變[14]。

圖6b表明，在整個貯藏期間，葡萄果肉組織活性氧清除酶SOD活性均呈現(xiàn)下降，與Meng等[9]的研究結(jié)果一致。貯至10 d時，處理組的SOD活性比對照組要高，貯至30 d時處理組仍維持相對高的SOD活性，貯藏10～30 d期間，三組間SOD活性差異顯著（P<0.05）。在貯藏末期，涂膜組SOD活性顯著高于熱處理和對照組（P<0.05），但對照和熱處理組間差異不顯著（P>0.05）。涂膜和熱處理組能保持較高的SOD活性，減緩SOD活性降低[9-10]，保持細(xì)胞內(nèi)有較高的活性氧清除能力，減少活性氧積累，減輕膜脂過氧化作用，保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，涂膜組的SOD活性高于熱處理組（P<0.05）。

圖6 不同貯藏時間下葡萄組織的LOX、SOD、PPO和POD酶活的變化Fig.6 Changes of activities of LOX, SOD, PPO, POD in grape fruits at different storage time

圖6c表明，對照組葡萄PPO活性在貯藏0～20 d內(nèi)顯著升高（P<0.05），貯藏20 d時PPO酶活性達(dá)到高峰；貯藏中后期呈下降趨勢，貯至40 d時PPO活性仍比貯藏初始高，但比涂膜和熱處理組貯藏40 d時低。涂膜和熱處理組葡萄PPO活性在貯藏20 d內(nèi)無明顯變化，在貯至30 d時涂膜組PPO活性達(dá)高峰，然后下降，但熱處理組PPO活性在貯藏期內(nèi)一直呈上升趨勢。貯藏初期（10～20 d），對照組PPO活性顯著高于處理組（P<0.05），但涂膜和熱處理間差異不顯著（P>0.05）。貯藏后期，三者PPO活性差異不顯著（P>0.05）。涂膜和熱處理可推遲高峰的出現(xiàn)，且峰值比對照組低，對照組PPO活性出現(xiàn)高峰后急劇下降。在貯藏末期，PPO活性大小依次為熱處理組＞涂膜組＞對照組，且各組PPO活性均高于初始值。正常細(xì)胞中PPO酶與酚類底物區(qū)室化分布，但當(dāng)果實衰老，膜透性增加，區(qū)室化分布破壞，PPO酶游離出來，易與酚類物質(zhì)接觸發(fā)生氧化，導(dǎo)致褐變的發(fā)生[12]。涂膜和熱處理延緩膜氧化，延緩區(qū)室分布的破壞，延緩PPO活性峰值的出現(xiàn)。隨貯藏期延長，衰老不可避免，PPO活性高于初始值。

POD活性變化與PPO不同。圖6d表明，各組葡萄POD活性隨著貯藏時間的延長而持續(xù)上升。京亞葡萄常溫貯藏過程中，POD活性不斷升高[20]?？赡苁荘OD在衰老過程中一方面起清除H2O2的作用，另一方面參與活性氧的生成和膜脂過氧化作用。本研究中葡萄果實中的POD活性不斷上升，果實衰老加重，膜透性增加。涂膜和熱處理的葡萄組織中POD活性與對照組無顯著差異（P>0.05）。貯藏末期，POD活性大小依次為對照組＞熱處理組＞涂膜組。涂膜可抑制荔枝褐變，減少腐敗，延緩PPO和POD活性的增加，涂膜可抑制葡萄PPO、POD活性的增加[9,15]。

2.7 能量水平與主要生理品質(zhì)劣變指標(biāo)及酶活性之間的相關(guān)性分析

從表2看出，能量物質(zhì)ATP與硬度極顯著正相關(guān)（R=0.938，P<0.01）。能量水平高，有利于保持細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，延緩果實的軟化。

表2 能量水平與主要生理品質(zhì)劣變指標(biāo)間的皮爾遜相關(guān)性分析（n=14）Table 2 Pearson correlation analysis among energy levels and main physiological indicators of quality deterioration (n=14)

ATP含量與膜透性、MDA含量和LOX活性極顯著負(fù)相關(guān)（R=?0.932，?0.896，?0.940，P<0.01），ATP含量下降破壞了細(xì)胞膜的完整性，膜脂氧化加劇，細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞間區(qū)室化破壞，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，PPO、POD游離出來，底物與酶接觸氧化產(chǎn)生褐變[3-4]，BI升高，與采后梨、龍眼和荔枝等果實ATP含量影響褐變和膜透性結(jié)果一致[2,5-6]。能量物質(zhì)下降，LOX酶活增加，膜脂過氧化物（ROOH）、H2O2和自由基的積累增多，脂質(zhì)過氧化物MDA增加，細(xì)胞膜透性增大，膜的完整性顯著下降。細(xì)胞膜透性增加和膜脂過氧化作用損害線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，破壞線粒體膜的完整性，膜的破壞使酶無法存在，功能隨之喪失，細(xì)胞合成ATP能力受損，ATP酶活性降低[21]。高水平的ATP含量可延緩梨褐變，保持低滲透性，維持膜的完整性[3-5,14]，與本文結(jié)果一致。

ATP含量與呼吸強度正相關(guān)（R=0.881，P<0.01），這與劉亭等對荔枝呼吸活性和能量代謝的研究報道一致[2]。Saquet等也發(fā)現(xiàn)梨呼吸活性高，能量水平高[4]。園藝作物采后氣調(diào)和低溫貯藏保鮮很大程度上是通過抑制呼吸強度而發(fā)揮作用的。本研究中涂膜和熱處理通過抑制呼吸作用延長貯藏期，且涂膜組的呼吸強度最低，其次是熱處理組，對照組呼吸強度最高。但在同一貯藏時間上，涂膜組的能量水平最高，可能是涂膜組不僅抑制了呼吸強度，而且更大程度延緩了能量物質(zhì)的下降，維持采后的高能量水平。

ATP的生產(chǎn)與活性氧清除酶的誘導(dǎo)有關(guān)[14]，ATP含量與SOD極顯著正相關(guān)（R=0.930，P<0.01），SOD酶是自由基去除酶，需要消耗能量，可提供的能量物質(zhì)高，去氧能力強。

3 結(jié)論

1）采后葡萄果實隨貯藏時間的延長，組織細(xì)胞的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷、能荷值總體下降，能量水平出現(xiàn)虧損，呼吸強度減弱，脂氧合酶活性增加、超氧化物歧化酶活性下降，抗氧化能力下降，細(xì)胞膜脂過氧化作用加強；細(xì)胞膜透性增大，丙二醛含量上升、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性破壞，多酚氧化酶、過氧化物酶在細(xì)胞中的區(qū)室化分布結(jié)構(gòu)被破壞，褐變指數(shù)增加，腐爛率升高，硬度下降。

2）鈣聯(lián)合涂膜和熱處理維持了較高的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷含量及能荷水平，延緩多酚氧化酶活性峰值的出現(xiàn)，抑制丙二醛的積累和細(xì)胞膜透性的增加，延緩超氧化物歧化酶活性降低，保持細(xì)胞內(nèi)較高的活性氧清除能力，減少活性氧積累，減輕膜脂過氧化作用，保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制葡萄果皮褐變，減輕腐敗。

3）在貯藏中后期，涂膜組的三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷含量比熱處理高（P＜0.05），涂膜組的超氧化物歧化酶顯著高于熱處理組（P＜0.05），褐變指數(shù)顯著低于熱處理組（P＜0.05）。呼吸強度、腐爛率、脂氧合酶、膜透性、丙二醛含量和過氧化物酶酶活比熱處理低，但差異不顯著（P＞0.05）。涂膜處理組葡萄品質(zhì)優(yōu)于熱處理組。涂膜處理減緩了呼吸損耗，維持較高的能量水平，抑制脂氧合酶的活性，減緩膜透性和過氧化物丙二醛含量的升高，維持膜的完整性，減緩褐變。

4）能量物質(zhì)三磷酸腺苷與硬度、超氧化物歧化酶活性極顯著正相關(guān)（R=0.938，0.930，P＜0.01）。能量水平高，有利于保持細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，延緩果實的軟化；保持細(xì)胞內(nèi)較高的活性氧清除能力，減少活性氧積累，減輕膜脂過氧化作用。三磷酸腺苷與丙二醛，膜透性，脂氧合酶活性極顯著負(fù)相關(guān)（R=?0.896，-0.932，-0.940，P＜0.01）。在葡萄貯藏中，維持高水平的三磷酸腺苷可維持細(xì)胞膜的完整性，減緩膜脂過氧化，減緩膜透性增加，減緩因細(xì)胞膜破壞引起的系列生理品質(zhì)劣變。

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Effects of coating and heat treatments on energy levels and physiological indexes and qualities of grape fruits during storage

Zhang Qun1,2, Zhou Wenhua1※, Tan Huan2, Yang Mingzhi3, Liu Xixia4
(1. Food Science and Engineering, Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha, 410004, China; 2. Hunan Agricultural Sciences Academy of Agricultural Products Processing Institute, Changsha, 410125, China; 3. Changsha County First Senior High School in Hunan Province, Changsha, 410125, China; 4. Key Laboratory of Wild Plant Resources in Hubei Province, Huangshi, 435002, China)

Harvested grape fruit tissues are still alive. Grape fruit tissues still have metabolism including physiological and biochemical reactions. They are prone to physiological deterioration, such as texture softening, browning, decay and mildew. More and more studies have indicated that senescence and cell membrane permeability of horticultural crops may be related to energy deficit caused by the decline of energy synthesis. Changes of energy levels in grape fruit tissues during storage have not been reported. Effects of energy level on physiological quality of grape fruit tissues after coating and heat treatment with Ca2+are not clear. In this paper, the effects of coating and heat treatments with Ca2+on post-harvest energy levels and physiological deterioration of “Victoria” grape fruit during cold storage were explored through determining energy levels and physiological indices. Coating and heat treatments with Ca2+were applied to post-harvest grape fruits (compared with untreated grape fruits, i.e. the CK treatment). Grape fruits after coating and heat treatments with Ca2+were stored at (4±0.5) ℃. Respiratory rate, browning index, decay rate, hardness, contents of malondialdehyde (MDA), adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP) and adenosine monophosphate (AMP), energy charge (EC), and enzyme activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), lipoxygenase (LOX) and soperoxide dismutase (SOD) of grape fruits were tested every 10 days. Results showed that with the extension of storage time, energy levels were in a loss state for grape fruit tissue under the CK. Respiratory rate decreased, but cell membrane oxidation and permeability increased. Browning index and decay rate increased, and enzyme activities of POD, PPO and LOX increased too, but enzyme activities of SOD were decreased. Physiological qualities of grape fruits decreased, and fruits were softened. Calcium combined with heat and coating treatment reduced the loss of grape fruits by rotting during storage. In addition, treatment of heat and coating with Ca2+could maintain higher energy status, energy charge, hardness and enzyme activities of SOD to keep qualities of grape fruit, delay grape fruit softening, inhibit respiratory intensity and accumulation of membrane lipid peroxidation, slow down growth of cell membrane permeability, decrease MDA content, inhibit enzyme activities of POD, PPO and LOX, and delay browning and rotting, aging process and physiological quality deterioration of grape fruits. But coating treatment was better than heat treatment. ATP was significantly positive correlation with hardness and SOD enzyme activity (r=0.938，0.930, P<0.01), but negative correlation with MDA membrane permeability and LOX enzyme activity (r=-0.896，-0.932，-0.940, P<0.01). EC was negative correlation with membrane permeability and LOX enzyme activity (P<0.05), but positive correlation with respiration intensity and SOD enzyme activity (P<0.05). Browning of grape fruits was closely related to membrane lipid peroxidation and membrane structure (the integrity of membrane structure was destroyed). PPO and POD were reacted with phenolic substrates to form brown pigment. Results showed that with the extension of storage time, energy levels of grape fruits were in a loss state. Fall of energy level significantly affected oxidation and integrity of cell membrane. Coating and heat treatments with Ca2+could maintain higher energy levels of ATP and ADP, and EC, which could slow down aging and physiological quality deterioration of grape fruit tissues. Coating and heat treatments with Ca2+may maintain high energy status and physiological qualities, and slow down aging and physiological quality deterioration of grape fruits tissues. Effects of coating treatment with Ca2+were better than heat treatment with Ca2+. Slowing down physiological deterioration of grape fruits can be realized by maintaining high energy status and preventing development of physiological deterioration.

storage; enzymes; quality control; grape fruit; energy levels; coating treatment; heat treatment; physiological index

10.11975/j.issn.1002-6819.2016.09.036

S662.1

A

1002-6819(2016)-09-0255-09

張 群，周文化，譚 歡，楊明之，劉細(xì)霞. 涂膜和熱處理對葡萄能量和貯藏生理及品質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2016，32(9)：255－263.

10.11975/j.issn.1002-6819.2016.09.036 http://www.tcsae.org

Zhang Qun, Zhou Wenhua, Tan Huan, Yang Mingzhi, Liu Xixia. Effects of coating and heat treatments on energy levels and physiological indexes and qualities of grape fruits during storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(9): 255－263. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.09.036 http://www.tcsae.org

2015-12-29

2016-03-24

湖南省重點科技專項（No.2015NK3027），名稱為《鮮食型提子葡萄品質(zhì)劣變機理及其調(diào)控的研究》。

張 群，女，湖南常德人，博士生，湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所研究員，主要從事果蔬貯藏與加工的科研工作。長沙 中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，410004。Email：zqun208@163.com.

※通信作者：周文化，男，湖南常德人，中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏的科研和教學(xué)工作。長沙 中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，410004。Email：13786129879@126.com.