INA抑制香蕉果實(shí)中活性氧積累和衰老進(jìn)程提高果實(shí)的抗病性

張雪蓮，黃雪梅，張 燦，張昭其，龐學(xué)群

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

INA抑制香蕉果實(shí)中活性氧積累和衰老進(jìn)程提高果實(shí)的抗病性

張雪蓮1，黃雪梅2，張 燦2，張昭其2，龐學(xué)群1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

探討了香蕉貯藏期間INA處理對廣東果實(shí)抗病性的影響及影響機(jī)制。結(jié)果表明：香蕉果實(shí)在INA處理后接種炭疽病菌孢子，貯藏15 d 后，INA 處理的果實(shí)病斑直徑比對照果實(shí)明顯減小，INA處理的MDA含量顯著低于對照，表明INA處理能夠延緩果實(shí)的衰老；INA處理果實(shí)的H2O2含量從貯藏8 d開始明顯低于對照，而NADPH 氧化酶活性則在貯藏10 d開始高于對照；在整個貯藏期間，INA處理的CAT活性均明顯低于對照，抗壞血酸氧化酶活性則明顯高于對照。在貯藏后期，INA促進(jìn)APX 基因的表達(dá)，卻抑制了CAT和后熟相關(guān)基因P450的表達(dá)上調(diào)。說明在貯藏期間INA 主要通過促進(jìn)防御酶APX基因和酶活力抑制后期果實(shí)活性氧含量的增加，以誘導(dǎo)香蕉果實(shí)抗病性的增加。

INA處理；抗病性；活性氧；APX；P450

采后香蕉病害主要是由于炭疽病菌的潛伏侵染導(dǎo)致，通常在貯藏期導(dǎo)致果實(shí)嚴(yán)重腐爛，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。目前在生產(chǎn)上主要通過化學(xué)殺菌劑來抑制采后香蕉病害，由于其潛伏侵染的特性，化學(xué)殺菌劑控制香蕉采后病害的效果不太理想，不得不加大使用量。但是過多使用化學(xué)殺菌劑易造成毒性殘留和病原菌的抗藥性，極大限制了化學(xué)殺菌劑在果蔬生產(chǎn)上的廣泛使用［1］。因此，探討安全有效的果蔬采后病害控制技術(shù)受到人們的廣泛重視。近年來，誘抗劑在控制果蔬采后病害中的應(yīng)用逐漸得到重視，尤其是潛伏侵染病害。利用生物源或者非生物源的因子誘導(dǎo)果蔬自身抗病能力的提高，為果蔬采后病害的防治以及貯藏品質(zhì)的保持開辟了一條安全環(huán)保的途徑［1-2］。

目前，化學(xué)誘抗劑如水楊酸（SA）、苯并噻二唑（BTH）、茉莉酸類（JAs）、赤霉素和乙烯等因具有廣譜、有效的優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［3］。例如，晏衛(wèi)紅等［4］在芒果掛果期利用草酸和SA處理果實(shí)，結(jié)果顯示草酸和SA能顯著提高采后果實(shí)在貯藏期間對蒂腐病和炭疽病的抗性。此外，乙烯通過誘導(dǎo)植物組織內(nèi)防御相關(guān)酶的活力來促進(jìn)內(nèi)源植保素等抗菌物質(zhì)的大量合成，從而達(dá)到提高植物抗性的目的［5］。這些研究也發(fā)現(xiàn)，使用外源SA、MJ和BTH等生物因子誘導(dǎo)采后果蔬時，果蔬體內(nèi)往往存在活性氧爆發(fā)的現(xiàn)象［6］。活性氧是生物體代謝的產(chǎn)物，對生物細(xì)胞有氧化損傷作用，造成生物體代謝的紊亂［7］。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，活性氧對細(xì)胞增殖、生理機(jī)能和發(fā)育能力等生物學(xué)進(jìn)程是必須的，推測活性氧可能作為一種植物胞內(nèi)信號分子參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)控［8］。

人工合成的2，6 二氯異煙酸（INA）是一種類似SA的化合物，能激活植物系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)（SAR），并提供廣譜的抗病性。INA處理不但可以提高馬鈴薯葉片對致病疫霉菌的抗性［6］，還可以誘導(dǎo)番茄、茄子和辣椒等植株產(chǎn)生抗蟲能力［3］，還可以有效抑制柑橘植株黃龍病的發(fā)生［9］。更多研究表明，INA處理不但能提高植株整體的抗病性，還可以提高采后香蕉和柑橘果實(shí)的抗病性［10-11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，香蕉果實(shí)經(jīng)INA滲透處理后3～12 h內(nèi)，果實(shí)H2O2含量和NADPH氧化酶活性明顯高于對照［10］。在上述研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用INA溶液對采后香蕉果實(shí)進(jìn)行滲透處理，進(jìn)一步探討貯藏過程中INA處理對香蕉果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)效果，及其與活性氧水平、活性氧產(chǎn)生和清除相關(guān)酶類以及抗病相關(guān)酶活性與基因表達(dá)變化的關(guān)系，以期為香蕉的貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試香蕉品種為巴西香蕉（Musa. AAA Group，Cv. Brazil），成熟度為7～8成，采自廣州市南沙區(qū)果園，落梳后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選擇果實(shí)顏色、大小均勻、無病蟲害及機(jī)械傷的果實(shí)，用0.1%漂白粉浸果實(shí)5 min，然后立即用干凈自來水沖洗，晾干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)抗病處理 在低壓（0.8 MPa）條件下，將香蕉果實(shí)置于0.5 mg/L INA 溶液中滲透處理5 min，接著在常壓下繼續(xù)浸泡5 min；INA處理6 h后接種炭疽病菌孢子，以清水作對照。分別在處理0、4、6、8、10、12、15 d取樣，液氮速凍之后存于-80°冰箱備用。

1.2.2 接種處理 炭疽病菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院植物保護(hù)系提供。按黃雪梅等［10］方法對INA處理和對照果實(shí)接種炭疽病菌，置于20℃貯藏15 d，定期評價病情指數(shù)。參照黃雪梅等［2］方法，按病斑擴(kuò)展程度病斑大小判斷病情，以病斑擴(kuò)展垂直兩個方向的平均寬度計(jì)算。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量測定 參照Zhang等［12］方法測定貯藏期間香蕉果皮MDA含量。

1.2.4 過氧化氫（H2O2）含量測定 取香蕉果皮1 g，液氮充分研磨后加入3 mL雙蒸水充分混勻，室溫下溶液12 000 g離心15 min。取上清液1 mL，按過氧化氫試劑盒（南京建成生物工程研究所研發(fā)）的加樣步驟進(jìn)行測定。

1.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性測定 參照范蘭蘭等［13］方法獲得粗酶提取液。在2.9 mL 0.2% H2O2（50 mmol/L、pH 7.8磷酸緩沖液配制）溶液中加入100 μL粗酶液。充分混勻后，監(jiān)測OD240，以每分鐘減少0.001表示1個酶活力單位（U），酶活性以U/g表示，3次重復(fù)。

1.2.6 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 取1.0 g香蕉果皮，液氮研磨后參照趙會杰等［14］方法獲得粗酶。在2.75 mL反應(yīng)液中加入100 μL粗酶液，然后加入150 μL 0.1% H2O2啟動反應(yīng)，測定反應(yīng)體系OD290在3 min內(nèi)的變化，以每分鐘 OD290減少0.001表示1個酶活力單位（U），酶活性以U/g表示，3次重復(fù)。

1.2.7 細(xì)胞膜微膜囊提取 根據(jù)Morre等［15］方法提取貯藏期間香蕉果皮的細(xì)胞膜微膜囊。

1.2.8 NADPH氧化酶活性測定 參考黃雪梅等［10］方法測定香蕉果皮NADPH氧化酶活性。根據(jù)XTT的比吸收系數(shù)（2.16×104L/mol cm-1）換算活性氧的量，酶活力單位為μmol/min·g。

1.2.9 香蕉果皮CAT、APX、P450基因克隆和表達(dá)分析 參照文獻(xiàn)［16］的熱硼酸法提取香蕉果皮的總RNA。根據(jù)NCBI發(fā)表的香蕉CAT（ABV55108.1）基因片段的序列設(shè)計(jì)特異引物克隆上述基因的片段。根據(jù)其他物種APX和P450基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并引物克隆香蕉中的APX和P450基因片段進(jìn)行地高辛探針的標(biāo)記、RNA轉(zhuǎn)膜和Northern雜交分析［17］。各基因的地高辛標(biāo)記引物分別為：CAT上游：5’- GTGCCCGGCATCTACTACTC-3’，下游：5’-TGGAATGGGGAATCTCTCTG-3’；APX上游：5’- ACACACACTGGGAAGGTGCC-3’，下游：5’-TATTGGTGAGATGTTTCCGA-3’；P450上游：5’- GGATGTATGTGAATGCTTGG-3’，下游：5’- TTAATTGCACAAATCGACAC-3’。

2 結(jié)果與分析

2.1 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間炭疽病病斑直徑的影響

貯藏期間，對照和INA處理的香蕉果實(shí)炭疽病病斑直徑都呈上升趨勢。對照果實(shí)在貯藏前8 d病情指數(shù)迅速增加，貯藏15 d炭疽病病斑直徑達(dá)到25 mm。與對照相比，INA處理的香蕉果實(shí)病斑擴(kuò)展緩慢，貯藏8 d病斑直徑僅為4 mm，病斑直徑大小與對照處理4 d的大小相當(dāng)，INA處理貯藏15 d的病斑直徑大小為13 mm，與對照貯藏10 d的病斑直徑大小相當(dāng)，表明INA能有效延緩香蕉炭疽病的病情發(fā)展（圖1）。

圖1 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間炭疽病病斑直徑的影響

2.2 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)，其積累量與過氧化程度呈正相關(guān)。植物組織受到傷害和衰老都會誘發(fā)大量自由基產(chǎn)生和膜脂過氧化發(fā)生，從而產(chǎn)生大量MDA。從圖2可以看出，對照和INA處理的香蕉果實(shí)在貯藏期間MDA含量都有上升趨勢，但I(xiàn)NA處理的果實(shí)MDA含量低于對照，對照果實(shí)在貯藏0、2、10 d MDA含量分別是2.5、2.7、3.3 μmol/mg，比INA處理果實(shí)的MDA含量要高2～2.5倍。推測香蕉病情發(fā)展和果實(shí)成熟衰老有較大關(guān)系，INA處理較好抑制了果實(shí)病情發(fā)展。

圖2 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間MDA含量的影響

2.3 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間H2O2含量的影響

對照和INA處理的香蕉果實(shí)在貯藏前期（0～8 d）的H2O2含量相差不大、維持在700～800 mmol/L（圖3）。隨著貯藏時間的延長，貯藏8 d后，對照果實(shí)的H2O2含量迅速上升，貯藏15 d H2O2含量達(dá)到1 700 mmol/L，而INA處理的果實(shí)在貯藏10 d后H2O2含量才開始提高，且在貯藏后期H2O2含量始終低于對照。與對照相比，INA處理的香蕉果實(shí)中H2O2爆發(fā)的時間推遲了2 d，這可能與香蕉果實(shí)病情發(fā)展和后期成熟有關(guān)。結(jié)果表明，INA處理降低了貯藏后期H2O2積累量，推遲了后期H2O2含量爆發(fā)的時間。

圖3 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間H2O2含量的影響

2.4 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間NADPH 氧化酶活性的影響

NADPH oxidase是一種植物體內(nèi)的氧化還原酶，通過結(jié)合胞質(zhì)中的NADPH催化細(xì)胞胞外的O2生成超氧陰離子（O2·-），最后生成。從圖4可以看出，在貯藏期間，對照和INA處理的NADPH 氧化酶活性呈現(xiàn)先緩慢下降、后急劇上升的趨勢。其中，貯藏0～2 d INA處理果實(shí)的NADPH 氧化酶活性分別為3.1和2.8 μmol/min·g，均高于對照。INA處理的NADPH 氧化酶活性在貯藏4 d降到最低，此后一直維持在較低水平；直到貯藏12 d，INA 處理果實(shí)的NADPH 氧化酶活性開始迅速上升到3.3 μmol/min·g。對照果實(shí)的NADPH 氧化酶活性在貯藏10 d降到最低，之后迅速升高，但是對照中的NADPH 氧化酶活性增加速度不及INA處理。INA和對照果實(shí)貯藏后期NADPH 氧化酶活性提高可能與果實(shí)后熟生理機(jī)制發(fā)生變化有關(guān)。

圖4 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間NADPH oxidase活性的影響

2.5 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間CAT活性的影響

CAT是一種以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，通常被認(rèn)為是參與生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。這是因?yàn)镃AT可催化生物體內(nèi)的H2O2分解為分子氧和水，使細(xì)胞避免受到活性氧的毒害。在貯藏期間，INA處理香蕉果實(shí)中的CAT活性由500 U/g 逐漸下降到貯藏8 d的248 U/g。貯藏10 d INA處理的CAT活性有所恢復(fù)，在貯藏12 d達(dá)到較高值，之后又開始下降；對照在貯藏初期CAT活性處于較低水平，貯藏4 d升高，之后一直保持較高，到后期有所下降，其中貯藏8 d后突然下降。在整個貯藏過程中，INA處理的果實(shí)果皮中CAT活性明顯低于對照（圖5）。

2.6 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間APX活性的影響

圖5 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間CAT活性的影響

從圖6可以看出，在整個貯藏期間，對照果實(shí)的APX活性基本上維持在50 U/g左右，直到后期才有所下降。INA處理果皮APX活性則呈現(xiàn)上升趨勢，到貯藏15 d高達(dá)170 U/g，而對照果實(shí)中的APX活性僅為27.875 U/g，兩者APX活性差異達(dá)到顯著水平。從貯藏4 d開始，INA處理的APX活性始終高于對照，因此我們推斷，在貯藏期間INA誘導(dǎo)高活力的APX清除果皮中的活性氧。

圖6 INA處理對香蕉果實(shí)貯藏期間APX活性的影響

2.7 INA處理對貯藏期間香蕉果皮基因表達(dá)的影響

我們進(jìn)一步從基因角度探討了抗病誘導(dǎo)相關(guān)基因在提高香蕉果實(shí)抗病性中的作用。在香蕉貯藏前4 d，處理和對照果實(shí)具有較高水平的CAT表達(dá)。INA處理的CAT表達(dá)量到貯藏6 d下降到最低水平，貯藏10 d出現(xiàn)高峰，此后維持在一個較高水平。從貯藏8 d開始，對照的CAT表達(dá)量開始明顯下降，在貯藏后期（10～15 d），INA處理的CAT表達(dá)量始終顯著高于對照。

與CAT基因表達(dá)相比，APX基因受INA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，特別是在貯藏前期（0～8 d），INA處理果實(shí)中APX的表達(dá)明顯強(qiáng)于對照。但隨著貯藏時間的推移，INA處理中APX基因表達(dá)量有所下降，與對照相近。

P 4 5 0酶系屬于單加氧酶（monooxy genase），具有解毒作用，又稱為多功能氧化酶、羥化酶，因其還原態(tài)的吸收峰在450 nm處得名。無論是對照還是INA處理，隨著貯藏時間推移，P450基因表達(dá)量均逐漸增加。在貯藏8 d，對照和處理的P450基因開始有少量表達(dá)，此后P450基因在對照和處理組中表達(dá)量迅速上升。貯藏12 d，對照的P450基因出現(xiàn)表達(dá)高峰，而處理果實(shí)的P450基因表達(dá)高峰在貯藏15 d才出現(xiàn)。在貯藏后期，對照的P450基因表達(dá)量始終高于INA處理的基因表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

圖7 INA處理對貯藏期間香蕉果皮CAT、APX、P450基因表達(dá)的影響

活性氧一直被認(rèn)為在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，它們是植物有氧代謝過程中產(chǎn)生的毒害物質(zhì)，同時還作為信號分子啟動很多重要的生理反應(yīng)。黃雪梅等［10］指出，INA滲透處理后6 h內(nèi)，香蕉果皮出現(xiàn)H2O2含量高峰，暗示H2O2可能作為一種信號提高香蕉德抗病性。該結(jié)果有力支持了H2O2作為一個信號分子的學(xué)說［8］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在貯藏期間，采后香蕉果實(shí)炭疽病的發(fā)生與其后熟進(jìn)程關(guān)系密切。對照香蕉果皮變黃后，炭疽病斑迅速擴(kuò)展，病情急劇加重，果皮中H2O2含量迅速升高；而INA滲透則能較好地控制炭疽病發(fā)展、延緩果實(shí)后熟進(jìn)程以及推遲果皮中H2O2含量上升。眾所周知，當(dāng)植物處于逆境條件（脅迫）下，活性氧可引發(fā)生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化作用，對生物膜造成損傷，從而引起機(jī)體一系列生理生化變化，最終造成代謝紊亂［8］。由此我們推測，貯藏后期香蕉果實(shí)與炭疽病菌互作，產(chǎn)生和積累大量的H2O2。

在脅迫環(huán)境中，植物體內(nèi)活性氧含量上升往往伴隨著SOD、POD、CAT、APX等保護(hù)酶活性增加，相關(guān)研究表明，這些抗氧化物酶同樣也參與了果實(shí)的后熟調(diào)控［19］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從貯藏2 d開始，INA處理的APX活性一直保持在較高水平，到貯藏10 d活性又迅速增強(qiáng)，而對照一直處于較低水平（圖4）；從基因表達(dá)上看，變化趨勢大致相符（圖7）。APX是清除葉綠體中H2O2的關(guān)鍵酶類［20］。結(jié)合INA處理果實(shí)中后期APX活性迅速增強(qiáng)的現(xiàn)象，我們推測，處理后期APX活性的增加有利于清除葉綠體中過多的H2O2，延緩葉綠素降解、果實(shí)后熟，從而達(dá)到抗病目的，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。黃雪梅等［10］發(fā)現(xiàn)，INA滲透處理能在早期誘導(dǎo)香蕉CAT活性升高，而本研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏期間，INA處理果實(shí)的CAT活性迅速降低，且在貯藏8 d達(dá)到最低水平。這可能是因?yàn)镃AT與APX兩者對H2O2的親合力不同，屬于兩種不同的H2O2清除酶類［21］，在香蕉貯藏的不同時期起著不同作用。

P450是一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450 nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)，被認(rèn)為在植物體中擔(dān)當(dāng)著生物合成和代謝解毒兩大功能，其中有一些P450在植物防御反應(yīng)中具有重要作用［22］，但P450基因在采后香蕉果實(shí)抗病性的研究還較少。從貯藏8 d開始，處理和對照果實(shí)中P450基因表達(dá)受到誘導(dǎo)，表達(dá)量逐漸增加，但處理的P450增加量顯著低于對照（圖7）。貯藏后期，香蕉果實(shí)進(jìn)入后熟階段，果皮顏色開始轉(zhuǎn)黃，表明P450基因表達(dá)與果實(shí)成熟關(guān)系密切。由此推測，INA通過延緩貯藏期間P450基因的表達(dá)來抑制香蕉果實(shí)的后熟衰老進(jìn)程，進(jìn)而提高了果實(shí)對病原物的抗性。

本研究發(fā)現(xiàn)INA滲透處理能抑制接種病斑的擴(kuò)大，減慢炭疽病的發(fā)展進(jìn)程，表明INA對采后香蕉果實(shí)具有誘導(dǎo)抗病作用。由于INA是SA的結(jié)構(gòu)和功能類似物，具有較好的食品安全性，因此，本研究結(jié)果為果蔬采后病害的生物防治提供了新思路。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

2，6-Dichloroisonicotianic acid repressed reactive oxygen species content and fruit ripening to induce disease tolerance in banana （Musa AAA. cv. Dongguang）

ZHANG Xue-lian1，HUANG Xue-mei2，ZHANG Can2，ZHANG Zhao-qi2，PANG Xue-quan1
（1.College of Life Science，South China Agricultural University，Guangazhou 510642，China；2.Guangdong Key Lab for Postharvest Science of Fruits and Vegetables/College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangazhou 510642，China）

The possible mechanism of INA on disease-tolerance in postharvested banana （Musa AAA. cv. Dongguang） was investgated. Ther results showed that INA treatment effectively reduced the disease spot sizes on the peel of banana fruit when inoculated with spore suspension of Collectotrichum musae after INA treatment and cultured for 15 d. During storage，MDA content increased in both INA treatment and control；however，INA treatment markedly inhibited the MDA content，suggesting that INA retarded the fruit ripening. The content of H2O2in INA treatment was obviously lower than that in control from the 8th d，while high activety of NADPH oxidase in INA treatment was found from the 10th d. An induced CAT activity was found in control during storage；however，high APX activity was detected in INA treatment. During the later storage，INA induced the APX gene expression，but repressed the expression of CAT and P450. The results suggested that enhancing APX activity/gene expression could reduce H2O2level to improve banana disease tolerance during storage.

INA treatment；disease tolerance；reactive oxygen species （ROS）；APX；P450

S 668.1；S 379

A

1004-874X（2016）11-0109-07

2016-07-16

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B07）；國家自然科學(xué)基金（30771515）

張雪蓮（1980-），女，博士，講師，E-mail：xuelianzhang@scau.edu.cn

通迅作者：龐學(xué)群（1968-），女，博士，教授，Email：xqpang@scau.edu.cn

張雪蓮，黃雪梅，張燦，等. INA抑制香蕉果實(shí)中活性氧積累和衰老進(jìn)程提高果實(shí)的抗病性［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：109-115.