大腸埃希氏菌O157∶H7三種標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法比較

周 雯，陳雨欣，蘇粉良，臧海竹，周 斐，朱 榮

（蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，蘇州世標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇蘇州 215104）

大腸埃希氏菌O157∶H7三種標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法比較

周 雯，陳雨欣，蘇粉良，臧海竹，周 斐，朱 榮

（蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，蘇州世標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇蘇州 215104）

在進(jìn)行大腸埃希氏菌O157∶H7擴(kuò)項(xiàng)過程中，對(duì)國(guó)內(nèi)常用3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，不同溫度培養(yǎng)的增菌肉湯均渾濁生長(zhǎng)。大腸埃希氏菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基選擇性較好，建議在日常檢測(cè)工作中使用大腸埃希氏菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基，以提高區(qū)分度及檢出率。同時(shí)，應(yīng)用VITEK 2可以快速簡(jiǎn)便地鑒別目標(biāo)菌。

大腸埃希氏菌O157∶H7；選擇性培養(yǎng)；VITEK 2

0 引言

微生物引起的食源性疾病是全世界的首要食品安全問題[1]。其中，腸出血性大腸埃希氏菌O157∶H7（大腸埃希氏菌O157∶H7、大腸桿菌O157∶H7）是近年來新發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重危害人類健康的一種食源性致病菌[2]，能夠感染豬肉、禽肉、牛肉、牛奶、果汁、蔬菜和飲用水[3]，最低10個(gè)活菌的感染就可能致病[4]。輕度感染者會(huì)出現(xiàn)短暫腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀；重度感染會(huì)導(dǎo)致劇烈腹痛、出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血、血小板減少性紫癜和溶血性尿毒綜合癥，甚至死亡[5]。筆者在新增擴(kuò)項(xiàng)過程中，根據(jù)國(guó)內(nèi)常用的3種標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大腸埃希氏菌O157∶H7進(jìn)行增菌，選擇性分離鑒定，并對(duì)過程進(jìn)行比較分析，以期為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)該目標(biāo)菌提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希氏菌O157∶H7 ATCC 43888，大腸埃希氏菌ATCC 25922，上海寶錄生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良EC肉湯、山梨醇麥康凱（SMAC）瓊脂、改良山梨醇麥康凱（CT-SMAC）瓊脂、科瑪嘉大腸埃希氏菌O157∶H7顯色瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；添加鼠李糖的山梨醇麥康凱（CR-SMAC）瓊脂。

1.1.3 儀器和設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；手提紫外檢測(cè)燈，上海寶山顧村電光儀器廠產(chǎn)品；VITEK 2型全自動(dòng)微生物鑒定儀，法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

GB/T 4789.36—2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)，大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗(yàn)[6]，SN/T 0973—2010進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7檢驗(yàn)方法[7]，SB/T 10462—2008肉與肉制品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7檢驗(yàn)方法[8]。

不同標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)流程見表1。

表1 不同標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)流程

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 增菌結(jié)果

增菌結(jié)果見表2。

2.1.2 菌落形態(tài)

2 種菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表3。

2.1.3 生化試驗(yàn)

表2增菌結(jié)果

菌 株 培養(yǎng)溫度θ/℃ 培養(yǎng)時(shí)間t/h 生長(zhǎng)情況大腸埃希氏菌O157∶H7 ATCC43888渾濁生長(zhǎng)渾濁生長(zhǎng)大腸埃希氏菌ATCC25922 36 41 24 24 36 41 24 24渾濁生長(zhǎng)渾濁生長(zhǎng)

表3 2種菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2 種菌株生化鑒定結(jié)果見表4，菌株的VITEK 2鑒定結(jié)果見表5，菌株血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表4 2種菌株生化鑒定結(jié)果

表5 菌株的VITEK 2鑒定結(jié)果

表6 菌株血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 培養(yǎng)溫度

大腸埃希氏菌O157∶H7最適生長(zhǎng)溫度為33～42℃。在擴(kuò)項(xiàng)試驗(yàn)中，增菌液培養(yǎng)時(shí)間均為24 h，在36℃和41℃，增菌肉湯均渾濁生長(zhǎng)。

2.2.2 SMAC瓊脂平板

典型的大腸埃希氏菌O157∶H7不發(fā)酵山梨醇和鼠李糖，但有個(gè)別變異株可發(fā)酵山梨醇。比較GB/T 4789.36—2008和SN/T 0973—2010可以發(fā)現(xiàn)，SMAC和CT-SMAC有效成分一致。大腸埃希氏菌O157∶H7 ATCC 43888在SMAC瓊脂平板上為扁平透明，圓形光滑，中心呈淡褐色；大腸埃希氏菌ATCC 25922在SMAC瓊脂平板上為粉紅色，有膽鹽沉淀環(huán)，但SMAC培養(yǎng)基不能區(qū)分不發(fā)酵山梨醇的大腸埃希氏菌；在SMAC基礎(chǔ)上添加鼠李糖制成的CR-SMAC可區(qū)分不發(fā)酵山梨醇，但發(fā)酵鼠李糖的大腸埃希氏菌，同時(shí)可抑制變形桿菌的生長(zhǎng)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[2]。建議在日常檢測(cè)工作中，把CRSMAC作為輔助培養(yǎng)基，減少變形桿菌的干擾，更好地區(qū)分大腸埃希氏菌。

2.2.3 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基

大腸埃希氏菌O157∶H7 ATCC 43888在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈粉紫色，邊緣無色；大腸埃希氏菌ATCC 25922呈藍(lán)綠色菌落，有暈圈?？片敿物@色培養(yǎng)基有良好的特異性，可以有效區(qū)分上述2種菌株。所以，在實(shí)際檢測(cè)過程中，以SB/T 10462—2008為檢測(cè)依據(jù)，也可以借助科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，提高檢測(cè)效率。

2.2.4 生化鑒定

典型的大腸埃希氏菌O157∶H7不分解MUG，從而不產(chǎn)熒光。可以先將典型或可疑菌落接種MUG-LST培養(yǎng)基，不產(chǎn)熒光者繼續(xù)純化用于后續(xù)生化鑒定，產(chǎn)熒光者直接排除，建議使用GB/T 4789.36—2008檢測(cè)大腸埃希氏菌O157∶H7，先接種MUG-LST培養(yǎng)基，篩選之后如有必要再接種TSI，也可以節(jié)約檢測(cè)成本、減少工作量。GB/T 4789.36—2008和SN/T 0973—2010均可通過VITEK 2型全自動(dòng)微生物生化鑒定儀，快速、簡(jiǎn)便鑒定菌株，結(jié)果見表6。血清凝集試驗(yàn)中大腸埃希氏菌O157∶H7的O157血清和H7血清均凝集，大腸埃希氏菌ATCC 25922均不凝集，但也有某些抗原可能和大腸埃希氏菌O157∶H7具有相同或相似表位，可能發(fā)生凝集反應(yīng)[2]，所以血清學(xué)試驗(yàn)可以作為篩選后的進(jìn)一步驗(yàn)證，不能作為單一的檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

在日常檢測(cè)工作中，不同溫度培養(yǎng)的增菌肉湯均渾濁生長(zhǎng)。大腸埃希氏菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基有較好的選擇性，可有效排除非目標(biāo)菌，提高檢測(cè)效率。有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以通過VITEK 2型全自動(dòng)微生物生化鑒定儀快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)。在日常檢測(cè)過程中應(yīng)設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

建立靈敏而特異的大腸埃希氏菌O157∶H7檢測(cè)方法用于食品檢驗(yàn)、中毒爆發(fā)調(diào)查、監(jiān)測(cè)與品質(zhì)控制等領(lǐng)域尤為重要[9]，建議繼續(xù)擴(kuò)展快速篩選方法，如GB/T 4789.36—2008中的其他方法。大腸埃希氏菌O157∶H7在食品中的污染量一般較低，且大腸埃希氏菌O157∶H7表型的復(fù)雜性及生化變異株的不斷發(fā)現(xiàn)[10]，建議同時(shí)采用2種或3種以上方法進(jìn)行檢驗(yàn)，如常規(guī)培養(yǎng)方法結(jié)合免疫層析。本實(shí)驗(yàn)室有分子實(shí)驗(yàn)室，可以繼續(xù)擴(kuò)展應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)肉、肉制品及其他各類食品中的大腸埃希氏菌O157∶H7，更好地做好檢測(cè)服務(wù)工作。

[1]陳君石.我國(guó)食品安全問題的特點(diǎn)和應(yīng)對(duì)措施 [C]//中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第五次全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集.貴陽：中國(guó)毒理學(xué)會(huì)，2009：46-48.

[2]宋宏新，李宏，邢佩.食品中大腸桿菌O157∶H7的選擇性培養(yǎng)與檢測(cè)方法研究 [J].山西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（2）：64-67.

[3]山珊，賴衛(wèi)華，陳明慧，等.農(nóng)產(chǎn)品中大腸桿菌O157: H7的來源及分布研究進(jìn)展 [J].食品科學(xué)，2014，35（1）：289-293.

[4]Ferens W A，Hovde C J.Escherichia coli O157:H7：animal reservoir and sources of human infection[J].Foodborne Pathogens and Disease，2011，8（4）：465-487.

[5]王愛華，趙德東.食品中大腸埃希氏菌O157:H7的檢驗(yàn)分析 [J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2008（2）：1 007-1 009.

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 4789.36—2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn) [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 0973—2010進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢驗(yàn)方法 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

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[9]朱啟.大腸桿菌O157的檢測(cè)及生物學(xué)特性研究 [D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

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Comparison of Methods of Three Criterions for Detection of Escherichia coli O157:H7

ZHOU Wen，CHEN Yuxin，SU Fenliang，ZANG Haizhu，ZHOU Fei，ZHU Rong （Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou World Standarcl Testing Co.，Ltd.，Suzhou，Jiangsu 215104，China）

Conventional culture methods of three criterions commonly used in China are compared in the process of extending Escherichia coli O157∶H7.The results show that the enrichment broth of diferent culture temperatures is turbid.Escherichia coli O157∶H7 chromogenic medium is better.Escherichia coli O157∶H7 chromogenic medium in daily work can increase the detection rate is suggested.At the same time，VITEK 2 can be used to identify target bacteria quickly and easily.

Escherichia coli O157∶H7；selective culture；VITEK 2

S851.43

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.012

1671-9646（2016）11a-0040-03

2016-09-09

周 雯（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)槲⑸餀z測(cè)。