熱休克人羊膜間充質(zhì)干細胞提取物與殺傷細胞共培養(yǎng)及抑瘤效應評價*

李培義，李 寧,王 雪，張川骎，李 菲，羅 清

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸部腫瘤科,貴州遵義 563000)

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·論 著·

熱休克人羊膜間充質(zhì)干細胞提取物與殺傷細胞共培養(yǎng)及抑瘤效應評價*

李培義，李 寧,王 雪，張川骎，李 菲，羅 清△

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸部腫瘤科,貴州遵義 563000)

目的 將熱休克人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)提取物與細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)共培養(yǎng)，以期提高早期CIK的增殖、分泌細胞因子及體外殺傷等能力，為得到高質(zhì)量CIK提供研究基礎。方法 (1)從外周血單個核細胞中常規(guī)誘導培養(yǎng)CIK；(2)熱休克處理hAMSCs(42℃，1h)，48h后收集上清液及胞內(nèi)物質(zhì)，將提取物與第10天CIK(370μg∶2×106個)共培養(yǎng)；(3)計數(shù)第12、14、17天CIK細胞數(shù)，繪制生長曲線；(4)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細胞因子白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)的分泌量；(5)MTT法檢測CIK對A549的體外殺傷活性。 結(jié)果 (1)加入hAMSCs提取物的實驗組增殖速度明顯高于對照組，第12、14、17天CIK細胞數(shù)分別為[(5.26±0.01)×105/mL vs. (5.60±0.00)×105/mL)]、[(6.26±0.23)×105/mL vs. (9.37±0.15)×105/mL]、[(8.10±0.75)×105/mL vs. (11.00±1.67)×105/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(2)ELISA結(jié)果表明，hAMSCs提取物對早期CIK細胞分泌細胞因子有一定促進能力，兩組第14天IL-2、TNF-α、IFN-γ量(pg/mL)分別為(13.49±0.78vs. 15.49±3.47)、(53.52±5.52vs. 33.83±15.61)、(60.68±19.39vs. 50.24±18.89)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(3)MTT結(jié)果：對照組與實驗組IC50分別為(38.60±18.63vs. 25.62±8.39)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 成功將熱休克hAMSCs提取物與CIK共培養(yǎng)；共培養(yǎng)后顯著促進了早期CIK的增殖活性。

殺傷細胞；人羊膜間充質(zhì)干細胞；A549肺腺癌細胞；熱休克

腫瘤的形成是多個因素共同促進的復雜過程，其中免疫功能的缺陷是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的必要條件；改善腫瘤患者的機體免疫系統(tǒng)是其治療的關鍵，細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)治療作為一種細胞過繼免疫療法，間接改善腫瘤患者的免疫環(huán)境，通過免疫細胞直接殺傷腫瘤，不良反應低，適用范圍廣，在抗腫瘤治療中顯示了一定的優(yōu)勢[1-3]。它是將人外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子誘導并大量擴增的一群異質(zhì)細胞。CIK抗腫瘤治療的關鍵在于如何培養(yǎng)獲得持久增殖能力、高殺傷力的CIK細胞。目前，關于CIK的培養(yǎng)方法有很多，迄今國內(nèi)對CIK培養(yǎng)技術(shù)還沒有統(tǒng)一的規(guī)范，各家都有不同的報道：有利用腫瘤抗原負載DC活化CIK，選取不同來源的CIK，采取不同分離方式提取CIK，加入外源性刺激物提高CIK抗瘤效應[4-9]。筆者期望在CIK傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中加入一外源性刺激物，改進早期CIK的增殖能力、分泌細胞因子量(間接途徑)、直接殺瘤效應、促凋亡能力等方面的能力。目前，研究較熱門的是人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)，它是一種具有多分化潛能的干細胞，能分泌多種細胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，細胞增殖能力強，來源廣泛，取材方便，無倫理限制等優(yōu)勢；hAMSCs在多個領域都顯示出了可觀的價值[10-12]，筆者期望將hAMSCs與CIK共培養(yǎng)獲得更優(yōu)質(zhì)的CIK細胞。

1 材料與方法

1.1 材料 A549人肺腺癌細胞株來源于中科院腫瘤細胞庫；hAMSCs由遵義醫(yī)學院細胞工程實驗室提供；RPMI Medium 1640、DMEM購自美國gibco公司；細胞因子rhIL-1β、rhIL-2、PegIFN-α-2a均購自英國Peprotech公司；LEAFTMPurified anti-human CD3購自美國BioLegend公司；細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自深圳達科為生物工程有限公司； Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物。

1.2 方法

1.2.1 CIK的提取與培養(yǎng) 取人外周血30mL于離心管中，加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)37℃預熱混勻后，加入含人外周血淋巴分離液的離心管中(血液和淋巴分離液的比為1∶2)，2000r/min離心25min，自然下降減速，離心后吸取第2層環(huán)狀云霧狀白色淋巴細胞， PBS洗滌收集。以1640完全培養(yǎng)基，密度(4～6)×106/mL，孵箱中靜置2h，收集非貼壁細胞，調(diào)整細胞濃度為(1～2)×106/mL，同時加入PegIFN-α-2a(1000U/mL)，第2天加入白細胞介素(IL)-1(100U/mL)、IL-2(1000U/mL)、CD3單抗(50ng/mL)，隔天添加新鮮1640完全培養(yǎng)基，每隔3d補加IL-2(1000U/mL)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。

1.2.2 熱休克處理hAMSCs 取第4代hAMSCs， 42℃熱休克1h后，孵箱靜置48h，收集上清液0.22μmol/L濾膜過濾，-20℃保存，備用；反復凍融法提取熱休克后hAMSCs內(nèi)含物，0.22μmol/L濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CIK與熱休克hAMSCs提取物共培養(yǎng) 在培養(yǎng)第10天的CIK上清液中加入熱休克hAMSCs提取物(CIK∶熱休克hAMSCs提取物為2×106個∶370μg)，常規(guī)培養(yǎng)，設為實驗組。

1.2.4 CIK擴增速度比較 分別計數(shù)第12、14、17天對照組(CIK)、實驗組(熱休克hAMSCs+CIK)細胞數(shù)，并繪制生長曲線，對增殖情況進行統(tǒng)計和比較。

1.2.5 CIK分泌細胞因子比較 收集第14天CIK上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測CIK上清液細胞因子IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)水平。

1.2.6 CIK殺傷活性比較 取第14天的CIK與對數(shù)生長期的A549，按CIK∶A549效靶比5∶1、10∶1、20∶1共培養(yǎng)24h后，MTT法計算CIK對A549的殺傷率。

2 結(jié) 果

2.1 鏡下觀察CIK、hAMSCs及A549肺腺癌細胞形態(tài) CIK在鏡下呈圓形，胞質(zhì)飽滿透亮，懸浮，集落樣生長，黏附性強(圖1A、B)；第4代hAMSCs，細胞均貼壁生長，細胞間排列緊密，胞體拉伸，呈梭形，單層放射狀或漩渦狀生長(圖1C)；A549細胞貼壁生長，多呈梭形，伴偽足伸出(圖1D)。

A：2d CIK(×100);B:10d CIK(×4);C:hAMSCs(×100);D:A549(×100)。

2.2 熱休克hAMSCs提取物促進CIK增殖 第12、14、17天對照組及實驗組CIK細胞數(shù)均隨培養(yǎng)時間的推移呈明顯的擴增趨勢，實驗組CIK增殖速度明顯高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 兩組不同時間點CIK細胞數(shù)

圖2 兩組CIK增殖曲線

2.3 熱休克hAMSCs提取物對CIK分泌細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ的影響 第14天對照組及實驗組上清液中分泌的細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組CIK分泌的細胞因子水平

圖3 兩組CIK分泌的細胞因子水平

2.4 MTT法檢測CIK對A549肺腺癌細胞的殺瘤活性 將第14天對照組及實驗組CIK與A549肺腺癌細胞按5∶1、10∶1、20∶1效靶比共培養(yǎng)24h，CIK對A549的抑制率(%)分別為(9.86±2.55vs. 12.64±3.00)、(27.25±9.34vs. 30.81±8.22)、(37.17±4.59vs. 25.62±8.39)，從結(jié)果可以看出在相同效靶比下實驗組CIK對A549的抑制作用均高于對照組，且隨著效靶比的增高，CIK的殺傷效應也在增加，IC50(38.60±18.63vs. 25.62±8.39)，兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表 3。

表3 CIK對A549肺腺癌細胞的抑瘤作用

圖4 MTT檢測兩組CIK對A549的抑制率

3 討 論

筆者對培養(yǎng)第10天的CIK進行了新方法的處理，在第14天對其進行增殖能力、分泌細胞因子水平、體外殺傷活性、誘導凋亡能力的檢測，評估新方法(加入熱休克hAMSCs提取物)是否提高了早期CIK的上述功能。為了使hAMSCs對淋巴細胞發(fā)揮促進作用，筆者將CIK與低劑量的熱休克hAMSCs提取物共培養(yǎng)，同時為獲得最大量的熱休克蛋白，作者參照了Moloney等[13]對hAMSCs熱休克的研究，將hAMSCs熱休克處理，該研究顯示間充質(zhì)干細胞進行非致死性42℃熱休克處理60min后，37℃孵箱靜止48h后Hsp70、Hsp27等熱休克蛋白達到最大表達量。

采用新方法處理CIK后，熱休克hAMSCs提取物處理后的CIK增殖趨勢明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明熱休克hAMSCs提取物能促進CIK的增殖。這一結(jié)果符合筆者的預期，間充質(zhì)干細胞能修復和促進外周血單個核細胞的增殖能力，也能改善狀態(tài)較差的淋巴細胞活性[14-15]； hAMSCs熱休克后分泌的熱休克蛋白，能促進抗原特異性CD4+細胞增殖；另外，Li等[15]在研究中提到hAMSCs對淋巴細胞既有抑制作用也有促進作用，發(fā)揮何種作用取決于T細胞與hAMSCs的數(shù)集比和一氧化氮(NO)、indoleamine 2,3-dioxygenase(iDO)的水平，低數(shù)集比及NO、iNOS受抑制時hAMSCs對T淋巴細胞表現(xiàn)為免疫促進作用。因此，采用熱休克處理hAMSCs，改變了其胞內(nèi)環(huán)境，阻斷了hAMSCs中NO和iDO的作用，進而能提高免疫細胞的增殖活性，在NO和iDO被阻斷的條件下，也就增強了T淋巴細胞的活性及機體的免疫反應。這一發(fā)現(xiàn)，為臨床上更早期的獲得一定數(shù)量的CIK打下了重要的實驗基礎。

此外，在本研究中，筆者還檢測此方法下對于CIK體外殺傷活性及CIK誘導凋亡能力的影響。結(jié)果顯示，實驗組的殺瘤效應優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在CIK分泌細胞因子水平的實驗中，兩組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針對這一結(jié)果，筆者考慮存在以下幾點可能：(1)選取第14天的CIK作為檢測的時間點太早，未達到CIK對腫瘤細胞的最大殺傷效應及分泌細胞因子的最優(yōu)時間，可在今后的實驗考慮延長CIK的培養(yǎng)時間，檢測多個時間點下CIK的殺瘤能力及促細胞因子分泌能力；(2)熱休克hAMSCs提取物中NO和iDO對淋巴細胞存在一定的抑制作用，熱休克hAMSCs提取物與CIK共培養(yǎng)比例在后續(xù)工作中還將繼續(xù)深入探索，設置多個熱休克hAMSCs提取物與CIK的數(shù)集比，或加入NO和iDO阻斷劑，減少其對淋巴細胞的抑制作用。

綜上所述，筆者采用熱休克hAMSCs提取物與早期CIK細胞進行共培養(yǎng)，明顯刺激了早期CIK(第10天)的增殖活性，此方法為繼續(xù)獲得數(shù)量更多、殺傷活性更強、不良反應更小的CIK提供了重要的實現(xiàn)途徑。筆者還將繼續(xù)優(yōu)化此方法，持續(xù)深入探索和改進CIK的制備工藝。

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The co-culture of CIK cells with heat-shock hAMSCs′ extract and the evaluation of anti-tumor effection*

Li Peiyi,Li Ning,Wang Xue,Zhang Chuanqin,Li Fei,Luo Qing△

(Department of Thoracic Oncology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China)

Objective To improve the proliferation,secretion of cytokines and in vitro killing of CIK cells,and to provide the basis for the study of high quality CIK cells,heat shock hAMSCs extract and CIK cells were co-cultured.Methods (1)Conventional induction culture CIK cells from peripheral blood mononuclear.(2)Processed hAMSCs by heat shock in 42℃water bath for 1h,then collected supernate and extracted of hAMSCs after a 48h incubation in 37℃,5% CO2,co-cultured the heat shock hAMSCs′ extract with CIK cells (in a proportion of 370μg∶2×106).(3)the CIK cells number of 12,14,17d were counted,the growth curvedrawed.(4)The secretion levels (pg/mL) of IL-2,TNF-α and IFN-γ were tested by ELISA method.(5)The CIK′s cytolytic activity to A549cells were tested by MTT assay.Results (1)The experimental group joined the proliferation rate of hAMSCs extract was significantly higher than the control group,control group and experimental group 12，14，17d of cell were[(5.26±0.01)×105/mL vs. (5.6±0.00)×105/mL],[(6.26±0.23)×105/mL vs. (9.37±0.15)×105/mL] and [(8.10±0.75)×105/mL vs. (11.00±1.67)×105/mL],respectively(P<0.05).(2) The results of ELISA showed that hAMSCs extract on early stage of CIK cells secrete cytokines could promote ability,the secretion levels (pg/mL) of IL-2,TNF-α and IFN-γ were (13.49±0.78vs. 15.49±3.47),(53.52±5.52vs. 33.83±15.61) and (60.68±19.39vs. 50.24±18.89),respectively (P>0.05).(3)The results of MTT showed that,IC50in control group and experimental group were 38.60±18.63and 25.62±8.39,respectively (P>0.05).Conclusion We co-culture the CIK cells with heat-shock hAMSCs′ extract successfully;and the new method promoted the plication capacity of CIK.

cytokine induced killer cells；human amniotic mesenchymal stem cells；A549lung adenocarcinoma cells；heat shock

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.001

國家自然科學基金資助項目(81260397)；貴州省科技廳科學技術(shù)基金資助項目(黔科合J字[2013]2331號)；遵義市科技局省-市聯(lián)合項目基金資助項目[遵科合人(2014)9號]；貴州省教育廳高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才支持計劃基金資助項目(黔教合KY字[2015]495)；遵義醫(yī)學院博士啟動基金資助項目[(0060616)F-616]。 作者簡介：李培義(1988-)，醫(yī)師，碩士,現(xiàn)工作于貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院特檢科，主要從事胸部腫瘤診療的研究?！?/p>

R736.3

A

1671-8348(2016)29-4033-03

2016-03-12

2016-05-16)