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    消癢洗劑對(duì)急、慢性濕疹動(dòng)物模型的藥效研究*

    2016-12-19 10:27:56李江萍
    貴州科學(xué) 2016年6期
    關(guān)鍵詞:洗劑苦參皮炎

    李江萍,蔣 玲,李 玲

    (1貴陽中醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部,貴州 貴陽 550001;2貴州醫(yī)科大學(xué) 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550004)

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    消癢洗劑對(duì)急、慢性濕疹動(dòng)物模型的藥效研究*

    李江萍1,蔣 玲1,李 玲2▲

    (1貴陽中醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部,貴州 貴陽 550001;2貴州醫(yī)科大學(xué) 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550004)

    目的:觀察消癢洗劑對(duì)急、慢性濕疹小鼠模型的白介素-1β(IL-1β),白介素-4(IL-4)和白介素-8(IL-8)的表達(dá)影響,以及其抗炎止癢的效果,闡明其治療急、慢性濕疹的作用機(jī)制。 方法:分別采用2,4-二硝基氟苯(DNFB)、2,4-二硝基氯苯(DNCB)致敏建立小鼠急、慢性濕疹模型,分別給予消癢洗劑低、中、高劑量(體積濃度分別為10 %、20 %、40 %)及陽性對(duì)照藥(復(fù)方苦參洗劑)(濃度為40 %)干預(yù),比較各組炎癥因子的變化及其抗炎效果;通過磷酸組胺致癢試驗(yàn)及二甲苯致炎試驗(yàn)觀察消癢洗劑的止癢、抗炎效果。 結(jié)果:消癢洗劑各劑量組能顯著減輕ACD小鼠模型的耳腫脹度(P<0.01)并能夠減輕ACD小鼠模型血清IL-1β、IL-8(P<0.01)等炎癥因子的水平;能顯著減輕DTH小鼠模型的耳腫脹度(高、中劑量組P<0.01,低劑量組無差異),而所有劑量組均能夠減輕DTH小鼠模型血清IL-1β、IL-8(P<0.01)的水平。消癢洗劑高、中劑量組能提高磷酸組胺對(duì)豚鼠的致癢閾(P<0.05);消癢洗劑各劑量組均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹(P<0.01)。結(jié)論:消癢洗劑通過降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8的水平來治療急、慢性皮炎濕疹,且止癢及抗炎的效果明顯。

    消癢洗劑,急慢性皮炎濕疹,IL-1β,IL-8,IL-4,止癢,抗炎

    濕疹是臨床常見的皮膚病之一,是一種由多種內(nèi)外因素引起過敏反應(yīng)的慢性炎癥性皮膚病,多由急性、亞急性濕疹反復(fù)發(fā)作遷延而來,屬變態(tài)反應(yīng)性疾病范疇,約占皮膚科門診患者的20 %左右[1]。近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。西醫(yī)臨床多采用抗組胺藥及糖皮質(zhì)激素治療,長期使用可暫時(shí)取得良好的療效,但對(duì)藥物易產(chǎn)生依賴性,停藥易反復(fù),延續(xù)數(shù)年[2]。中醫(yī)認(rèn)為,本病與臟腑功能失調(diào)、氣血失和、風(fēng)濕熱毒搏結(jié)有關(guān)。病機(jī)為內(nèi)有濕毒蘊(yùn)結(jié),外顯血癖阻絡(luò),久病人絡(luò),久病傷陰。“止癢洗劑”為我院自主研發(fā)的醫(yī)院制劑,由苦參、蛇床子等多味藥組成,全方具有清熱燥濕、消炎殺蟲、祛風(fēng)止癢之功效,注重標(biāo)本兼治,臨床主治急、慢性皮炎濕疹。祖國醫(yī)學(xué)對(duì)皮炎濕疹的治療有著豐富的經(jīng)驗(yàn),針對(duì)辨證分型治療,癥狀的改善與綜合療效均有良好效果,且安全,毒副作用少,在臨床上很值得研究和推廣,具有良好的應(yīng)用前景。

    1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    昆明種小鼠,雌雄各半,體重18~22 g(由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(黔)2012-0001);豚鼠(貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(黔)2012-0001)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

    消癢洗劑由蛇床子、苦參等數(shù)味中藥材混合水提,濃縮而制成(每1 mL消癢洗劑含生藥量0.299 g)(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部制劑室,生產(chǎn)批號(hào):20150617);復(fù)方苦參洗劑(浙江中法制藥,生產(chǎn)批號(hào):20150124)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

    2,4-二硝基氟苯(DNFB)(德國Merck公司,分析純);2,4-二硝基氯苯(DNCB)(德國Merck公司,分析純);IL-1β,IL-4及IL-8 ELLSA試劑盒(上海滬鼎生物有限公司);磷酸組胺(上海士鋒生物,生產(chǎn)批號(hào):A0165-10g);二甲苯(天津志遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司,生產(chǎn)批號(hào):20131116)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

    AE200S電子分析天平(美國setra公司);千分尺(新上量量具有限公司,精度10 μm);打孔器(得力文具)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 消癢洗劑對(duì)過敏接觸性皮炎(ACD)的藥效學(xué)研究

    取60只昆明種小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、消癢洗劑高劑量(體積濃度40 %)、中劑量(濃度20 %)、低劑量(濃度10 %)組及陽性藥對(duì)照組(復(fù)方苦參洗劑,濃度40 %),每組10只,腹部脫毛(面積3×3 cm)以1 % DNFB溶液0.05 mL涂擦致敏,實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)從致敏后開始以耳廓外涂給藥,0.05 mL/次,bid,連續(xù)5 d,模型組給予等量蒸餾水處理,5天后再以1 % DNFB涂擦小鼠耳部激發(fā),測定各鼠左右耳同部位的厚度差值,再用8 mm打孔器取同部位的左右兩耳片稱重計(jì)算左右耳片重量之差值,比較各實(shí)驗(yàn)組間的腫脹度差異。摘眼球取血處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,同時(shí)采用Elisa方法測定血清中IL-1β,IL-4及IL-8炎性細(xì)胞因子的量,比較組間差異。

    2.2 消癢洗劑對(duì)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(DTH)的藥效學(xué)研究

    取60只昆明種小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、消癢洗劑高中低3個(gè)劑量組(濃度同2.1所述)及陽性藥(復(fù)方苦參洗劑)對(duì)照組,每組10只,以7 % DNCB溶液0.05 mL涂擦耳部致敏,隔兩天激發(fā)一次,共激發(fā)4次,藥物干預(yù)從致敏后開始涂搽耳部給藥,0.05 mL/次,bid,連續(xù)10 d,模型組給予等量蒸餾水處理,待末次激發(fā)后觀察各鼠耳厚及耳紅腫情況,并進(jìn)行評(píng)分(無水腫無紅斑為0分;輕度水腫或輕微可見紅斑為1分;中度水腫或中度紅斑為2分;重度水腫或重度紅斑為3分;水腫紅斑同時(shí)存在為4分);同時(shí)采用Elisa方法測定動(dòng)物血清樣本中IL-1β,IL-4及IL-8等炎性因子,比較組間差異。

    2.3 止癢實(shí)驗(yàn)

    采用48只豚鼠,雌雄各半,隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、消癢洗劑高中低3個(gè)劑量組(濃度同2.1所述)及陽性藥(復(fù)方苦參洗劑)對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)時(shí)先將豚鼠后右足背剃毛。試驗(yàn)當(dāng)日,用粗砂紙擦傷右后足背剃毛處,使之發(fā)紅,但以不出血為度,面積1 cm2,給予實(shí)驗(yàn)用藥1次(0.05 mL)然后開始在創(chuàng)面滴0.01 %磷酸組胺液(0.05 mL),以后每隔3 min依0.02 %、0.03 %、0.04 %遞增濃度,直至出現(xiàn)豚鼠回頭添有后足,以最后出現(xiàn)豚鼠回頭舔右后足時(shí)所給予的磷酸組胺總量為致癢閾,比較各組致癢閾的差異。

    2.4 抗炎實(shí)驗(yàn)

    取60只昆明種小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、消癢洗劑高中低3個(gè)劑量(濃度同2.1所述)組及陽性藥(復(fù)方苦參洗劑)對(duì)照組,每組10只,給鼠右耳涂搽1次實(shí)驗(yàn)用藥(0.05 mL),1 h后再給鼠耳涂二甲苯致炎(0.05 mL),左耳作對(duì)照。15 min后用打孔器取雙耳相同部位稱重。以左右耳重量之差作為腫脹度,比較各組腫脹度的差異。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,采用LSD法行組間比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 消癢洗劑對(duì)小鼠ACD模型的干預(yù)結(jié)果

    模型組與空白組相比耳重量差異、耳厚度差異均明顯增加,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。消癢洗劑高、中、低劑量組和復(fù)方苦參洗劑組均能減輕小鼠耳重量差、耳厚度差值,與模型組相比,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(高、中劑量組P<0.01,低劑量組P<0.05)(表1)。采用Elisa法檢測血清IL-1β、IL-4、IL-8水平。模型組與空白組比較,IL-1β、IL-8有明顯的升高(P<0.05),消癢洗劑干預(yù)后,出現(xiàn)劑量依賴性的下降趨勢,從數(shù)據(jù)結(jié)果能明顯看出消癢洗劑能較強(qiáng)抑制IL-1β、IL-8水平;而IL-4水平變化不明顯,表明消癢洗劑能夠減輕小鼠ACD模型血清IL-1β、IL-8等炎癥因子的水平(表2)。

    組 別耳重量差/mg耳厚度差/mm空白組0.015±0.0480.004±0.002模型組9.88±0.3580.127±0.005苦參洗劑組5.57±0.371*0.035±0.007*消癢洗劑高劑量5.91±0.412*0.036±0.002*消癢洗劑中劑量6.45±0.375*0.047±0.009*消癢洗劑低劑量8.12±0.274*0.070±0.016*

    備注:* 與模型組比較,P<0.01

    表2 消癢洗劑對(duì)ACD模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

    備注:* 與模型組比較,P<0.01

    3.2 消癢洗劑對(duì)DTH動(dòng)物模型的干預(yù)結(jié)果

    結(jié)果表明消癢洗劑中、高劑量組和復(fù)方苦參洗劑組與模型組相比,均具有顯著差異(P<0.05)。這表明消癢洗劑能夠減輕小鼠慢性皮炎模型耳腫脹度及水腫紅斑評(píng)分值,且具有劑量依賴性(表3)。模型組與空白組比較,IL-1β、IL-8有明顯的升高(P<0.05),消癢洗劑干預(yù)后,出現(xiàn)劑量依賴性的下降趨勢,從數(shù)據(jù)結(jié)果能明顯看出消癢洗劑能較強(qiáng)抑制IL-1β、IL-8水平;而IL-4水平變化不明顯,表明消癢洗劑能夠減輕小鼠DTH模型血清IL-1β、IL-8等炎癥因子的水平(表4)。

    表3 消癢洗劑對(duì)DTH模型小鼠耳腫脹和耳紅斑水腫評(píng)分值的影響

    備注:* 與模型組比較,P<0.01

    表4 消癢洗劑對(duì)DTH模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

    備注:* 與模型組比較,P<0.01

    3.3 消癢洗劑止癢試驗(yàn)結(jié)果

    空白對(duì)照組和溶媒對(duì)照組豚鼠舔體反應(yīng)較為明顯,在給予磷酸組胺過程中僅有1只動(dòng)物未出現(xiàn)舔體反應(yīng);陽性對(duì)照組有3只動(dòng)物未出現(xiàn)舔體反應(yīng);消癢洗劑三個(gè)劑量組均有接近半數(shù)動(dòng)物未出現(xiàn)舔體反應(yīng)。各組計(jì)算磷酸組胺總量,與空白對(duì)照組和溶媒對(duì)照組相比,消癢洗劑高、中劑量組對(duì)外源性磷酸組胺均有較為明顯的抑制作用,且高、中劑量組優(yōu)于陽性藥物對(duì)照組(表5)。

    表5 消癢洗劑抗磷酸組胺止癢試驗(yàn)豚鼠舔體反應(yīng)情況

    備注:* 與空白對(duì)照組比較,P<0.05

    3.4 消癢洗劑抗炎試驗(yàn)結(jié)果

    消癢洗劑高、中、低劑量組和復(fù)方苦參洗劑組均能減輕二甲苯所致的鼠耳炎性腫脹程度,其耳片重量差值與模型組相比,均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表6)。

    組 別耳片重量差/mg腫脹抑制率/%空白組0.03±0.012—模型組9.56±0.78—苦參洗劑組5.44±0.46*43.09消癢洗劑高劑量5.8±0.24*39.33消癢洗劑中劑量6.7±0.71*29.92消癢洗劑低劑量8.0±0.1316.32

    備注:* 與模型組比較,P<0.01

    4 討論

    濕疹、皮炎(包括接觸性皮炎、過敏性皮炎、自敏性皮炎、傳染性濕疹樣皮炎等)是臨床常見、多發(fā)的皮膚病,約占皮科門診量的15 %~30 %,其中尤以急性濕疹、皮炎多見,是國內(nèi)外皮膚性病臨床及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)課題之一[3-5]。根據(jù)現(xiàn)代研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)理與I、IV型變態(tài)反應(yīng)、細(xì)菌或真菌感染有關(guān),臨床主要表現(xiàn)為過敏性炎癥和劇烈騷癢癥狀,治療上只能以抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎及止癢來說明所研究藥物是否具有治療濕疹的作用。中醫(yī)認(rèn)為皮炎濕疹的病因是以濕邪為主,并可兼風(fēng)挾熱?!帮L(fēng)濕熱邪久滯,耗血傷陰,化燥生風(fēng),肌膚失養(yǎng)”是本病的病機(jī)特點(diǎn)。結(jié)合消癢洗劑其功能主治為清熱燥濕、涼血解毒、祛風(fēng)止癢,主要用于濕疹、銀屑病、丘疹性蕁麻疹、結(jié)節(jié)性癢疹、疥瘡、皮膚瘙癢癥等瘙癢性皮膚病。近年來報(bào)道的皮炎濕疹模型大致可分為變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎及遲發(fā)型濕疹模型、光變態(tài)反應(yīng)性皮炎模型與特應(yīng)性皮炎模型三類[6],故本實(shí)驗(yàn)主要采用了變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性皮炎濕疹模型來考察消癢洗劑的治療效果及其作用機(jī)制,并且針對(duì)疾病的常見癥狀瘙癢及炎性紅腫具體觀察了藥物的對(duì)癥療效,從標(biāo)本兼治兩方面充分闡明消癢洗劑的藥效。

    消癢洗劑方中的君藥取用苦參,有清熱燥濕、殺蟲、利尿的作用,苦參能抑制動(dòng)物被動(dòng)和主動(dòng)皮膚過敏反應(yīng),并能減少致敏動(dòng)物血清抗體的形成,對(duì)過敏性疾病如蕁麻疹、急性濕疹和陰部濕疹及其它皮炎有一定療效[7]。臣藥黃柏具有調(diào)節(jié)免疫功能,抗菌、抗炎、解熱等作用。臣藥地膚子水提取物能抑制單核巨吞噬功能、從而抑制快發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(ADC)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH),臨床常用接觸性皮炎等變態(tài)反應(yīng)性皮膚病[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示消癢洗劑各劑量組能顯著減輕ADC及DTH小鼠模型的炎性組織腫脹程度,說明其對(duì)ADC及DTH所致的皮炎濕疹是有治療效果的。白細(xì)胞介素-1(IL-1)又稱淋巴細(xì)胞激活因子,是急性期免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,它分為IL-1α和IL-1β兩種,其中血液中的IL-1主要為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-1β,正常人血液中不含IL-1β或者含量很低,其含量升高表明機(jī)體內(nèi)有組織損傷或者感染產(chǎn)生。IL-4與IL-3協(xié)同可維持和促進(jìn)肥大細(xì)胞的增殖,在某些過敏反應(yīng)性疾病發(fā)生中具有一定的意義。IL-8是趨化性細(xì)胞因子,可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏型炎癥的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示消癢洗劑確實(shí)能降低ADC及DTH小鼠模型血清IL-1β和IL-8的含量,證明其作用機(jī)制是通過減輕機(jī)體急性期免疫反應(yīng)及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的感染程度,進(jìn)而減輕炎癥造成的皮膚組織損傷,屬于對(duì)因治療。但是其對(duì)IL-4的影響不明顯,考慮是因?yàn)镮L-4對(duì)肥大細(xì)胞的刺激需要有IL-3的配合才能完成,故我們的研究還應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合探討消癢洗劑是否能調(diào)節(jié)IL-3的水平才能評(píng)價(jià)。另外,通過實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,消癢洗劑能顯著提高磷酸組胺致癢豚鼠的致癢閾值,并能減輕二甲苯所致的鼠耳炎性腫脹程度,說明其對(duì)皮炎濕疹兩大主要臨床表現(xiàn)瘙癢、炎性水腫具有良好的控制效果,屬于對(duì)癥治療。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)以中西醫(yī)理論對(duì)皮炎濕疹發(fā)病原因?yàn)樽儜B(tài)反應(yīng)性炎性皮膚病為依據(jù)對(duì)消癢洗劑進(jìn)行藥理學(xué)方面的研究,闡明了其通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)相關(guān)的炎癥因子水平,起到抗炎、止癢、減輕水腫等臨床治療效果,為臨床應(yīng)用消癢洗劑治療急、慢性皮炎濕疹提供基礎(chǔ)理論依據(jù),促進(jìn)了中醫(yī)藥治療皮炎濕疹的發(fā)展,減輕了患者痛苦。但由于本研究實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間限制,僅從抗速發(fā)型過敏反應(yīng)及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗炎及止癢實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究,尚沒有進(jìn)行抗菌、病理改變等方面的研究,不能充分反映藥物治療該病的其他作用機(jī)制,因此還能再開辟新方向,以期為臨床應(yīng)用提供更加充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    ▲通訊作者:李 玲,藥理學(xué)碩士,教授,從事藥理學(xué)研究。

    Pharmacodynamics study on antipruritic lotion on animal model with acute and chronic eczema*

    LI Jiangping1,JIANG Ling1,LI Ling2▲

    (1No.2HospitalAffiliatedtoTCMCollegeofGuiyaug,Guiyaug550001,China;2FunctionLaboratoryofGuizhouMedicalUniversity,Guiyaug550004,China)

    In order to clarify the cure mechanism of the antipruritic lotion on acute and chronic eczema,we observed the effects of the antipruritic lotion on the expression of interleukin-1β(IL-1β),interleukin-4(IL-4)and interleukin-8(IL-8)in mice with acute and chronic eczema,and its anti-inflammatory and antipruritic effects.2,4-dinitro Fluor benzene(DNFB)and 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)were used to establish the mice model with acute and chronic eczema.Then antipruritic lotion(volume concentration of 10 %,20 % and 40 %)and positive control drug(Compound Kushen Lotion,concentration of 40 %)were given to the mice,and the change of inflammatory factors in each group and the anti-inflammatory effect of the lotions were compared.Phosphoric-acid-histamine-induced itch test and xylene-induced inflammation test were carried out to observe the antipruritic and anti-inflammatory effect of the antipruritic lotion.The results showed that,the antipruritic lotion of all doses could significantly reduce the ear swelling of ACD mice(P<0.01),and could reduce the serum level of IL-1β and IL-8 in ACD mice(P<0.01).The antipruritic lotion of high and medium doses could significantly reduce the ear swelling of DTH mice(P<0.01),and the lotion of all doses could reduce the serum level of IL-1β and IL-8 in DTH mice(P<0.01).The antipruritic lotion of high and medium doses could rise the histamine-induced itch threshold in guinea pigs(P<0.05).The antipruritic lotion of all doses could significantly inhibit the xylene-induced ear swelling in mice(P<0.01).In conclusion,the antipruritic lotion cured acute and chronic eczema by reducing IL-1β and IL-8 level,and its antipruritic and anti-inflammatory effects were significant.

    antipruritic lotion,acute and chronic eczema,IL-1β,IL-8,IL-4,antipruritic,anti-inflammatory

    R

    B

    2016-08-18;

    2016-08-31

    貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(編號(hào):QZYY-2014-026)。

    李江萍,藥學(xué)學(xué)士,副主任藥師,從事臨床藥學(xué)研究。

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