突觸體制備方法研究

周榮易， 王嬌嬌綜述， 韓新民審校

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突觸體制備方法研究

周榮易， 王嬌嬌綜述， 韓新民審校

突觸(synapse)，即是指一個(gè)神經(jīng)元與另一個(gè)神經(jīng)元相接觸的部位，突觸是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。由于其特殊位置和作用，突觸是探討腦功能的關(guān)鍵所在[1]。在現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)及眾多其他學(xué)科的研究中，突觸的作用日益得到重視。從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出形態(tài)完整，活性較高的突觸體是進(jìn)行離體神經(jīng)生理、生化和藥理研究的前提。但國(guó)內(nèi)相關(guān)制備技術(shù)卻鮮有報(bào)道。國(guó)外突觸體制備技術(shù)從發(fā)明至今已從最初的不連續(xù)性蔗糖密度梯度法發(fā)展到隨后的改進(jìn)方法及Ficoll/sucrose法直至現(xiàn)在的不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法，其方法不斷改進(jìn)，技術(shù)不斷革新，為現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究提供了保障。通過(guò)查閱搜集大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)國(guó)外突觸體制備技術(shù)，介紹國(guó)外突觸體制備技術(shù)的發(fā)展和先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，以備參考。

1 突觸體

突觸體(synaptosome)，這一專有名稱最早是于1964年由Whittaker和他的團(tuán)隊(duì)提出，并被他們通過(guò)離心方法提取出來(lái)[2]。突觸體是指具有突觸區(qū)完整形態(tài)結(jié)構(gòu)的封閉顆粒，實(shí)際上它是斷裂脫落的神經(jīng)末梢或突觸連接區(qū)，從某種意義上講，它可以被認(rèn)為是一個(gè)具有功能完整的活細(xì)胞[3]，突觸體之所以能被離體制備，根本在于其突觸間連接的牢固性和突觸裂口區(qū)的自動(dòng)融合性，這些特性能夠使斷裂的神經(jīng)末梢完整保存突觸區(qū)的各種成分及其功能，保留著活細(xì)胞的一系列特性[3]。這就使得突觸體的分離和離體實(shí)驗(yàn)變得可能且具有研究?jī)r(jià)值。自20世紀(jì)60年代突觸體分離成功，突觸體分離技術(shù)促進(jìn)了神經(jīng)生物學(xué)的快速發(fā)展，離體突觸生理、生化及藥理研究等大大促進(jìn)了人們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認(rèn)知。研究報(bào)道，海馬神經(jīng)元突觸體的損傷與數(shù)量的減少與老年人的記憶力減退密切相關(guān)[4，5]。另有相關(guān)報(bào)道證實(shí)突觸體的受損與減少同樣會(huì)導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降[6]。因此，制備結(jié)構(gòu)完整、高活性的突觸體是進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)研究的前提。

2 制備方法

從20世紀(jì)60年代突觸體分離成功至今，突觸體的分離和純化方法得到了不斷的改進(jìn)，所提取的突觸體形態(tài)結(jié)構(gòu)保存不斷完整；生理活性不斷提高；同時(shí)，隨著方法的不斷完善和革新，提取率也有所上升。突觸體為生物化學(xué)和藥理學(xué)對(duì)神經(jīng)末梢的研究和神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)體外研究提供了良好的研究對(duì)象[7]。現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究中，制備形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、具有生理活性和較高產(chǎn)出率的突觸體，是進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)進(jìn)一步分析研究的基礎(chǔ)。從突觸體命名至今，突觸體的制備與純化和其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的提取和純化方法大致相同，主要可分為不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法(蔗糖法)[2，8]、經(jīng)典方法的改進(jìn)型方法[9]、和不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法[10]3種。

2.1 不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法 不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法，其基本原理是利用蔗糖或蔗聚糖等小分子溶液，根據(jù)所離心的組織勻漿液的不同分子量，預(yù)先配制好不連續(xù)性濃度梯度，根據(jù)不同分子量組織在離心力和重力作用下的通透性和沉降速率不同，將勻漿液等置于梯度液頂層離心，在離心力和重力作用下，不同分子量的組織會(huì)在梯度液中分層分離，根據(jù)已知所需組織的生物學(xué)特點(diǎn)，判斷其分層位置后取出進(jìn)行相關(guān)研究。該方法于上世紀(jì)60年代最先由Whittaker等人運(yùn)用，被奉為突觸體制備的經(jīng)典方法，至今仍然在許多組織提取和純化實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用，運(yùn)用領(lǐng)域十分廣泛。其大致操作流程如圖1所示：

圖1 經(jīng)典方法制備突觸體[2，8]

1996年中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者Tong等[7]為研究泌尿系統(tǒng)膀胱的神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)作用，運(yùn)用該方法嘗試從膀胱組織中提取突觸體并獲得成功，簡(jiǎn)要操作步驟如下：(1)3月齡大的Wistar 大鼠，斷頭處死，沿腹白線快速取出膀胱；(2)迅速稱重，用剪刀將膀胱剪為長(zhǎng)度為2～5 mm的碎片；(3)將碎片置于含有濃度3 mmol/L，pH值為7.2的鈉磷酸鹽的0.32 mol/L的蔗糖液中勻漿；實(shí)驗(yàn)所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行；(4)勻漿液1000 r/min離心10min；(5)將所得顆粒物質(zhì)按上一步驟再次離心；(6)將離心后漂浮物收集17000 r/min離心20 min；(7)將顆粒物放入1.5 ml的0.32 mol/L的蔗糖液再懸浮并低速短暫離心；(8)按照Gray and Whittaker[8]的蔗糖梯度離心法將顆粒物置于梯度液；(9)梯度液超高速離心機(jī)100000 r/min離心60 min；(10)取位于0.8～1.2 M梯度帶上的微粒物質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)液5倍稀釋并低溫離心機(jī)5000 r/min離心30 min，將微粒物置于1 ml的標(biāo)準(zhǔn)液中再懸浮，配方如下：NaCI 132 mmol/L，KCI 5 mmol/L，CaCl21.2 mmol/L，MgCI21.3 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，glucose 10 mmol/L，Tris-base 20 mmol/L；調(diào)pH至7.4，置于室溫環(huán)境。該方法作為經(jīng)典的提取方法，應(yīng)用范圍廣泛，可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢進(jìn)行提取和純化，在被報(bào)道后的幾十年間受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視和應(yīng)用。

2.2 改進(jìn)型方法 經(jīng)典的蔗糖梯度離心法應(yīng)用廣泛，為突觸體制備和研究做出了巨大貢獻(xiàn)。但同時(shí)也存在制備時(shí)間長(zhǎng)，高速離心次數(shù)過(guò)多和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法保證突觸體結(jié)構(gòu)完整性等不足。最初階段，為了提高效率，對(duì)于需要突觸體進(jìn)行遞質(zhì)分析的工作，多數(shù)學(xué)者直接運(yùn)用P2部分(P2部分相當(dāng)于離心后粗制線粒體部分，包含突觸體、線粒體和細(xì)胞膜等)進(jìn)行。但P2部分含有線粒體和溶酶體等相關(guān)的酶類(lèi)，不同程度地干擾了遞質(zhì)分泌和代謝進(jìn)程[1]。為了糾正這些缺點(diǎn)，學(xué)者在運(yùn)用過(guò)程中不斷進(jìn)行改進(jìn)以縮短制備時(shí)間，提高突觸體純度。1978年，有學(xué)者運(yùn)用Ficoll/sucrose[9]方法制備突觸體。作為一種制備方法，該方法和經(jīng)典方法在原理和操作上有諸多相同，在此不做贅述。在突觸體中，突觸前神經(jīng)末梢在結(jié)構(gòu)上是比較牢固的，在勻漿時(shí)，神經(jīng)元破碎而突觸區(qū)仍可保留完整性。將組織放入等滲介質(zhì)中勻漿，再用差速離心法分離勻漿液中各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分。紋狀體在調(diào)控大腦對(duì)行為能力和其他重要的認(rèn)知能力方面具有重要作用，它主要接收來(lái)自大腦黑質(zhì)區(qū)、丘腦區(qū)和大腦皮質(zhì)的信息并加以處理，丘腦區(qū)和腦皮質(zhì)主要傳輸興奮性的信息，這一作用可能與谷氨酸受體有關(guān)，為了研究證實(shí)突觸前膜促代謝性谷氨酸受體(mGlu receptor)激活調(diào)控谷氨酸的釋放，1995年，國(guó)外學(xué)者East等[11]在前人方法基礎(chǔ)上運(yùn)用了如下方法制備突觸體，具體步驟如下圖2：

圖2 突觸體提取步驟[11]

East等人的方法是在密度梯度離心法的基礎(chǔ)上根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的條件和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)，采用差速離心法，部分改進(jìn)了經(jīng)典方法，降低了實(shí)驗(yàn)難度，提高了制備效率。1997年，日本學(xué)者[12]在NO抑制腦內(nèi)突觸體對(duì)5-HT的吸收作用的研究中，研究人員運(yùn)用差異離心法制備突觸體觀察突觸體與5-HT在不同劑量NO作用下的關(guān)系變化，他們所用的突觸體的制備方法和該方法大致相同，也是根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行簡(jiǎn)單修改，可供參考。

2.3 不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法 Percoll 是一種含有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20 mosm/kg H2O)，粘度也很小，可形成高達(dá)1.3 g/ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000 r/min)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于 Percoll 擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心法和在運(yùn)用過(guò)程中的相關(guān)改進(jìn)方法，均可以制備出突觸體，但有諸多的不足。近年來(lái)，隨著Percoll試劑的廣泛運(yùn)用和推廣，不連續(xù)性Percoll 密度梯度離心法制備突觸體技術(shù)日趨成熟，其制備的突觸體以其諸多優(yōu)勢(shì)被國(guó)外學(xué)者所采用。2008年，Nature Protocols雜志對(duì)該方法進(jìn)行詳細(xì)報(bào)道[13]，并對(duì)該方法的優(yōu)勢(shì)及詳細(xì)步驟進(jìn)行介紹。這更使得該方法在國(guó)外突觸體制備技術(shù)上逐漸占據(jù)主導(dǎo)和領(lǐng)先地位。該方法自80年代被Nagy等人[10]報(bào)道以來(lái)，運(yùn)用范圍不斷擴(kuò)大，并不斷改進(jìn)而趨于成熟。如Bai and Witzmann[14]；Whittaker[15]，Hajos[16]等都運(yùn)用Percoll密度梯度離心法成功制得符合研究要求的突觸體。根據(jù)2008年Nature Protocols雜志對(duì)該方法的詳細(xì)報(bào)道，具體實(shí)驗(yàn)步驟如圖3：

圖3 不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法[13]

除此之外，近幾年不斷有人在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)和完善，使得該方法更加高效便捷。2011年，Westmark等人[17]根據(jù)自己的制備經(jīng)驗(yàn)，對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，使得突觸體的制備更加簡(jiǎn)便。為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和人力，制備出更高質(zhì)量的突觸體，2014年Murphy等人[18]發(fā)明了高通量、半自動(dòng)化的制備儀器(eg. FastPrep Tissue and Cell Homogenizer，MP Biomedical，Santa Ana，CA，USA，#116004500，et al. )來(lái)提高突觸體制備的效率。根據(jù)他們的報(bào)道，運(yùn)用這一設(shè)備，他們的制備時(shí)間降至約35 min，這和傳統(tǒng)方法的4～5 h相比，大大節(jié)省了研究人員的實(shí)驗(yàn)時(shí)間和勞動(dòng)量，為突觸體的制備提供了嶄新的途徑，這一技術(shù)可能使突觸體的制備和神經(jīng)生物學(xué)研究邁入快車(chē)道。

3 討 論

突觸體作為一個(gè)可被看作是具有完整結(jié)構(gòu)和功能的活細(xì)胞的脫落神經(jīng)末梢，它的成功制備是能夠進(jìn)行體外神經(jīng)生理、神經(jīng)病理和神經(jīng)遞質(zhì)分泌等相關(guān)研究的前提。制備結(jié)構(gòu)完整、具有活性的突觸體，既是完成實(shí)驗(yàn)研究的必然要求，也應(yīng)該是從事神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)研究人員的必備技能。在國(guó)內(nèi)，目前這一工作的開(kāi)展還不普及，制約了相關(guān)學(xué)科實(shí)驗(yàn)研究的發(fā)展。雖然不連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法在國(guó)內(nèi)有部分實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用比較成熟[19，20]，但該技術(shù)相對(duì)比較落后，存在制備時(shí)間較長(zhǎng)、突觸體完整性較差、梯度液易混淆等不足。隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷進(jìn)步，經(jīng)典方法得到不斷改進(jìn)以彌補(bǔ)該方法的不足。East等人在經(jīng)典方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)方法操作流程簡(jiǎn)單，不需要配制密度梯度液，部分糾正了經(jīng)典方法的不足。但該法制備的突觸體純度和產(chǎn)出率較低，其活性有待檢測(cè)，對(duì)于一般的突觸體分析比較適宜，而對(duì)要求較高的神經(jīng)分子生物學(xué)研究則需進(jìn)一步純化。不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法作為一種新方法，2008年，Nature Protocols[13]完整介紹了Percoll密度梯度離心法并總結(jié)了該方法的優(yōu)缺點(diǎn)。Percoll梯度液的優(yōu)點(diǎn)：(1)目前最快速的制備有活性的突觸體的方法。(2)全程是在等滲條件下進(jìn)行，對(duì)突觸體有很好保護(hù)性。(3)不需超高速離心，最大限度保證突觸體結(jié)構(gòu)完整性。(4)制備的突觸體具有較高活性。(5)花費(fèi)時(shí)間較少，所制得突觸體運(yùn)用范圍廣泛。存在的不足：(1)高純度的突觸體產(chǎn)出率相對(duì)較低，主要集中在第4梯度帶，但對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)可以將3～4梯度帶一同收集。(2)Percoll梯度液配制較費(fèi)時(shí)，但該梯度液可以在實(shí)驗(yàn)前不超過(guò)24 h內(nèi)提前配制備用。(3)該方法對(duì)離心機(jī)有特殊要求等。該方法作為目前較先進(jìn)的制備方法在國(guó)外應(yīng)用越發(fā)廣泛，其諸多優(yōu)勢(shì)可填補(bǔ)經(jīng)典方法的不足，但國(guó)內(nèi)對(duì)關(guān)于這一技術(shù)制備突觸體的有關(guān)文獻(xiàn)僅有兩篇[21，22]，且實(shí)驗(yàn)路線介紹比較簡(jiǎn)略。此外，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室對(duì)突觸體制備技術(shù)的報(bào)道文獻(xiàn)很少且大都限于經(jīng)典技術(shù)路線，這大大制約了國(guó)內(nèi)相關(guān)方面的研究進(jìn)程。顯而易見(jiàn)，突觸體的制備是一項(xiàng)十分有意義且要求相對(duì)較高的技術(shù)，它能將神經(jīng)生物學(xué)的研究帶入離體實(shí)驗(yàn)階段，從微觀上進(jìn)行深入分析。同時(shí)，在此離體研究的基礎(chǔ)上，若能和整體研究相結(jié)合，必然能促進(jìn)神經(jīng)生理、神經(jīng)病理、神經(jīng)生物學(xué)的研究。相信隨著國(guó)內(nèi)研究工作的深入發(fā)展，突觸體的制備技術(shù)必然會(huì)被眾多學(xué)科重視運(yùn)用，為國(guó)內(nèi)神經(jīng)生物學(xué)的研究做出貢獻(xiàn)。

[1]林 玲，吳馥梅. 突觸體的制備與應(yīng)用[J]. 生理科學(xué)，1986，6(2)：89-95.

[2]Whittaker VP，Michaelson IA，Kirkl RJ. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles(“synaptosomes”)[J]. Biochem，1964，90：293-303.

[3]Whittaker VP. Structure and function of synapses[M]. New York：Publishers New York，1972. 87-88.

[4]Buell SJ，Coleman PD. Dendritic growth in the aged human brain and failure of growth in senile dementia[J]. Science，1979，206：854-856.

[5]王 蓉，唐 玉，張 麗，等. 大鼠海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的增齡變化[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(4)：18-22.

[6]劉幸毅，徐曉虹，張 勤，等. 環(huán)境雌激素雙酚A對(duì)成年小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸結(jié)構(gòu)的影響[J]. 心理學(xué)報(bào)，2013，45(9)：981-992.

[7]Tong YC，Hung YC，Lin SN，et al. Isolation of synaptosomes from the rat urinary bladder[J]. J Autonomic Nervous System，1996，58：76-80.

[8]Gray EG，Whittaker VP. The isolation of nerve endings from brain：an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation[J]. J Anat，1962，96：79-88.

[9]Booth RF，Clark JB. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain[J]. Biochem J，1978，176：365-370.

[10]Nagy A，Delgado-Escueta AV. Rapid preparation of synaptosomes from mammalian brain using nontoxic isoosmotic gradient material (Percoll)[J]. J Neurochem，1984，43：1114-1123.

[11]East SJ，Hill MP，Jonathan M. Brotchie Metabotropic glutamate receptor agonists inhibit endogenous glutamate release from rat striatal synaptosomes[J]. Euro J Pharmacol，1995，27：117-121.

[12]Asanol S，Matsudal T，Nakasul Y，et al. Inhibition by nitric oxide of the uptake of [3H] Serotonin into Rat Brain Synaptosomes[J]. Ipn J Pharmacol，1997，75：123-128.

[13]Dunkley PR，Jarvie PE，Robinson PJ. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes[J]. Nature Protcols，2008，3(11)：1718-1728.

[14]Bai F，Witzmann FA. Synaptosome proteomics[J]. Subcell Biochem，2007，43：77-98.

[15]Whittaker MT. Pregnenolone sulfate induced NMDA receptor dependent release of dopamine from synaptic terminals in the striatum[J]. J Neurochem，2008，107：510-521.

[16]Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fraction in high purity[J]. Brain Res，1975，93：485-489.

[17]Westmark PR，Westmark CJ，Jeevananthan A，et al. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient[J]. J Visual Exp，2011，55：1-9.

[18]Kathryn M，Murphya M，Balsor J，et al. A high-throughput semi-automated preparation for filtered synaptoneurosomes[J]. J Neurosci Met，2014，235：35-40.

[19]肖忠新，魏守剛，云少君，等. 小鼠腦突觸體制備方法的改進(jìn)[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2010，16(10)：937-938.

[20]顧豐華，胡 俊，陳 嘉，等. 分部離心和梯度離心制備大鼠腦突觸體方法的比較[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43(7)：580-583.

[21]阮清偉，王正敏. 聽(tīng)皮質(zhì)高純度突觸體的提取方法[J]. 中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2004，4(4)：222-223.

[22]Liu ZC，Liang XC. Effect of Pyrethrins and Rosemary on the ATPase Activities of Rat Cerebral Synaptosome[J]. Chin J Appl Environ Biol，2008，14(3)：399-402.

1003-2754(2016)03-0280-03

Q421；R338.1+3

2015-01-30；

2016-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81273801)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所，江蘇 南京 210023)

韓新民，E-mail：hxm1nj@163.com

綜 述