卵巢癌不易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機制探討*

杜 琴，鄭 藝，雷開鍵，賈鈺銘

(1.山西省大同市第三人民醫(yī)院腫瘤科 037006；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴州遵義 563000；3.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科 644000)

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卵巢癌不易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機制探討*

杜 琴1，鄭 藝2，雷開鍵3△，賈鈺銘3

(1.山西省大同市第三人民醫(yī)院腫瘤科 037006；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴州遵義 563000；3.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科 644000)

目的 分析卵巢癌明顯腦轉(zhuǎn)移少見的可能機制。方法 將肺腺癌A549細胞株和卵巢癌Skov3細胞株分別通過尾靜脈、腹腔、頸總動脈、顱內(nèi)途徑注入雌性裸鼠體內(nèi)(每個途徑16只裸鼠)：4～6周后處死裸鼠，取其腦、肺、腎、脾臟、肝臟、輸卵管、卵巢及腹腔腫瘤包塊，進行HE染色，分析腦內(nèi)成瘤情況。結(jié)果 尾靜脈注射途徑 Skov3細胞株組無腦轉(zhuǎn)移， A549細胞株組有2例腦轉(zhuǎn)移；腹腔注射途徑 Skov3細胞株組無腦轉(zhuǎn)移， A549細胞株組有2例腦轉(zhuǎn)移；頸總動脈注射途徑 Skov3細胞株組未發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)成瘤，A549細胞株組8例腦內(nèi)成瘤。以上3種顱外注射途徑，Skov3細胞株與A549細胞株在顱內(nèi)成瘤率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而直接顱內(nèi)注入途徑 Skov3細胞株組14例腦內(nèi)成瘤，A549細胞株組10例腦內(nèi)成瘤，二者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 血腦屏障可能在阻止卵巢癌腦轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用。

卵巢腫瘤；肺腫瘤；腦轉(zhuǎn)移；裸鼠；血腦屏障

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，5年存活率低，約25%～30%。卵巢癌容易在腹腔廣泛播散，70%的病例就診時已屬晚期。但卵巢癌極少發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，尤其是上皮細胞性卵巢癌，據(jù)相關報道卵巢癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為0.29%～0.80%[1-4]。而肺癌腦轉(zhuǎn)移很常見，約20%～50%，在腦轉(zhuǎn)移瘤中來源于肺癌的占18%～64%[5]。為了探索卵巢癌腦轉(zhuǎn)移少見的原因，筆者將卵巢癌Skov3細胞株和肺腺癌A549細胞株通過不同途徑注入裸鼠體內(nèi)，觀察這兩種細胞株在顱內(nèi)成瘤的差異，從而探討卵巢癌不易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性BALB/C裸鼠， 6～8 周齡，體質(zhì)量(18±2)g，無特定病原體級(SPF)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于SPF動物房。肺腺癌A549細胞株及卵巢癌Skov3細胞株，購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、滅活新生牛血清、胰酶購自Hycone生物制品公司；PBS液購自貴陽愛瑞生物有限公司；氯化鈉購自上海試劑總廠；水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醛溶液購自重慶市北碚精細化工廠。

1.3 主要儀器 SHZ-88A往復式水浴恒溫振蕩器購自江蘇太倉市實驗設備廠；Centrifuge5415D離心機購自德國Eppendorf公司；低溫冰箱MDF-38ZE購自Sanyo公司；Nikon光學顯微鏡購自尼康儀器有限公司；BP211D精密電子天平購自北京賽多利斯電子有限公司；CO2孵箱購自Thermo Scientific公司；TMS-1015倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.4 細胞培養(yǎng)及制備 肺腺癌A549細胞株及卵巢癌Skov3細胞株用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(含10%新生牛血清)，當細胞達到80%～90%融合時進行消化。最后以0.9%氯化鈉注射液稀釋至細胞密度為1×107/mL和3×107/mL兩種單細胞懸液，備用。

1.5 接種方法 接種動物按以下途徑分別接種肺腺癌A549細胞株和卵巢癌Skov3細胞株，每種細胞每個途徑各接種16只裸鼠。(1)尾靜脈途徑：裸鼠尾部皮膚用75%乙醇常規(guī)消毒，將制備好的0.15 mL腫瘤細胞懸液(濃度為1×107/mL)注入裸鼠尾靜脈，共注入1.5×106個腫瘤細胞。(2)腹腔途徑：裸鼠腹部皮膚用聚維酮碘消毒，將制備好的0.15 mL腫瘤細胞懸液(濃度為1×107/mL)注入裸鼠左側(cè)腹腔。(3)頸總動脈途徑：用2%水合氯醛(麻醉劑量標準：200 mL/kg)腹腔注射麻醉裸鼠(麻醉后觀察裸鼠呼吸、心率穩(wěn)定，無大小便失禁)，以仰臥位將已麻醉的裸鼠固定于實驗木板上，用聚維酮碘消毒裸鼠頸部皮膚，剪開皮膚，鈍性逐層分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈，用0號絲線標記頸總動脈近心端并結(jié)扎，遠心端用動脈夾(3 mm型號)夾閉，用眼科剪刀在兩端封閉的這一段頸總動脈動脈壁剪開一個小斜口，再用PE導管插入頸總動脈斜口，取掉遠心端動脈夾，繼續(xù)插入1 cm，沿導管注入0.05 mL腫瘤細胞懸液(濃度為3×107/mL)，用0#絲線將注射處遠端結(jié)扎，以防細胞回漏。聚維酮碘常規(guī)消毒手術(shù)切口后立即縫合皮膚。術(shù)后裸鼠保溫，待裸鼠蘇醒后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。(4)顱內(nèi)途徑：裸鼠麻醉同上，俯臥位固定于實驗木板上，參照Kastritis 等[6]的方法進行顱內(nèi)注射：用聚維酮碘消毒裸鼠頭部皮膚，在裸鼠頭頂部正中切開長約0.5 cm皮膚，暴露顱骨，在前囟前0.5 mm、中線右側(cè)2.0 mm處為進針點。用1 mL注射器抽吸3×107/mL的單細胞懸液0.05 mL(含有1.5×106個腫瘤細胞)，用適當力度注入顱內(nèi)，進針深度約為3 mm，消毒棉球壓迫止血數(shù)分鐘，縫合切口。術(shù)后裸鼠保溫，待裸鼠蘇醒后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。有研究報道[7-8]。將NCI-H460細胞接種在裸鼠肺葉中，4周后發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移及腎上腺轉(zhuǎn)移。本實驗繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠4～6周后，部分裸鼠行動遲緩，進食減少，出現(xiàn)呼吸急促，消瘦，腹部增大，腹部可捫及包塊。用頸椎脫臼法處死裸鼠，系統(tǒng)解剖探查，取腦、肺、腎臟、脾臟、肝臟、雙側(cè)輸卵管、卵巢及腹腔腫瘤包塊，10%中性甲醛固定，石蠟包埋， HE染色。所有病理切片均由同一位具有高級職稱的病理專家閱片確認。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，各率或構(gòu)成比的比較用χ2檢驗；因為n<40，T<1，用四格表的Fisher確切概率法統(tǒng)計，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 尾靜途徑成瘤或轉(zhuǎn)移情況 見表1，兩種細胞株顱內(nèi)轉(zhuǎn)移比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 裸鼠尾靜脈注射Skov3細胞和A549細胞腦轉(zhuǎn)移比較(n)

2.2 腹腔注射途徑成瘤或轉(zhuǎn)移情況 腹腔腫瘤大體外觀呈球形，直徑約1 mm至2 cm大小不等，白色，質(zhì)硬，表面凹凸不平，與腹壁及腹腔周圍器官有粘連，將腫瘤切開后，內(nèi)部實質(zhì)色白，無液腔及壞死區(qū)域。肺臟、膈肌、肝臟、胰臟、胃、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮等表面均可見到結(jié)節(jié)。其成瘤或轉(zhuǎn)移情況見表2，兩種細胞株顱內(nèi)轉(zhuǎn)移比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 裸鼠腹腔注射Skov3細胞和A549細胞腦轉(zhuǎn)移比較(n)

2.3 右頸總動脈注射途徑 由于右側(cè)總動脈被結(jié)扎，個別裸鼠出現(xiàn)同一方向轉(zhuǎn)圈運動及一側(cè)眼瞼閉合現(xiàn)象，可能是因為右側(cè)大腦缺血及損傷右側(cè)迷走神經(jīng)引起。成瘤或轉(zhuǎn)移情況，見表3，兩種細胞株顱內(nèi)轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 裸鼠頸總動脈注射Skov3細胞和A549細胞腦轉(zhuǎn)移比較(n)

2.4 前3種途徑裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移總體情況 見表4，兩種細胞株顱內(nèi)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.200，P<0.01)。

表4 前3種途徑注射Skov3細胞和A549細胞腦轉(zhuǎn)移總體比較(n)

2.5 裸鼠顱內(nèi)直接注射途徑 Skov3細胞和A549細胞腦內(nèi)成瘤率都很高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 裸鼠顱內(nèi)注射Skov3細胞和A549細胞腦內(nèi)成瘤情況比較(n)

3 討 論

卵巢癌起病隱匿，腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移率高，復發(fā)率高，預后差，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的病死率居高位[9]。但上皮性卵巢癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的極少見[10]，而非小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移很常見。筆者假設卵巢癌Skov3細胞株在裸鼠體內(nèi)會和在人體內(nèi)一樣，腦轉(zhuǎn)移也很少。為此，通過不同途徑將這兩種細胞株注入裸鼠體內(nèi)，或許對探索卵巢癌不易腦轉(zhuǎn)移的機制有一定啟示。從動物實驗結(jié)果分析，尾靜脈注射途徑、腹腔注射途徑、頸總動脈注射途徑都在裸鼠體內(nèi)不同部位形成一定的腫瘤灶，雖然Skov3細胞株形成腫瘤灶的比率相對較少，但卵巢癌Skov3細胞株未發(fā)現(xiàn)1例在腦內(nèi)成瘤，這應該不是偶然現(xiàn)象。筆者可以據(jù)此推斷，血腦屏障在阻擋卵巢癌Skov3細胞進入腦組織的過程中起了重要作用。而直接注入腦組織的兩種腫瘤細胞成瘤率都很高，說明裸鼠腦組織環(huán)境并不能抑制肺癌A549細胞和卵巢癌Skov3細胞的生長。裸鼠頸總動脈注射途徑，卵巢癌Skov3細胞株未發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)成瘤，而肺腺癌A549細胞株顱內(nèi)成瘤率達到50%，這一點與臨床肺癌易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移相符，而卵巢癌細胞為什么不容易通過血腦屏障，目前還不清楚。尾靜脈注射途徑與腹腔注射途徑顱內(nèi)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學意義，可能是樣本量不夠；同時也提示，采用這兩種途徑循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量不是那么多，因而肺癌細胞株進入大腦的可能性也低。

血腦屏障是機體最重要的內(nèi)部屏障之一，由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜和膠質(zhì)細胞足突共同組成[11]。血腦屏障的結(jié)構(gòu)包括：毛細血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接、毛細血管基膜、由星形膠質(zhì)細胞終足圍繞形成的毛細血管基膜外的膠質(zhì)膜[12]。血腦屏障是維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，它允許腦組織所需要的營養(yǎng)物質(zhì)通過的同時而可有效阻擋有害物質(zhì)的侵入[13]。由于腦毛細血管內(nèi)皮的屏障功能，蛋白質(zhì)、大分子藥物以及各種染料不易透過血腦屏障；腦毛細血管內(nèi)皮細胞間的緊密接合含有帶負電荷的膠質(zhì)，故帶負電荷的物質(zhì)不易通過血腦屏障[14]。是否卵巢癌Skov3細胞株整體帶負電荷的分子多，從而被血腦屏障排斥在外，是筆者下一步研究的方向。腹腔注射途徑，卵巢癌Skov3細胞株未發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，可能是由于腹膜屏障也會在一定程度上阻擋Skov3細胞向腹腔外侵犯。

綜上所述，一旦血腦屏障在某些因素影響下被破壞，卵巢癌腦轉(zhuǎn)移的概率則大大增加。卵巢癌患者保持血腦屏障的完整性，對于減少卵巢癌腦轉(zhuǎn)移起到非常重要的作用。至于卵巢癌細胞不容易通過血腦屏障,是其電荷屏障作用還是相關分子作用，有待于今后進一步探討。

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Investigation on mechanism of ovarian cancer scarcely developing brain metastasis*

DuQin1，ZhengYi2，LeiKaijian3△，JiaYuming3

(1.DepartmentofOncology，DatongMunicipalThirdPeople′sHospital,Datong,Shanxi037008,China； 2．DepartmentofObstetrics,AffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China; 3.DepartmentofOncology,YibinMunicipalSecondPeople′sHospital,Yibin,Sichuan644000,China)

Objective To observe the intracranial tumorigenicity situation of lung cancer cell strain and ovarian cell strain by injecting them into the female nude mice with different approaches and to analyze the possible mechanism for scarce brain metastasis of ovarian cancer to provide a certain thinking for the treatment of brain metastasis of lung cancer.Methods Ovarian cancer cell strain Skov3 and lung cancer cell strain A549 were injected into female nude mice respectively through tail veins, abdominal cavity, common carotid artery and brain tissue. There were 16 nude mice in each approach. All the nude mice were killed 4-6 weeks later. Then the brain, lungs, kidneys, spleen, liver, fallopian tube, ovary and abdominal tumor mass were taken by HE staining for observing the cerebral tumorigenicity situation.Results By the caudal vein injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, while in the A549 strain group，2 cases of brain metastasis occurred. By the aabdominal cavity injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, but 2 cases of brain metastasis occurred in the A549 strain group. By the common carotid artery injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, but 8 cases of brain metastases occurred in the A549 group. The intracranial tumorigenicity of Skov3 strain and A549 strain had statistical difference among these 3 kinds of extracranial injection approaches(P<0.01). By intracranial direct injection approach, 14 cases of brain tumorigenicity occurred in the Skov3 strain group, while 10 cases of brain tumorigenicity occurred in the A549 strain group, the difference had no statistical difference. Conclusion Blood brain barrier maybe plays an important role in preventing ovarian cancer cells from metastasizing into brain.

ovarian neoplasms；lung neoplasms；brain metastasis；nude mice；blood brain barrier

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.004

四川省衛(wèi)生廳科技基金資助項目(120014)；四川省宜賓市科技基金資助項目(2012ZSF007)。 作者簡介：杜琴(1984-)，碩士，住院醫(yī)師，從事腫瘤轉(zhuǎn)移的研究。△

R737.31

A

1671-8348(2016)33-4619-03

2016-02-18

2016-06-06)