沙蜇蛋白酶解物類蛋白反應修飾及其生物活性

石 曉 梅， 車 麗 輝， 董 秀 芳， 孫 美 玲， 付 穎 寰

( 1.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；3.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034；4.大連工業(yè)大學 輕工與化學工程學院, 遼寧 大連 116034 )

?

沙蜇蛋白酶解物類蛋白反應修飾及其生物活性

石 曉 梅1,3， 車 麗 輝1,2， 董 秀 芳1,2， 孫 美 玲1,2， 付 穎 寰1,4

( 1.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；3.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034；4.大連工業(yè)大學 輕工與化學工程學院, 遼寧 大連 116034 )

為提高沙蜇肽的降血壓和抗氧化活性，通過plastein反應修飾沙蜇蛋白酶解物。根據單因素試驗優(yōu)化得出plastein反應最佳條件：溫度20 ℃、底物質量分數35%、加酶量2.5 kU/g。在此條件下反應6 h，游離氨基減少量為83.09 μmol/g，plastein反應產物的體外ACE抑制率為83.15%(產物質量濃度為15 mg/mL)，比沙蜇蛋白酶解物的ACE抑制率提高了10.45%；反應4 h，游離氨基減少量為107.52 μmol/g，plastein反應產物的體外DPPH的IC50為24.68 mg/mL，比沙蜇蛋白酶解物的DPPH清除力提高了39.63%。plastein反應可提高沙蜇肽的ACE抑制活性和DPPH清除能力。

沙蜇；類蛋白反應；ACE抑制活性；抗氧化活性

0 引 言

沙蜇(Stomolophusmeleagris)中氨基酸種類和含量豐富[1]，脂質膽固醇含量低[2]，屬于高蛋白低脂肪食物，且資源豐富，在我國大部分沿海地區(qū)均有分布[3]，具有一定的開發(fā)價值。為更好地開發(fā)利用沙蜇資源，許多學者對沙蜇多肽的酶解制備條件以及其生物活性進行了研究。李偉偉等[4]對沙蜇的組成成分以及酶解制備沙蜇多肽條件進行了系統(tǒng)的研究，并且對沙蜇多肽的降血壓和抗氧化活性進行了研究。

類蛋白(plastein)反應是濃縮的蛋白水解物在適宜的條件下經蛋白酶作用形成類似于蛋白質的混合物[5]。在plastein反應過程中，由于同時存在水解作用、縮合作用、轉肽作用和物理聚集[6]，因此極有可能生成具有新結構的肽，從而提高其生物學活性。國內外對plastein反應的研究除探究反應機理和適宜的反應條件外[7]，大多集中于應用方面[8]，高博等[9-10]通過對酪蛋白、大豆蛋白水解物進行類蛋白反應，發(fā)現(xiàn)了其ACE抑制活性、抗氧化性等性質得到顯著的提高。由于在plastein反應過程中未添加任何有機溶劑或其他的化學試劑，其在生產生活中具有較好的安全性，這方面的研究吸引了越來越多學者的關注。本實驗探索通過plastein反應來修飾沙蜇蛋白酶解物，以期達到提高沙蜇肽的降血壓和抗氧化活性的目的，為沙蜇蛋白資源的進一步開發(fā)利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

鹽漬沙蜇皮，購自大連市內長興市場；色譜甲醇和FAPGG，Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

L550離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；A200型電子順磁共振波譜儀，德國Bruker opertics公司；KQ2200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；lambda 35 紫外可見光譜儀，Perkin Elmer公司；漩渦振蕩器，賽唯斯科技公司；PHS-3C型精密酸度計，上?？祪x儀器有限公司。

1.2 鹽漬沙蜇皮原料處理

將鹽漬沙蜇皮切成1 cm左右的方塊，放入去離子水浸泡，隔天換水，共浸泡10 d。瀝干后真空冷凍干燥、粉碎，置于-30 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶解制備沙蜇生物活性肽

采用堿性蛋白酶酶解沙蜇皮制備沙蜇肽，酶解條件：底物質量分數4%，溫度60 ℃，酶加量2.5 kU/g，pH 8。

1.4 plastein反應修飾沙蜇肽

以沙蜇皮蛋白酶解肽凍干粉為原料，利用堿性蛋白酶進行plastein反應。由于該反應發(fā)生在肽段之間，類似于重新形成蛋白的反應，因此可以使用體系的游離氨基減少量來表征反應發(fā)生的程度。實驗中考察了酶加量、底物質量分數、反應溫度和反應時間對游離氨基減少量的影響。各因素水平梯度分別為：反應溫度10、20、30、40 ℃；底物質量分數30%、35%、40%、45%、50%；酶加量1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 kU/g；水解時間1、2、3、4、5、6 h。反應完畢后，在沸水浴中保持10 min滅酶，采用鄰苯二甲醛法測定游離氨基含量[11]。

1.5 ACE抑制活性的測定

體外ACE抑制活性參照文獻[12]進行測定，將 FAPGG底物溶液與超純水或ACE抑制肽混合均勻，加入ACE酶液反應30 min后，加入EDTA溶液終止反應，最后加入超純水稀釋，應用紫外分光光度計在340 nm波長下分別測定反應體系0 min和30 min時的吸光度，并計算差值ΔA，ACE抑制率根據下面公式計算[13]：

式中：ΔAc為加入超純水時吸光度在30 min內的變化；ΔAi為加入抑制劑時吸光度在30 min內的變化。

1.6 羥基自由基清除率的測定

在Fenton反應體系中，6 mmol/L的EDTA-2Na 10 μL，6 mmol/L的FeSO410 μL，6% H2O28 μL，1 mol/L DMPO 10 μL，各濃度樣品溶液10 μL，用pH 7.4、150 mmol/L磷酸鹽緩沖液補充體積至100 μL，混合均勻后，置于40 ℃水浴30 min，放入諧振腔，微波頻率9.4 GHz，微波功率74.8 mW，放大倍數1.00×105，調制幅度1.0 G，在中心磁場強度3 369.08 G、調制頻率100 kHz、時間常數163.84 ms、轉換時間160 ms條件下掃描?？瞻捉M中提取液用pH 7.4、150 mmol/L 磷酸鹽緩沖液代替，以波譜信號的第2個峰高值表示信號相對強度[14]，計算清除率。

1.7 DPPH清除率的測定

DPPH清除能力按照文獻方法[15]進行測定，將DPPH、磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)和抑制劑迅速混合，避光保存30 min后立即吸入毛細管，放入諧振腔，微波功率5.32 mW，微波頻率9.44 GHz；在中心磁場強度3 368.6 G、放大倍數1.4×104、調制幅度1.0 G、時間常數81.92 ms調制頻率、100 kHz、轉換時間40 ms條件下掃描。以波譜信號第3個峰高值表示信號的相對強度，計算清除率。

2 結果與討論

2.1 酶解制備沙蜇肽及其生物活性

按“1.3”的方法制備沙蜇肽，此條件下水解度為20.69%。經測定，在堿性蛋白酶酶解沙蜇肽質量濃度為15 mg/mL時，ACE抑制率為75.28%；羥基自由基的IC50為16.57 mg/mL；DPPH的IC50為40.88 mg/mL。

2.2 反應溫度對plastein反應的影響

由于plastein反應是放熱反應[16]，本實驗考察了10～40 ℃內游離氨基減少量的變化。結果如圖1所示，在升溫過程中，游離氨基減少量不斷下降。但是若反應溫度過低，體系內分子運動激烈程度則會大大降低，從而減少了蛋白酶與底物的碰撞概率。因此選擇20 ℃為堿性蛋白酶plastein 反應修飾沙蜇酶解肽的最適溫度。

圖1 溫度對游離氨基減少量的影響

2.3 底物質量分數對plastein反應的影響

類蛋白反應通過濃縮酶解產物發(fā)生，因此，底物質量分數是類蛋白反應主要影響因素[7]。由圖2可以看出，隨著底物質量分數的增加，游離氨基的減少量逐漸增多，當底物質量分數達到35%時，游離氨基的減少量達到峰值，隨著底物質量分數繼續(xù)增加，體系黏度變大，以至于不利于反應的進行，因此游離氨基減少量反而下降。

2.4 酶加量對plastein反應的影響

由圖3可知，酶加量在1.5～2.5 kU/g，隨著酶加量的增大，游離氨基減少量在逐漸增大；酶加量大于2.5 kU/g時，隨著酶加量的增大，游離氨基減少量幾乎保持不變，可能是酶量已達到飽和。因此，堿性蛋白酶的最佳添加量為2.5 kU/g。

圖2 底物質量分數對游離氨基減少量的影響

圖3 加酶量對游離氨基減少量的影響

2.5 Plastein反應修飾程度與產物生物活性

由表1可以看出，隨著plastein反應時間的延長，游離氨基的減少量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，說明此時體系中存在著蛋白水解和肽合成兩種反應。而酶解物的ACE抑制活性隨著plastein 反應修飾時間的延長增幅不大，反應6 h時達到最大值83.15%(沙蜇肽質量濃度為15 mg/mL)，表明plastein反應修飾可以提高沙蜇蛋白酶解物ACE抑制活性；沙蜇水解物羥基自由基的IC50隨plastein 反應修飾時間的延長幾乎保持不變，這表明plastein反應修飾對沙蜇蛋白酶解物的羥基自由基的清除力幾乎沒有影響；水解物DPPH的IC50隨著plastein反應修飾時間的延長呈不規(guī)則變化，4 h(24.68 mg/mL)達到最低，雖然活性的

表1 Plastein反應對沙蜇蛋白水解物生物活性的影響

Tab.1 Effects of plastein reaction-based modification on bioactivities of jellyfish protein hydrolysates

t/h游離氨基減少量/(μmol·g-1)ACE抑制率/%IC50/(mg·mL-1)羥基自由基DPPH075．2816．5740．881120．1378．7916．8951．552122．0376．6917．5652．823124．1379．6318．8230．564107．5278．3718．6524．68585．6177．2516．2547．15683．0983．1516．4532．44

提高與修飾程度的相關性不明顯，這與plastein反應的隨機性有關，但整體的結果仍然表明，沙蜇蛋白水解物的plastein反應修飾是提高DPPH清除能力的有效方法。

3 結 論

本研究確定了堿性蛋白酶plastein反應修飾沙蜇蛋白酶解物的最佳條件：反應溫度20 ℃，酶加量2.5 kU/g，底物質量分數35%，此條件下反應6 h，游離氨基減少量為83.09 μmol/g，沙蜇肽體外ACE抑制率為83.15%(沙蜇肽質量濃度為15 mg/mL)，比酶解肽ACE抑制率提高了10.45%；此反應條件下反應4 h，游離氨基減少量為107.52 μmol/g，沙蜇肽體外DPPH的IC50為24.68 mg/mL，比酶解肽DPPH清除力提高了39.63%?？梢?，plastein反應可以改善沙蜇蛋白酶解肽的抗氧化性和ACE抑制活性方面具有一定的潛力，值得進一步研究。

[1] 閆玉霞.沙蜇營養(yǎng)成分分析及肌原纖維自身降解特性研究[D].青島:中國海洋大學,2011.

[2] HSIEH Y H P, LEONG F, BARNES K W. Inorganic constituents in fresh and processed cannonball jellyfish (Stomolophusmeleagris)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(10): 3117-3119.

[3] 農業(yè)部漁業(yè)局.2013中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M].北京:中國農業(yè)出版社,2013.

[4] 李偉偉,李八方,胡靖,等.沙海蜇ACE抑制肽制備酶解條件研究[J].農產品加工(學刊),2014(6):4-7.

[5] YAMASHITA M, ARAI S, TSAI S J, et al. Plastein reaction as a method for enhancing the sulfur-containing amino acid level of soybean protein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1971, 19(6): 1151-1154.

[6] STEVENSON D E, MORGAN K R, FENTON G A, et al. Use of NMR and mass spectrometry to detect and quantify protease-catalyzed peptide bond formation in complex mixtures[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 25(3/4/5): 357-363.

[7] SUKAN G, ANDREWS A T. Application of the plastein reaction to caseins and to skim-milk powder: Ⅰ. Chemical and physical properties of the plastein and the mechanism of plastein formation[J]. Journal of Dairy Research, 1982, 49(2): 279-293.

[8] SYNOWIECKI J, JAGIELKA R, SHAHIDI F. Preparation of hydrolysates from bovine red blood cells and their debittering following plastein reaction[J]. Food Chemistry, 1996, 57(3): 435-439.

[9] 高博,趙新淮.耦合Plastein反應的大豆蛋白降壓肽酶法制備技術[J].食品科學,2010,31(22):25-30.

[10] ZHAO X H, WU D, LI T J. Preparation and radical scavenging activity of papain-catalyzed casein plasteins[J]. Dairy Science and Technology, 2010, 90(5): 521-535.

[11] 朱曉杰,曾名湧,趙元暉,等.海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應修飾及其對ACE活性的影響[J].中國海洋藥物,2011,30(6):6-12.

[12] 孫輝.酪蛋白ACE抑制肽的類蛋白反應修飾與溶劑分級研究[D].哈爾濱:東北農業(yè)大學,2012.

[13] OTTE J, SHALABY S M A, ZAKORA M, et al. Fractionation and identification of ACE-inhibitory peptides from α-lactalbumin and β-casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(12): 1460-1472.

[14] 張友九,寧萍,強亦忠,等.水溶性抗氧化劑清除羥基自由基能力的ESR評價方法[J].蘇州醫(yī)學院學報,2001,21(1):32-34.

[15] 騰楊,王雪,杜波濤,等.金銀花的不同濃度醇提取物對DPPH清除作用的ESR研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2011,34(6):43-44.

[16] 徐微,趙新淮.酪蛋白水解物的Plastein反應修飾及ACE抑制活性變化[J].中國乳品工業(yè),2011(4):8-11.

陳庭家,田景玉,丁月,隋凌云,宋亮.刺參體腔細胞類型及其死亡率與溫度的關系[J].大連工業(yè)大學學報,2016,35(6):407-410.

Modification of jellyfish protein hydrolysates by plastein reaction and its biological activity

SHI Xiaomei1,3, CHE Lihui1,2, DONG Xiufang1,2, SUN Meiling1,2, FU Yinghuan1,4

( 1.National Marine Food Research Center, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian, 116034, China； 3.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, 116034, China； 4.School of Light Industry and Chemical Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, 116034, China )

The hydrolysate of jellyfish was modified by plastein reaction to improve its antihypertensive and antioxidant activity. The optimal conditions of plastein reaction were obtained by single factor experiments as follows: reaction temperature of 20 ℃, concentration of jellyfish hydrolysates of 35% and enzyme amount of 2.5 kU/g. Under the conditions, the maximal decrease of free amino groups in reaction mixture of 83.09 μmol/g was obtained. The angiotensin converting enzyme inhibitory activity of the product was 83.15% (the concentration of product was 15 mg/mL) after reaction for 6 h, which increased by 10.45% compared with the unmodified hydrolysate. The maximal decrease of free amino groups in reaction mixture of 107.52 μmol/g was obtained after reaction for 4 h, and the product exhibited IC50of DPPH was 24.68 mg/mL, which increased by 39.63% compared with the unmodified hydrolysate. The plastein reaction could improve ACE inhibitory activity and DPPH radical scavenging activity of hydrolysate obtained from jellyfish.

jellyfish; plastein reaction; ACE inhibitory activity; antioxidant activity

2015-03-20.

國家自然科學基金資助項目(31501431)；遼寧省教育廳基本科研業(yè)務費項目(2016J014)；遼寧省優(yōu)秀人才支持計劃項目(LJQ2013058).

石曉梅(1988-)，女，碩士研究生；通信作者：付穎寰(1976- )，女，教授.

TS254；S986.1

A

1674-1404(2016)06-0403-04

SHI Xiaomei, CHE Lihui , DONG Xiufang, SUN Meiling, FU Yinghuan. Modification of jellyfish protein hydrolysates by plastein reaction and its biological activity[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 403-406.