腎蘇Ⅳ干預(yù)嘌呤霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究*

黃 勇 吳國(guó)慶 竇一田 曹式麗 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(南昌330006)

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腎蘇Ⅳ干預(yù)嘌呤霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究*

黃 勇 吳國(guó)慶 竇一田△曹式麗▲江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(南昌330006)

目的：探討中藥復(fù)方腎蘇Ⅳ干預(yù)嘌呤霉素(PAN)腎病大鼠足細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法：采用單次頸靜脈注射法建立PAN腎病大鼠足細(xì)胞損傷模型。將60只SD大鼠隨機(jī)分為A組(對(duì)照組)，B組(模型組)、C組(腎蘇Ⅳ低劑量組)、D組(腎蘇Ⅳ中劑量組)及E組(腎蘇Ⅳ高劑量組)，每組12只。治療第1、2、3、4、6周末檢測(cè)大鼠24h尿蛋白定量(24hUpro)及血清白蛋白(ALB)水平；第1、6周末分別處死6只大鼠留取腎臟組織，檢測(cè)腎小球足細(xì)胞Nephrin、CD2AP的表達(dá)變化；電鏡觀察腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：第6周末，C、D、E組24hUpro水平均低于B組，P<0.05；C、D、E組ALB水平均高于B組，P<0.05。第6周末，C、D、E組Nephrin、CD2AP表達(dá)均高于B組，P<0.05。C、D、E組大鼠腎小球基底膜增厚及足突融合程度較B組均明顯減輕。結(jié)論：腎蘇Ⅳ可降低PAN腎病大鼠24hUpro，提高ALB水平，促進(jìn)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷修復(fù)，阻抑足細(xì)胞損傷。

“風(fēng)濕擾腎”，“腎絡(luò)失和”常為慢性腎臟病病程中的重要病理因素。本課題在既往關(guān)于“腎絡(luò)病證”研究的基礎(chǔ)上，提出益氣祛風(fēng)、養(yǎng)血和絡(luò)法干預(yù)慢性腎臟病足細(xì)胞損傷的創(chuàng)新性思路，通過篩選具有療效優(yōu)勢(shì)的中藥復(fù)方“腎蘇Ⅳ”對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞損傷模型進(jìn)行干預(yù)。其旨在從創(chuàng)新發(fā)展的角度認(rèn)識(shí)慢性腎臟病，進(jìn)而提高中醫(yī)藥治療疑難疾病的臨床和研究水平。

1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 60只雄性SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，體重160～180g，SPF/VAF級(jí)，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004。隨機(jī)分為A組(對(duì)照組)，B組(模型組)、C組(腎蘇Ⅳ低劑量組)，D組(腎蘇Ⅳ中劑量組)及E組(腎蘇Ⅳ高劑量組)，每組12只。

1.2 PAN腎病大鼠模型制備 造模藥物：嘌呤霉素(100mg/支，Lot. No. 419E042)，北京索來寶生物科技有限公司提供。采用單次頸靜脈注射法建立PAN腎病大鼠模型，PAN劑量為10mg/100g體重。腹腔注射5%水合氯醛0.6ml/100g體重，取仰臥位固定，75%乙醇消毒、備皮，在頸部沿頸靜脈方向切開2cm，分離皮下組織層，暴露頸靜脈，經(jīng)頸靜脈注射PAN溶液，分層縫合切口。術(shù)后經(jīng)腹腔給每只大鼠注射青霉素鉀鹽(10萬(wàn)U)溶液，連續(xù)3d。對(duì)照組頸靜脈注射等劑量生理鹽水。

1.3 治療藥物及給藥方法 腎蘇Ⅳ組成：生黃芪30g，青風(fēng)藤、澤蘭各15g，炒當(dāng)歸、漢防己、僵蠶、重樓各10g。上7味藥共煎煮3次，濃縮成100ml汁液(1.00g生藥/ml)，無菌裝瓶密封，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。給藥方法：造模后第1天起，D組灌服腎蘇Ⅳ劑量為1.80ml/200(g·d)，C組為D組的1/2，E為D組的2倍，A、B組灌服生理鹽水劑量為1.80ml/200(g·d)，共灌服6周。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)試劑：24hUpro、ALB檢測(cè)試劑盒由德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司提供；Nephrin 、CD2AP購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記兔抗山羊、HRP標(biāo)記兔抗小鼠、HRP標(biāo)記兔抗大鼠購(gòu)于美國(guó)KPL公司。實(shí)驗(yàn)儀器：日本日立H-7500型透射電鏡；圖像采集系統(tǒng)(GATANORIUS830)。

1.5 標(biāo)本采集 治療第1、2、3、4、6周末代謝籠收集大鼠24h尿液并測(cè)量尿量；目?jī)?nèi)眥取血，離心10min(3000rm/min)，分離血清，-20℃保存待測(cè)。各組治療第1、6周末分別處死6只大鼠，迅速打開腹腔，摘取腎臟，剝離腎包膜，4℃條件下，取部分腎臟皮質(zhì)組織，制成1mm3組織塊，置于4%戊二醛溶液固定，用于電鏡檢測(cè)。剩余腎組織迅速置于液氮中保存，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo) 24hUpro、ALB；Western Blotting法檢測(cè)腎小球足細(xì)胞Nephrin、CD2AP的表達(dá)變化；電鏡觀察腎小球足細(xì)胞形態(tài)改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 24h尿蛋白變化 第1周末，B、C、D、E組均明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第3周始，C、D、E組均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6周末，D、E組均明顯低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

2.2 血清白蛋白變化 第1周末，B、C、D、E組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第4周始，C、D、E組均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6周末，D、E組均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表2。

2.3 腎蘇Ⅳ對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞Nephrin表達(dá)的影響 第1周末，B、C、D、E組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6周末：C、D、E組均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表3及圖1。

2.4 腎蘇Ⅳ對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響 第1周末：B、C、D、E組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6周末：C、D、E組均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D、E組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4及圖2。

表1 治療第1、2、3、4、6周末24h尿蛋白定量變化(mg/24h)

表2 治療第1、2、3、4、6周末血清白蛋白變化(g/L)

表3 腎蘇Ⅳ對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞Nephrin表達(dá)的影響

表4 腎蘇Ⅳ對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響

2.5 電鏡觀察腎蘇Ⅳ對(duì)PAN腎病大鼠足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 第6周末電鏡檢測(cè)結(jié)果，A組：腎小球足細(xì)胞足突排列均勻整齊；基底膜厚薄均勻一致；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞正常；近曲小管結(jié)構(gòu)亦正常。B組：腎小球足細(xì)胞足突明顯增寬、融合成板片狀，裂孔間隙消失；足突胞質(zhì)腫脹；基底膜局部明顯增厚；血管內(nèi)皮細(xì)胞中度增生、融合，窗孔消失。C組：腎小球足突融合，裂孔間隙變窄；基底膜中度增厚；足突胞質(zhì)輕度腫脹；血管內(nèi)皮細(xì)胞中度增生。D組：腎小球基底膜輕度增厚；足突輕度融合；血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生。E組：腎小球基底膜輕度增厚；足突輕度融合；血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生，見圖3。

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C、D、E分別為中藥低、中、高劑量組

3 討 論 足細(xì)胞損傷是腎小球損傷的中心環(huán)節(jié)。MCD、FSGS、MN及DN的發(fā)生都與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[1]。當(dāng)足細(xì)胞丟失10～20%時(shí)，腎小球損傷尚可修復(fù)；丟失20～40%時(shí)，將導(dǎo)致腎小球硬化；丟失超過50%時(shí)，腎小球?yàn)V過功能將嚴(yán)重受損，腎小球硬化而不可逆轉(zhuǎn)[2]。故阻抑足細(xì)胞損傷是防治多種腎小球疾病的核心環(huán)節(jié)。腎臟病往往病程綿長(zhǎng)，腎氣虛弱是導(dǎo)致疾病慢性化的內(nèi)在基礎(chǔ)，濕濁、瘀血、熱毒、外邪是疾病進(jìn)程中虛實(shí)錯(cuò)雜的病理因素。其中“風(fēng)濕擾腎”，“腎絡(luò)失和”更是疾病復(fù)雜病理階段的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們前期圍繞“腎小球固有細(xì)胞功能調(diào)節(jié)”、“腎臟血管損傷修復(fù)”等進(jìn)行了大量的研究[3-4]。本研究系既往研究基礎(chǔ)上，通過篩選具有療效優(yōu)勢(shì)的中藥復(fù)方“腎蘇Ⅳ”對(duì)PAN腎病大鼠進(jìn)行干預(yù)，以探討腎蘇Ⅳ阻抑足細(xì)胞損傷的機(jī)制。方中以生黃芪、炒當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，充養(yǎng)腎絡(luò)；以漢防己、青風(fēng)藤、僵蠶祛風(fēng)勝濕，搜剔腎絡(luò)風(fēng)濕伏邪；以重樓、澤蘭解毒通絡(luò)；諸藥協(xié)同以益氣祛風(fēng)、養(yǎng)血和絡(luò)，促進(jìn)腎絡(luò)氣血調(diào)和。

PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為足突融合成板片狀，裂孔間隙消失，繼而足細(xì)胞表型發(fā)生改變，發(fā)展至腎小球硬化[5]，是目前研究MCD和FSGS的理想動(dòng)物模型。足細(xì)胞可通過構(gòu)建腎小球?yàn)V過的分子和電荷屏障，分泌可溶性因子，協(xié)調(diào)裂孔隔膜內(nèi)信號(hào)傳遞等作用維持腎小球?yàn)V過屏障功能的正常[6]。而這一切都要以完整的足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。Nephrin是位于腎小球裂孔隔膜的一種跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白細(xì)胞黏附分子超家族[7]。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)觀察結(jié)果顯示：相鄰足突Nephrin分子胞外段通過嗜同性結(jié)合或嗜異性結(jié)合組成許多線形結(jié)構(gòu)，構(gòu)成足細(xì)胞裂孔隔膜[8]。Nephrin分子胞內(nèi)段的酪氨酸殘基磷酸化后可激活下游信號(hào)分子，形成足細(xì)胞內(nèi)特有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與足細(xì)胞重要生理病理過程的調(diào)節(jié)[9]。Nephrin磷酸化程度的降低與蛋白尿的發(fā)生以及足細(xì)胞形態(tài)改變密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球通透性和足突形態(tài)發(fā)生改變，引發(fā)蛋白尿[10]。有研究提出Nephrin的檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)腎小球疾發(fā)展的指標(biāo)[11]。CD2AP與Nephrin共同維護(hù)足細(xì)胞裂孔隔膜形態(tài)和功能的完整性[12]。CD2AP可結(jié)合黏附分子CD2，使CD2AP分子成簇，加強(qiáng)其在T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的接觸面積，從而影響細(xì)胞骨架的極性[13]。研究發(fā)現(xiàn)FSGS及ESRD患者中存在CD2AP基因突變[14]。腎病綜合征患者中CD2AP基因突變者表現(xiàn)為對(duì)激素依賴或激素抵抗[15]。CD2AP mRNA表達(dá)與24h蛋白尿定量、腎小球纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，可作為評(píng)估腎小球病變程度及預(yù)后的重要指標(biāo)[16]。

綜上，如能有效調(diào)控Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)的平衡，或可阻抑足細(xì)胞病變的進(jìn)展。本研究中，PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷第1周末，大鼠足細(xì)胞Nephrin、CD2AP表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，提示PAN腎病大鼠腎小球足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)受損。第6周末，腎蘇Ⅳ治療各組Nephrin、CD2AP表達(dá)均明顯強(qiáng)于模型組，提示腎蘇Ⅳ可有效修復(fù)PAN腎病大鼠足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中大鼠蛋白尿及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，可推測(cè)PAN腎病大鼠蛋白尿的出現(xiàn)與足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷密切相關(guān)，而通過促進(jìn)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷的修復(fù)可有效降低尿蛋白的排泄，阻抑PAN腎病大鼠足細(xì)胞損傷。

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(收稿2016-07-18；修回2016-07-29)

*國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81403333)

腎病/中醫(yī)藥療法 嘌呤霉素 @復(fù)方腎蘇Ⅳ 足細(xì)胞 大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

R692

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.055

△天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(天津300193)

▲通訊作者：天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(天津300193)