透骨消痛膠囊抑制脂多糖誘導軟骨細胞炎癥反應的機制研究

邵翔 陳后煌 陳達 馬玉環(huán) 鄭文偉 葉蕻芝 李西海

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·實驗研究·

透骨消痛膠囊抑制脂多糖誘導軟骨細胞炎癥反應的機制研究

邵翔 陳后煌 陳達 馬玉環(huán) 鄭文偉 葉蕻芝 李西海

目的 探討透骨消痛膠囊抑制脂多糖(LPS)誘導的軟骨細胞炎癥反應作用機制。方法 對4周齡雄性SD大鼠采用機械-Ⅱ型膠原酶消化法獲取膝關節(jié)軟骨細胞并進行體外培養(yǎng)，將軟骨細胞分為空白組、模型組以及透骨消痛膠囊組，空白組加入含10%胎牛血清(FBS)的低糖型Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM/LOW)2 mL，模型組加入含10 ng/mL LPS、10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL，透骨消痛膠囊組加入含10 ng/mL LPS、透骨消痛膠囊(300 μg/mL)、10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL。干預8 h后，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測各組微小RNA(miRNA)-140表達變化，免疫熒光觀察各組帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)4、基質金屬蛋白酶(MMP)-3表達變化，Image J分析各組平均光密度。結果 與空白組相比，模型組MMP-3表達升高(P<0.05)、ADAMTS4表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，透骨消痛膠囊組MMP-3表達下降(P<0.05)、ADAMTS4表達明顯下降(P<0.01)。與空白組相比，模型組軟骨細胞miRNA-140表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，透骨消痛膠囊組軟骨細胞miRNA表達明顯升高(P<0.05)。結論 透骨消痛膠囊能促進miRNA-140表達，降低ADAMTS4、MMP-3分泌，抑制炎癥反應介導的軟骨基質降解，從而延緩骨關節(jié)炎軟骨退變。

軟骨細胞；微小RNA-140；骨關節(jié)炎；基質金屬蛋白酶-3；炎癥反應

Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine1, Fuzhou 350122, China; College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine2, Fuzhou 350122, China; Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fujian University of Traditional Chinese Medicine3, Fuzhou 350122, China

骨關節(jié)炎(OA)是一種以軟骨退變、軟骨下骨重建異常、骨質增生為主要特征的慢性進行性關節(jié)疾病[1]，好發(fā)于老年且發(fā)病年齡呈低齡化趨勢[2]，隨著病程的進展，患者可出現功能障礙。炎癥反應在OA病程進展中起著至關重要的作用，炎性因子高表達可直接導致軟骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生軟骨基質降解、關節(jié)軟骨退變。微小RNA(miRNA)-140特異性表達于軟骨組織中，在OA軟骨中表達明顯降低[3]。OA屬中醫(yī)“痹癥”、“痿證”范疇，其核心病機為本痿標痹，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)則筋脈拘攣、關節(jié)不利，治療時應以補腎柔肝為主，輔以活血祛風。研究[4-6]顯示，福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院院內制劑透骨消痛膠囊(批準文號：閩制字Z20100006)可通過抑制軟骨細胞凋亡以增強其自噬作用，促進軟骨基質成分表達，從而保護關節(jié)軟骨，具有補腎柔肝、活血祛風的功效，臨床效果良好。本研究以大鼠軟骨細胞為研究對象，觀察經透骨消痛膠囊干預后軟骨細胞基質金屬蛋白酶(MMP)-3、帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)4、miRNA-140等表達變化，探討透骨消痛膠囊抑制OA炎癥反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為4周齡無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，體重200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供清潔級實驗動物環(huán)境設施。實驗動物處置按照2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》執(zhí)行。

1.2 實驗試劑與儀器

實驗試劑：透骨消痛膠囊(原方由巴戟天12 g、白芍12 g、川芎6 g和腫節(jié)風6 g組成)；脂多糖(LPS)、Ⅱ型膠原酶(美國sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、低糖型Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM/LOW)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；激光共聚焦培養(yǎng)皿(中國NEST公司)； MMP-3抗體、ADAMTS4抗體(美國Santa cruz公司)；Ⅱ型膠原抗體(美國abcam公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化試劑盒(中國博士德公司)；六孔板、細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)；熒光染料GOXRB ALEXA FLUOR 488、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國Thermo fisher公司)；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA-140引物、U6引物(美國Taqman公司)；白細胞介素(IL)-1β酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)；牛血清白蛋白(BSA)(中國碧云天公司)；封閉山羊血清(中國索萊寶公司)。

儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo fisher公司)；LX-800酶標儀(美國Bio-tek公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 軟骨細胞提取

取4周齡SPF級雄性SD大鼠雙側膝關節(jié)，無菌條件下取關節(jié)表面軟骨，置于無菌培養(yǎng)皿中PBS充分漂洗3次，使用手術刀片切成1 mm3方塊，再用PBS清洗1次，吸干殘液，加入0.2%Ⅱ型膠原酶4 mL，放入37℃的培養(yǎng)箱中消化，每隔2 h收集上清液并重新加入0.2%Ⅱ型膠原酶4 mL，上清液以1 000 rpm離心5 min，棄上清液，收集軟骨細胞沉淀，重復3次。用含10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基重懸軟骨細胞，接種于培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，48 h后倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞貼壁情況，隔天換液，待軟骨細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%后，進行傳代培養(yǎng)。采用Ⅱ型膠原免疫組化染色法對第2代軟骨細胞進行鑒定，軟骨細胞質內出現明顯棕黃色顆粒提示軟骨細胞提取成功。

1.4 實驗分組

將軟骨細胞分為空白組、模型組、透骨消痛膠囊組?？瞻捉M中加入含10%FBS的DMEM/LOW培養(yǎng)基 2 mL，模型組中加入含10 ng/mL LPS、10%FBS的DMEM/LOW 培養(yǎng)基2 mL，透骨消痛膠囊組中加入含10 ng/mL LPS、透骨消痛膠囊(分別為100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL)、10%FBS的DMEM/LOW 培養(yǎng)基2 mL。干預8 h后取軟骨細胞培養(yǎng)液，室溫下以3 000 rpm離心10 min，取細胞培養(yǎng)液。IL-1β是OA病程中最主要的炎性因子之一，其高表達會導致MMP、ADAMTS等表達升高，因此本實驗采用IL-1β作為檢測模型建立以及藥物干預濃度確立的指標。ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液中IL-1β水平可見，模型組IL-1β分泌量明顯高于空白組(P<0.01)，透骨消痛膠囊(300 μg/mL)組IL-1β分泌量明顯低于模型組(P<0.01)(圖1)。故本實驗透骨消痛膠囊組選取透骨消痛膠囊300 μg/mL聯合LPS 10 ng/mL進行干預。

圖1 各組軟骨細胞培養(yǎng)液中IL-1β水平

注：★表示與空白組相比，P<0.01；☆表示與模型組相比，P<0.01

1.5 免疫熒光檢測軟骨細胞MMP-3、ADAMTS4表達

將軟骨細胞4 × 104/mL接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，分組干預8 h后，無菌PBS沖洗3次，-20℃預冷，加無水甲醇4℃固定30 min，之后無菌PBS沖洗3次，加入0.25%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX)-100破膜10 min，PBS沖洗3次。加入含10%羊血清的5%BSA 2 mL作為封閉液室溫封閉1 h，移除培養(yǎng)皿內封閉液后分別加入MMP-3抗體(與封閉液體積比1∶100)或ADAMTS4抗體(與封閉液體積比1∶150)0.8 mL作為第一抗體，4℃過夜孵育， PBS漂洗4次后加入5 μg/mL山羊抗兔IgG(H+L)1.5 mL配合熒光染料作為第二抗體，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗4次，加入1 mg/mL的DAPI 1 mL，室溫避光孵育5 min，PBS漂洗5次后加入PBS 500 μL，分別于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.6 qPCR檢測軟骨細胞miRNA-140表達

將軟骨細胞4 × 104/mL接種于六孔板，分組干預8 h后PBS漂洗3次，加600 μL裂解/結合緩沖液(lysis/binding buffer)，反復吹打后轉移至1.5 mL離心(EP)管，加入60 μL miRNA勻漿液添加劑(microRNA homogenate additive)，混勻。加入苯酚-氯仿(體積比5∶1)溶液600 μL，混勻。室溫下以1 000 rpm離心5 min，將上層水相移入新EP管，加入上層水相體積1/3的100%乙醇，混勻。轉移至帶有濾筒的1.5 mL EP管，以10 000 rpm離心15 s，濾液中加入500 μL洗滌液(wash solution)，混勻。轉移至帶有濾筒的1.5 mL EP管，室溫下以10 000 rpm離心15 s。棄濾液，濾膜中央加50 μL洗滌液洗脫，檢測miRNA濃度。將提取的miRNA進行逆轉錄，逆轉錄產物按熒光定量試劑盒說明進行qPCR檢測。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 各組軟骨細胞MMP-3和ADAMTS4表達

在激光掃描共聚焦顯微鏡下，MMP-3、ADAMTS4陽性可見綠色熒光。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察干預后各組軟骨細胞MMP-3可見，空白組微量綠色熒光，模型組綠色熒光亮度明顯較強，透骨消痛膠囊組綠色熒光亮度稍低(圖2a～c)。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察干預后各組軟骨細胞ADAMTS4，各組軟骨細胞均可見綠色熒光，其中模型組綠色熒光亮度最強，空白組、透骨消痛膠囊組綠色熒光亮度稍低(圖2d～f)。Image J分析各組平均光密度，結果顯示模型組MMP-3表達高于空白組(P<0.05)且ADAMTS4表達明顯高于空白組(P<0.01)；透骨消痛膠囊組MMP-3表達低于模型組(P<0.05)且ADAMTS4表達明顯低于模型組(P<0.01)(圖2g、h)。

2.2 各組軟骨細胞miRNA-140表達

模型組軟骨細胞miRNA-140表達量低于空白組(P<0.05)；透骨消痛膠囊組軟骨細胞miRNA-140表達量高于模型組(P<0.05)；空白組與透骨消痛膠囊組軟骨細胞miRNA表達量之間未見明顯差異(圖3)。

3 討論

炎癥介導的軟骨穩(wěn)態(tài)失衡導致的軟骨退變是OA主要病理改變[7-8]。OA時，IL-1β可促進一氧化氮(NO)、MMP、ADAMTS等炎性因子產生，加速軟骨基質降解，導致關節(jié)軟骨破壞[9]。因此，本研究采用LPS誘導軟骨細胞分泌IL-1β建立體外炎癥軟骨細胞模型，預實驗結果顯示，使用10 ng/mL LPS誘導8 h后軟骨細胞可大量分泌IL-1β。

圖2 各組軟骨細胞MMP-3、ADAMTS4表達情況(×200) a.空白組軟骨細胞MMP-3表達情況 b. 模型組軟骨細胞MMP-3表達情況 c. 透骨消痛膠囊組軟骨細胞MMP-3表達情況 d. 空白組軟骨細胞ADAMTS4表達情況 e. 模型組軟骨細胞ADAMTS4表達情況 f. 透骨消痛膠囊組軟骨細胞ADAMTS4表達情況 g. 各組軟骨細胞MMP-3平均光密度統(tǒng)計分析 h. 各組軟骨細胞ADAMTS4平均光密度統(tǒng)計分析

注：★表示與空白組相比，P<0.05；☆表示與模型組相比，P<0.05；★★表示與空白組相比，P<0.01；☆☆表示與模型組相比，P<0.01

圖3 各組軟骨細胞miRNA-140表達情況

注：★表示與空白組相比，P<0.05；☆表示與模型組相比，P<0.05

MMP-3屬于MMP家族一員，具有降解多種膠原(包括Ⅱ型、Ⅹ型膠原等)及蛋白多糖的作用，同時還能促使其他MMP產生。關節(jié)軟骨中MMP-3表達明顯升高，可加快軟骨退變病理進程[10]。ADAMTS4具有降解聚蛋白多糖的作用[11]，在OA患者中表達量明顯升高[12]。本研究結果顯示，透骨消痛膠囊能降低LPS誘導的軟骨細胞MMP-3、ADAMTS4表達，提示其具有降低炎性因子表達、抑制軟骨基質降解、保護關節(jié)軟骨的作用。

miRNA-140特異性表達于軟骨組織中，在維持軟骨穩(wěn)態(tài)、調控軟骨分化及維持軟骨細胞功能等方面具有重要作用[13]，OA患者miRNA-140表達明顯降低。miRNA-140高表達可顯著抑制IL-1β產生，同時IL-1β可抑制miRNA-140的表達[14]，這與本研究結果一致。研究[15]發(fā)現，miRNA-140對于ADAMTS5、MMP-13有負反饋調節(jié)作用，可通過該作用維持關節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)。炎性因子與miRNA-140之間存在互相調節(jié)的作用，但其機制還有待于進一步研究。本研究結果顯示，透骨消痛膠囊可升高LPS干預建立的炎癥軟骨細胞模型miRNA-140表達量。

綜上，透骨消痛膠囊能促進miRNA-140表達，減少ADAMTS4、MMP-3分泌，抑制炎癥反應介導的軟骨基質降解，從而延緩OA軟骨退變。

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(收稿：2016-07-30；修回：2016-09-05)

(本文編輯：李圓圓)

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Mechanism of Tougu Xiaotong capsule inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in chondrocytes

SHAO Xiang1, CHEN Hou-huang1, CHEN Da1, MA Yu-huan2, ZHENG Wen-wei2, YE Hong-zhi3, LI Xi-hai1.

LIXi-haiE-mail:lixihai79dahai@163.com

Objective To explore the mechanism of Tougu Xiaotong capsule (TXC) inhibiting lipopolysaccharide (LPS)-stimulated inflammation in chondrocytes. Methods The chondrocytes harvested from the knee joints of 4-week-old SD rats were cultured in vitro and divided into 3 groups: the sham group, model group and TXC group. The sham group was cultured in 2 mL low-glucose Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM/LOW) containing 10% fetal bovine serum (FBS); the model group was cultured in 2 mL DMEM/LOW containing 10% FBS and 10 ng/mL LPS; the TXC group was cultured in 2 mL DMEM/LOW containing 10% FBS, 10 ng/mL LPS and 300 μg/mL TXC. After chondrocytes being treated for 8 h, the microRNA (miRNA)-140 expression was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), and the expressions of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS)4 and matrix metalloproteinase (MMP)-3 were observed by immunofluorescence staining, the average optical density of each group was analyzed by Image J. Results Compared with the sham group, the expression of MMP-3 (P<0.05) and ADAMTS4 (P<0.01) in the model group were significantly increased. Compared with the model group, the expression of MMP-3 (P<0.05)and ADAMTS4 (P<0.01) in the TXC group were significantly decreased. The expression of miRNA-140 in the model group was lower than that in the control group (P<0.01) and the TXC group (P<0.01). Conclusion TXC may delay the cartilage degeneration in osteoarthritis (OA) by promoting the expression of miRNA-140 to reduce the secretion of inflammatory cytokines such as ADAMTS4 and MMP-3 and thus inhibit the inflammation-mediated cartilage matrix degradation.

Chondrocyte; microRNA-140; Osteoarthritis; Matrix metalloproteinase-3; Inflammation

國家自然科學基金面上項目(81573998)、福建省自然科學基金(2016J01395) 、福建省中青年教師教育科研項目(科技A類)優(yōu)秀人才(JA14150)

350122， 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院(邵翔、陳后煌、陳達、李西海)； 350122， 福建中醫(yī)藥大學藥學院(馬玉環(huán)、鄭文偉)； 350122， 福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室(葉蕻芝)

李西海 E-mail: lixihai79dahai@163.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.014