何首烏提取物對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的影響

唐 靜，曾雅莉，何 婷

?

何首烏提取物對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的影響

唐 靜1，曾雅莉1，何 婷2*

目的 研究何首烏不同提取物對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血糖、胰島素抵抗及InsR基因表達(dá)的影響。方法 高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔內(nèi)注射小劑量四氧嘧啶制造糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，分別用二甲雙胍、何首烏水提物、何首烏乙醇提取物、何首烏正丁醇提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察給藥前后大鼠空腹血糖、血清胰島素水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)，采用RT-PCR法測(cè)定肝細(xì)胞膜InsR mRNA基因表達(dá)情況。結(jié)果 三組何首烏提取物的血糖、FINS、HOMA-IR水平較模型組顯著下降(P<0.01)，ISI水平顯著上升(P<0.01)；肝細(xì)胞膜上InsR基因表達(dá)量上升。結(jié)論 何首烏提取物改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，可能與上調(diào)InsR基因表達(dá)量有關(guān)。

何首烏提取物；糖尿?。谎?；胰島素抵抗；InsR

0 引言

胰島素抵抗是影響2型糖尿病進(jìn)程和發(fā)展的主要病理因素之一[1]。胰島素受體(Insulin receptor,InsR)基因分布較廣，如脂肪、肝臟、骨骼肌等。胰島素發(fā)揮其功能必須以InsR為介導(dǎo)，細(xì)胞InsR數(shù)目減少,胰島素與胰島素受體結(jié)合能力減低[2-3]，可引起血糖升高。何首烏是蓼科蓼族何首烏PolygonummultiflorumThumb.的干燥塊根，具有解毒(截瘧)、消癰、潤(rùn)腸通便的功效[4]。陳俊等[5]研究顯示，制何首烏可以降低糖尿病大鼠的血糖，抑制胰島細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔內(nèi)注射小劑量四氧嘧啶的方法，建立大鼠的糖尿病胰島素抵抗模型，分別用二甲雙胍、何首烏水提物、何首烏乙醇提取物、何首烏正丁醇提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察給藥前后大鼠空腹血糖、血清胰島素水平，計(jì)算HOMA-IR、ISI，并從InsR基因表達(dá)角度探討何首烏提取物改善胰島素抵抗的機(jī)制，為何首烏進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 何首烏生藥(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司)；二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；葡萄糖(GLu)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；75%乙醇為中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，Trizol試劑購(gòu)自nvitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TAKARA公司。

1.2 儀器 血糖儀one touch(強(qiáng)生中國(guó))，R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BuChi公司)，ADVIA2400型全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子)，EDC-810型PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠SPF級(jí)，雌雄各半[武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2014-0004]，高脂飼料(配方:10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、1%膽固醇、74%常規(guī)飼料)。

1.4 何首烏提取物的制備 取何首烏生藥5 kg，洗凈、陰干、切片，用蒸餾水加熱回流提取3次，每次回流時(shí)間2 h，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮至干，得何首烏水提物，臨用前稀釋至一定濃度(10 g/kg)后備用。再取5 kg藥材，按文獻(xiàn)[6]方法提取，濃縮至0.5 mL/g后，向其中加入95%乙醇至溶液中含醇量為70%，虹吸上清液，沉淀減壓抽濾后得何首烏醇提物，稀釋至一定濃度(10 g/kg)后備用；將上清液加入正丁醇萃取，回收，至干，稀釋至一定濃度(10 g/kg)后，得何首烏正丁醇提取物，備用。

1.5 大鼠糖尿病模型的建立及分組 取健康SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，除正常組外，其余組高脂喂養(yǎng)，4周后，于腹腔注射現(xiàn)配四氧嘧啶溶液，于30 s內(nèi)注射完，連續(xù)注射2 d[7](第1天劑量為120 mg/kg，第2天劑量為100 mg/kg)，末次注射后第3天測(cè)定血糖情況(隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L作為糖尿病模型成功的標(biāo)志[8])。造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、何首烏水提組、何首烏醇提組、何首烏正丁醇組。除正常組飼以基礎(chǔ)飼料外,其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常組與模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃喂養(yǎng)6周。于末次給藥后禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，取血測(cè)定FPG、FINS，計(jì)算ISI、HOMA-IR。ISI=IN[1/(FPG×FINS)]，HOMA-IR=(FRG×FINS)/22.5]，處死后，留取肝臟組織進(jìn)行相關(guān)研究。

1.6 RT-PCR檢測(cè)mRNA Trizol法提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)Real-time PCR引物(表1)，采用RT-PCR法，檢測(cè)各組大鼠肝臟內(nèi)InsR的表達(dá)。應(yīng)用2-ΔΔCt方法對(duì)InsR mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，即處理組基因表達(dá)水平相對(duì)于正常組的變化倍數(shù)為2-ΔΔCt倍[9]，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析(表1)。

表1 PCR引物序列表

2 結(jié)果

2.1 何首烏提取物對(duì)大鼠血糖的影響 給藥0周時(shí)，與正常組相比，其余各組大鼠血糖、胰島素水平增加明顯，表明其已發(fā)生糖尿病胰島素抵抗。給藥6周后，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和何首烏提取物各組血糖均出現(xiàn)下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；三組何首烏提取物之間的降糖療效比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這說(shuō)明三組何首烏提取物療效相近，均可在一定程度上降低糖尿病大鼠血糖水平。見(jiàn)表2、表3。

2.2 何首烏提取物對(duì)大鼠FINS、HOMA-IR、ISI的影響 連續(xù)給藥6周后，陽(yáng)性對(duì)照組、三組何首烏提取物組2型糖尿病胰島素抵抗大鼠FINS、HOMA-IR水平較模型組顯著下降(P<0.01)、ISI水平顯著上升(P<0.01)；且何首烏醇提物組與陽(yáng)性對(duì)照組在控制FINS、HOMA-IR、ISI水平上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明其改善胰島素抵抗的療效與二甲雙胍相當(dāng)，而水提、正丁醇提取物在改善胰島素抵抗方面與二甲雙胍有一定的差異。見(jiàn)表3、表4。

表2 何首烏提取物對(duì)血糖的影響(mmol/L)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

表3 何首烏提取物對(duì)胰島素的影響(mIU/L)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

2.3 何首烏提取物對(duì)InsR基因表達(dá)的影響 不同組別擴(kuò)增出來(lái)的內(nèi)參β-actin表達(dá)一致，說(shuō)明整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系正常(圖1)。在給藥6周后，與正常組相比，模型組InsR基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組及何首烏各給藥組與模型組相比均能使大鼠的InsR mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、圖3)。

表4 何首烏提取物對(duì)HOMA-IR、ISI的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

圖1 RT-PCR β-actin表達(dá)圖

注：1.DL2000,2.正常組,3.模型組,4.陽(yáng)性對(duì)照組,5.何首烏水提組,6.何首烏醇提組,7.何首烏正丁醇組

圖2 RT-PCR InsR表達(dá)圖

注：1.DL2000,2.正常組,3.模型組,4.陽(yáng)性對(duì)照組,5.何首烏水提組,6.何首烏醇提組,7.何首烏正丁醇組

圖3 何首烏提取物對(duì)大鼠肝細(xì)胞膜InsR mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

注：與正常組比較，*P<0.05

3 討論

我國(guó)2013年糖尿病的患病人數(shù)為9 840萬(wàn)，居全球首位，預(yù)計(jì)到2035年我國(guó)的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到1.43億。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要原因之一[10]。在正常機(jī)體組織中，細(xì)胞膜上的胰島素受體與胰島素結(jié)合非常敏感。由于肥胖等原因造成細(xì)胞膜上的胰島素受體功能下降或者數(shù)量減少，使胰島素不能與受體正常結(jié)合，導(dǎo)致胰島素不能發(fā)揮應(yīng)有的作用，就會(huì)發(fā)生胰島素抵抗[11]。

本研究以高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠引起大鼠高脂血癥、高胰島素血癥。采用四氧嘧啶腹腔注射造模，因一次性大劑量腹腔注射造模方法成活率較低[7]，改為兩次給藥造模。造模后，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR升高，ISI降低，說(shuō)明2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型造模成功。

李奇等[12]采用水提法、醇提法等7種方法制備的何首烏提取物均含有二苯乙烯苷類、沒(méi)食子酸類、蘆薈大黃素類、大黃酸類、大黃素類化合物，只是含量不同。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3種不同提取工藝，證實(shí)何首烏提取物均能有效降低糖尿病大鼠的血糖水平，且能改善胰島素抵抗。

InsR是一種跨膜的大分子糖蛋白[13]，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始部位，其表達(dá)水平直接影響胰島素的生物學(xué)效應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病胰島素抵抗的大鼠模型中，血糖升高，InsR基因表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，在給予何首烏提取物治療后，血糖水平逐漸下降，InsR基因表達(dá)量上調(diào)，且三組何首烏提取物在增強(qiáng)InsR基因表達(dá)量上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陳紹文等[15]發(fā)現(xiàn)，采用何首烏生品大鼠灌胃后，何首烏中有相當(dāng)數(shù)量成分在大鼠體內(nèi)快速代謝或者反應(yīng)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，提示何首烏中可能存在某類成分或代謝產(chǎn)物，能改善胰島素抵抗，且有效成分在三組提取物中均存在，可能只是含量存在差異，且以何首烏醇提物組內(nèi)成分含最較高，這類物質(zhì)或代謝產(chǎn)物均能通過(guò)上調(diào)靶組織內(nèi)InsR基因表達(dá)水平，改善該組織對(duì)胰島素的敏感程度，降低血糖。

綜上所述，我們初步認(rèn)為，何首烏提取物通過(guò)上調(diào)糖尿病大鼠肝臟組織InsR基因表達(dá)水平，促進(jìn)葡萄糖的攝取與利用，降低血糖，提示何首烏提取物在改善胰島素抵抗方面可能會(huì)有一定的療效。但其改善胰島素抵抗的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

[1]Sharabi K,Tavares CD,Rines AK,et al.Molecular pathophysiology of hepatic glucose production[J].Mol Aspects Med,2015,46:21-33.

[2]Belfiore A,Frasca F,Pandini G,et al.Insulin receptor isoforms and insulin receptor/insulin-like growth factor receptor hybrids in physiology and disease[J].Endocr Rev,2009,30(6):586-623.

[3]莊天微,喬虹.Gas6、C1q、INSR基因與2型糖尿病相關(guān)性的新發(fā)現(xiàn)[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2014,(3):843-844.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:174-175.

[5]陳俊,李興,朱麗英,等.制何首烏對(duì)鏈脲佐菌素糖尿病大鼠降血糖作用及其機(jī)制探討[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2015,(1):52-55.

[6]相聰坤,王蕊,袁志芳.何首烏二苯乙烯苷類提取物對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用[J].中國(guó)藥業(yè),2009,24(24):19-20.

[7]梁沛余,尹磊晶,華欠桑多,等.多次給藥法建立四氧嘧啶糖尿病大鼠模型的研究[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,(4):276-279.

[8]中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中國(guó)糖尿病雜志,2014,(8):2-42.

[9]張捷平,秦崇濤,余文珍,等.金匱腎氣丸對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌胰島素受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,(22):165-168.

[10]國(guó)際糖尿病聯(lián)盟.糖尿病地圖[EB/OL].http://news.medlive.cn/uploadfile/20140811/14077559313748.pdf,2013.

[11]丁寧,劉國(guó)旗,遲丹,等.抵當(dāng)湯對(duì)胰島素抵抗大鼠胰島素受體及胰島素樣生長(zhǎng)因子的影響[J].中藥藥理與臨床,2013,(3):5-8.

[12]李奇,王伽伯,肖小河,等.何首烏不同提取物清除羥自由基的活性研究[J].中國(guó)藥房,2013,(19):1760-1762.

[13]Ebina Y,Ellis L,Jarnagin K,et al.The human insulin receptor cDNA:the structural basis for hormone-activated transmembrane signalling[J].Cell,1985,40(4):747-758.

[14]孫芳.黃芪多糖對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟InsR及其底物IRS-2表達(dá)的影響[D].新鄉(xiāng):新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,2012.

[15]陳紹文,劉貞,喻小明.何首烏生品及炮制品的大鼠血藥指紋圖譜比較研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,(1):36-39.

Effect of polygonum multiflorum extract on insulin-resistant rats with type 2 diabetes

TANG Jing1，ZENG Ya-li1，HE Ting2*

(1.Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China；2.The No.3 Hospital of Wuhan,Wuhan 430060,China)

Objective To study the effects of different extracts from polygonum multiflorum on glucose,insulin-resistance and InsR gene expression in rats with insulin-resistant diabetes.Methods The diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of a small dose of alloxan and were fed with high-fat diet.The rats were divided into different groups and were given metformin,water extract,ethanol extract,n-butyl alcohol extract from polygonum multiflorum.The glucose and fasting insulin (FINS) was measured before and after administration,and the homeostasis model assessment-insulin resistance (HOMA-IR) index and insulin sensitive index(ISI) were calculated.The expression levels of insulin receptor (InsR) mRNA were detected by PCR.Results Compared with control group,three different extracts from polygonum multiflorum reduced the glucose,FINS and HOMA-IR (P<0.01),elevated the ISI (P<0.01),and increased the expression of InsR.Conclusion Three different extracts from polygonum multiflorum obviously improve the insulin resistance by increasing the expression of InsR mRNA.

Polygonum multiflorum extract；Diabetes；Blood glucose；Insulin resistance；InsR

2016-05-19

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院,武漢 430077；2.武漢市第三醫(yī)院藥劑科,武漢 430060

華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新基金(2014QN072)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611004

*通信作者