核糖體蛋白RPL15多克隆抗體的制備與細胞內定位

梁爽爽，冀美超，胡曉晴，付成華，朱長軍，董智雄

（天津師范大學 a.生命科學學院；b.天津市動植物抗性重點實驗室；c.分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室，天津 300387）

核糖體蛋白RPL15多克隆抗體的制備與細胞內定位

梁爽爽，冀美超，胡曉晴，付成華，朱長軍，董智雄

（天津師范大學 a.生命科學學院；b.天津市動植物抗性重點實驗室；c.分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室，天津 300387）

為了解核糖體大亞基蛋白RPL15在細胞中的定位和功能，設計并合成了RPL15蛋白的多肽，作用于抗原免疫兔子，使其產生特異性多克隆抗體，利用蛋白免疫印跡和免疫熒光方法檢測RPL15抗體的特異性.結果證實本研究成功制備并純化了RPL15的多克隆抗體，且該抗體可以特異性識別RPL15蛋白.免疫熒光實驗表明RPL15定位于細胞質和細胞核中，主要定位于核仁并呈點狀分布，且與UBF、FBL和C23存在部分共定位.

RPL15；核糖體；多克隆抗體；免疫熒光；細胞內定位

核糖體大亞基蛋白RPL15（ribosomal protein L15）隸屬于Pfam00827家族，其cDNA包含759個核苷酸，能夠編碼204個氨基酸，蛋白分子質量約為24×103（24 kDa）[1].關于RPL15蛋白在細胞中的定位，Simoff等[2]和Klein等[3]發(fā)現(xiàn)在酵母細胞中該蛋白與Nop1蛋白共定位于核仁，且60%以上的部分與核仁的23S rRNA核苷酸序列結合，表明RPL15蛋白可能參與酵母細胞核糖體的早期組裝過程；Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)食道癌細胞中RPL15蛋白存在過表達現(xiàn)象，且參與47S prerRNA中ITS1位點的有效切割過程，從而也證實了該蛋白參與核糖體RNA的加工過程.RPL15蛋白與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關.Landowski等[5]發(fā)現(xiàn)在先

天再生障礙性貧血癥細胞中RPL15基因缺失；Wang等[6]發(fā)現(xiàn)在多個胃癌細胞株（AGS、MKN45、MKN28、SGC7901和KATOⅢ）中RPL15的表達量較高，抑制RPL15的表達就可以抑制SGC7901細胞株的生長[7]，RPL15蛋白這種促進癌細胞增殖的作用使其有可能成為抗癌治療的潛在靶標.

RPL15蛋白在核糖體生物合成及疾病發(fā)生過程中具有多種重要功能，但其具體作用機制尚不清楚，該蛋白在細胞對內外刺激應答過程中的作用也需闡明.本研究將RPL15抗原注入兔子體內提取RPL15多克隆抗體，并且明確其在細胞內的定位.這有助于闡明該蛋白分子的生物學功能及分子機制，為其作為疾病的診斷蛋白標記物奠定實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞

人宮頸癌細胞株HeLa為天津師范大學分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室所有.

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Hyclone公司；特異性單克隆鼠抗Tubulin抗體，美國Sigma公司；特異性單克隆鼠抗UBF抗體，美國Santa Cruz公司；特異性單克隆鼠抗Nucleolin（C23）和Fibrillarin（FBL）抗體，英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔和山羊抗鼠，美國Immuno公司；Opti-MEM、Tuberfect和抗體純化試劑盒，美國Thermo Scientific公司.

1.1.3 主要儀器

蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 方法

1.2.1 RPL15抗原多肽序列的設計

設計RPL15抗原的多肽序列：Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Ala-Trp-Arg-Arg-Arg-Asn-Thr-Leu-Gln-Leu-His-Arg-Tyr-Arg，由昂泰生物科技有限公司合成該多肽.

1.2.2 RPL15抗原的制備

在2 mL的PBS（pH6.0）中加入134 μL的鑰孔血藍蛋白（KLH），邊攪拌邊緩慢加入200 μL的質量濃度為30 mg/mL的乙酸湖泊亞胺酯（MBS），充分混勻.將提前準備好的G-25交聯(lián)葡聚糖珠子加入Bio-Rad柱中，用50 mL的PBS（pH 7.4）平衡柱子.將KLH和MBS的混合液加入柱中，用pH 7.4的PBS洗脫，同時用1.5 mL的離心管收集液體，每管收集1 mL.用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質的濃度，選取濃度高的3管液體混合，與100 mg的RPL15抗原多肽交聯(lián)，攪拌1 h.用pH 7.4的PBS透析12 h，分裝液體，于-80℃下保存?zhèn)溆?

1.2.3 抗原免疫兔子和血清的制備

首先抽取兔子的免疫前血清（pre-bleed），1周后對其進行免疫注射RPL15抗原.將RPL15抗原與弗氏完全佐劑（體積比為1∶1）充分混勻.每只兔子第1次免疫需200 μg，即2 mL（1 mL弗氏完全佐劑+1 mL RPL15抗原）抗原.將混勻的2 mL抗原在兔子背部進行皮下注射（共12～15個點）.2周后進行第2次免疫注射，從本次開始抗原量降至100 μg，弗氏完全佐劑換為弗氏不完全佐劑.1周后進行第3次免疫注射.從第4周開始抽取血清，用10 mL注射器從兔子耳緣動脈抽取血漿，置于15 mL離心管中，于4℃下放置2～3 d，10 621 r/min離心30 min，上清液即為血清，將其分裝在2 mL離心管中，于-80℃下保存.

1.2.4 RPL15血清抗體的純化

將5 mg的RPL15多肽溶解在100 μL的PBS中，取10 μL加入到1 mL的coupling buffer中，剩余部分加入50 μL的TCEP，室溫孵育30 min.將1 mL的coupling buffer過Bio-Rad柱，重復2次，加TCEP溶液到柱中，室溫孵育45 min，收集流下的液體.用1 mL的PBS洗柱，重復3次，用1 mL的coupling buffer洗柱，重復1次.向柱中加入1 mL的Cysein·HCl溶液，室溫混合15 min，棄去液體，用6 mL的PBS平衡Bio-Rad柱.用10 mL的PBS稀釋5 mL血清，于4℃、8 000 r/min下離心15 min，取上清.將上清過柱3次，用10 mL的PBS洗柱.用1 mL的elution buffer洗脫抗體，1.5 mL離心管收集，加入質量分數(shù)為0.05%的疊氮鈉后于4℃下保存.

1.2.5 細胞培養(yǎng)及傳代

采用含有10%（體積分數(shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌細胞株HeLa，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%.HeLa為貼壁生長細胞，每周傳代2～3次，傳代時先用胰酶消化細胞，再擴增細胞至新鮮培養(yǎng)基中.

1.2.6 質粒轉染

在24孔細胞培養(yǎng)皿中以每孔5×104的數(shù)量鋪入HeLa細胞，24 h后轉染pEGFP和pEGFP-RPL15質粒.將100 μL的Opti-MEM、200 ng質粒和1 μL的Tuberfect混勻，15 min后將混合液加入到培養(yǎng)的細胞中，24 h后通過觀察熒光情況確定其轉染效率.

1.2.7 小分子干擾RNA（siRNA）轉染

在24孔細胞培養(yǎng)皿中以每孔1×104的數(shù)量鋪入HeLa細胞，24 h后轉染RPL15的siRNA.將100 μL

的Opti-MEM、50 nmol/L的RPL15 siRNA和1 μL的Tuberfect混勻，15 min后將混合液加入細胞培養(yǎng)基中，72 h后收集細胞.利用蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）檢測RPL15的干涉效率.

1.2.8 免疫共沉淀（immunoprecipitate，IP）實驗

收集1×106個HeLa細胞，用冰冷的PBS洗1次，加500 μL的RIPA Buffer（體積分數(shù)為1%的NP-40+質量分數(shù)為1%的脫氧膽酸鈉+質量分數(shù)為0.1%的SDS+ 150 mmol/L的NaCl+10 mmol/L的Na3PO4+50 mmol/L的NaF+2 mmol/L的EDTA+0.2 mmol/L的Na3VO3）裂解細胞，冰上靜置1 h，4℃、20 817 r/min下離心30 min.取出上清，平均分為2管，一管中加0.5 μL的免疫前血清（pre-bleed serum），另一管中加0.5 μL的免疫后血清（anti-RPL15 serum），于4℃搖床上搖4 h.每管裂解液中分別加入10 μL的protein A beads混合液，于4℃搖床上搖2 h.4℃、15 294 r/min下離心2 min.棄去上清，用800 μL的RIPA Buffer洗beads，15 294 r/min離心2 min，重復2次.棄去上清，加入25 μL的SDS上樣緩沖液，進行蛋白免疫印跡分析.

1.2.9 蛋白免疫印跡

細胞裂解液經SDS-PAGE電泳分離后，將RPL15蛋白（一抗抗體）轉至PVDF膜上，用質量分數(shù)為5%的脫脂奶粉/TBS封閉30 min，在質量分數(shù)為3%的脫脂奶粉/TBST中孵育，室溫雜交2 h，TBST洗3次，每次5 min.再加入對應的二抗抗體室溫雜交1 h，TBST洗3次，每次5 min，在PVDF膜上加ECL和H2O2，室溫孵育2 min，曝光.

1.2.10 細胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）觀察

向鋪有細胞爬片的24孔板中以每孔3×104的數(shù)量接種細胞，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h之后，每孔用500 μL的PBS洗3次，每次5 min.棄去PBS，用500 μL的甲醇丙酮（甲醇和丙酮的體積比為1∶1）混合液固定細胞3 min.棄去固定液，用500 μL的PBS洗3次，每次5 min.將爬片小心取出后各加100 μL的封閉液（體積分數(shù)為5%的山羊血清+體積分數(shù)為0.4%的Triton X-100+PBS），室溫封閉30 min.棄去封閉液，用500 μL的PBS洗1次，5 min后棄去PBS，加入50 μL用PBS-TX（含體積分數(shù)為0.4%的Triton X-100的PBS溶液）稀釋的一抗稀釋液（一抗和PBS-TX的體積比為1∶300），室溫孵育2 h.棄去一抗稀釋液，用200 μL的PBS-TX洗3次，每次5 min.棄去PBS-TX，加入50 μL用PBS-TX稀釋的熒光標記的二抗稀釋液（二抗和PBS-TX的體積比為1∶500），室溫避光孵育1 h.棄去二抗稀釋液，加入50 μL用PBS-TX稀釋的DAPI（DAPI和PBS-TX的體積比為1∶600），染色3 min.棄去DAPI，用200 μL的PBS-TX洗3次，每次5 min.棄去PBS-TX，在載玻片上滴上4 μL抗淬滅劑，將片子取出后細胞面向下放在滴有抗淬滅劑的載玻片上，用指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察.

2 結果

2.1 免疫共沉淀檢測RPL15抗體的特異性

用獲得的兔子免疫前血清和免疫后RPL15血清進行免疫沉淀-免疫印跡檢測（IP-Western），結果如圖1所示.

圖1 蛋白免疫共沉淀實驗檢測RPL15抗體Fig.1 Detection of RPL15 antibody by immunoprecipitation experiment

由圖1可以看出，免疫前血清（prebleed）中未檢測到RPL15條帶；免疫后血清（anti-RPL15 serum）在分子質量為24×103（24 kDa）的位置檢測到了特異性的RPL15條帶，證實本研究成功獲得了RPL15抗體.

2.2 RPL15 siRNA敲降后RPL15蛋白的表達

為了進一步檢測RPL15抗體的特異性，本研究設計并合成了特異性靶向RPL15的小分子干擾RNA（siRNA）序列，通過轉染的方法敲降RPL15蛋白.對細胞裂解液進行Western Blot分析，結果如圖2所示.

圖2 RPL15 siRNA敲降內源RPL15蛋白Fig.2 Knockdown of RPL15 protein by RPL15 siRNA

由圖2可以看出，與對照組相比，RPL15的siRNA敲降后檢測不到RPL15條帶，即本研究獲得的RPL15抗體能夠被siRNA降解，從而驗證了RPL15抗體具有特異性.

2.3 RPL15抗體對外源RPL15蛋白的識別

在人宮頸癌細胞株HeLa中轉染外源pEGFP-C1和pEGFP-RPL15質粒.轉染24 h后，用全細胞裂解液裂解Hela細胞，并對其進行Western Blot（WB）分析，結果如圖3所示.由圖3可以看出，綠色熒光蛋白（GFP）抗體可以檢測到GFP和GFP-RPL15融合蛋白，本研究自制的RPL15抗體可以檢測到GFP-RPL15融合蛋白.由此確定RPL15抗體可以特異性地識別內源和外源RPL15蛋白.

2.4 RPL15的細胞內定位

對得到的RPL15抗體進行純化，以核仁蛋白UBF、 FBL和C23為參照物，將其與RPL15共染色，免疫熒光實驗結果如圖4所示.

圖3 HeLa細胞轉染外源pEGFP-C1和pEGFP-RPL15質粒Fig.3 HeLa cells transfected with plasmids expressing pEGFP-C1 and pEGFP-RPL15

圖4 細胞免疫熒光技術鑒定RPL15蛋白的定位Fig.4 Appraisal RPL15 protein localization by cell immunofluorescence technique

由圖4可以看出，RPL15定位于細胞質和細胞核內，主要定位于核仁并呈點狀分布，且與UBF、FBL和C23存在部分共定位.

3 討論與結論

在很多癌癥中，核糖體蛋白除參與蛋白質合成外還具有其他功能，包括抑制或誘導腫瘤發(fā)生、調節(jié)基因特異性表達、參與DNA修復、凋亡或促進癌細胞增殖和產生抗藥性等[8-12].如在非小細胞肺癌中，RPS29通過下調Bcl-2、Bcl-XL、survivin和上調p53誘導細胞凋亡[13].與正常細胞比較，在癌細胞中一些核糖體蛋白的表達量出現(xiàn)變化，如在直腸癌中，S8、S12、S18、S24、L13a、L18、L28、L32和L35a表達量降低，而S11和L7的表達量明顯上調[14]；在肝癌中，S8、L12、L23a、L27和L30的mRNA表達水平上調；在肺癌和口腔癌中，RPL14蛋白的表達失效[15].這些結果表明在癌癥發(fā)生過程中核糖體蛋白的表達量出現(xiàn)變化是一個普遍現(xiàn)象.在腫瘤細胞中很多核糖體蛋白在p53-HDM2路徑中發(fā)揮作用，如RPL5、RPL11或RPL23等過表達，這些核糖體蛋白與E3泛素連接酶MDM2結合，阻止后者對p53的降解作用，造成p53的積累和活化[16-20]，最終導致細胞周期的G1期出現(xiàn)阻滯[21].

本研究制備了核糖體大亞基蛋白RPL15的多克隆抗體，免疫熒光方法表明該蛋白主要定位于細胞核的核仁部位，呈點狀分布，并且與UBF、FBL和C23有部分共定位.RPL15在核仁中的定位有利于核仁結構的形成和維持，也可能參與成熟rRNA的形成過程. RPL15可以促進胃癌細胞的生長，因此可作為胃癌診斷的潛在標記物.RPL15影響細胞生長的具體分子機制尚沒有明確報道，因此需要進一步對RPL15進行功能研究，探討RPL15是否也是通過RPs-MDM2-p53路徑影響細胞生長.

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（責任編校 紀翠榮）

Preparation and localization of ribosomal protein RPL15 polyclonal antibody

LIANG Shuangshuang，JI Meichao，HU Xiaoqing，F(xiàn)U Chenghua，ZHU Changjun，DONG Zhixiong
（a.College of Life Sciences，b.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，c.Key Laboratory of Molecular and Cellular Systems Biology，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To learn the location and function of the ribosomal large subunit protein RPL15 in cells，the peptide of RPL15 protein acting as the antigen to immune rabbit was designed and synthesized to produce the polyclonal antibody.The specificity of RPL15 antibody was detected by Western blot and immunofluorescence.The results confirmed that the RPL15 polyclonal antibody was prepared and purified successfully，and the antibody can identify RPL15 protein specifically.Immunofluorescence showed that RPL15 protein was located in cytoplasm and nuclei，mainly in the nucleolus and dotted distribution. Furthermore，the partially co-localization was obtained between RPL15 with UBF，F(xiàn)BL and C23.

RPL15；ribosome；polyclonal antibody；immunofluorescence；localization in cell

Q291

A

1671-1114（2016）05-0055-05

2016-02-15

國家自然科學基金面上資助項目（31271485）；2011年教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”資助項目（NCET-11-1066）；國家自然科學基金青年基金資助項目（31301138）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點資助項目（12JC2DJC21400）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃一般資助項目（14JCYBJC24200）；天津市中小企業(yè)科技創(chuàng)新基金資助項目（14ZXCXSY00121）；天津師范大學中青年教授學術創(chuàng)新推進計劃資助項目（52XC1001）；天津師范大學“渤海學者”基金資助項目（5RL092）；天津師范大學博士基金資助項目（52XB1104）.

梁爽爽（1990—），女，碩士研究生.

董智雄（1984—），男，講師，主要從事分子細胞生物學方面的研究.