基于凝膠型陰離子交換樹脂的齊墩果酸純化工藝

楊裕啟，劉遠(yuǎn)河，王 燦，張南海，黃齊紅，黎云磊，吳一微

(1.湖北師范大學(xué)，湖北 黃石 435002；2.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435001)

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基于凝膠型陰離子交換樹脂的齊墩果酸純化工藝

楊裕啟1，2，劉遠(yuǎn)河2，王 燦2，張南海2，黃齊紅2，黎云磊2，吳一微1

(1.湖北師范大學(xué)，湖北 黃石 435002；2.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435001)

采用凝膠型陰離子交換樹脂純化從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品，通過單因素實驗、正交實驗優(yōu)化了純化工藝條件。確定最優(yōu)純化工藝條件為：樹脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在此工藝條件下，所得齊墩果酸含量大于98%、回收率大于96%。

齊墩果酸；凝膠型陰離子交換樹脂；純化

齊墩果酸(oleanolicacid，OLA)，又名慶四素，是一種生物活性物質(zhì)，為一種五環(huán)三萜類化合物[1]。由于具有調(diào)節(jié)免疫功能、消炎、保肝護腎、抑制血小板凝集、降低血脂、血糖和抗病毒等多種生物活性，齊墩果酸及其衍生物的開發(fā)利用受到研究人員的關(guān)注，臨床上齊墩果酸被用于治療急性黃膽型和慢性中毒型肝炎，具有較好的療效[1-4]。

自然條件下，齊墩果酸廣泛存在于植物體內(nèi)，其中以女貞子果皮的含量較高。迄今，人們發(fā)明了一些較為成熟的齊墩果酸提取純化工藝，如乙醇浸提法[5]、大孔樹脂吸附法[6]和大孔陰離子交換樹脂提取法[7]。用乙醇浸提法從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品，含有較多的脂溶性雜質(zhì)，需要經(jīng)過重結(jié)晶、酸堿處理等步驟進(jìn)一步純化，較為繁瑣。用大孔樹脂吸附法和在此基礎(chǔ)上發(fā)展的大孔陰離子交換樹脂法提取純化齊墩果酸的新方法，一步制備的齊墩果酸含量達(dá)98%，但大孔陰離子交換樹脂價格昂貴，且吸附性能不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種效果穩(wěn)定、快速簡便、成本較低的天然齊墩果酸純化工藝十分必要。凝膠型陰離子交換樹脂沒有空隙結(jié)構(gòu)，機械強度大，使用壽命長，價格便宜，適合在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。作者采用凝膠型陰離子交換樹脂取代大孔陰離子交換樹脂，對從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品進(jìn)行純化，克服了現(xiàn)有方法的不足，收到了較好的效果。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

女貞子(Ligustrum lucidumAit)新鮮成熟果實采集于湖北理工學(xué)院校園內(nèi)。

201x7型強堿性苯乙烯系凝膠型陰離子交換樹脂，武漢金漢都化?？平虄x器有限公司；齊墩果酸對照品，98%，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞試劑均為分析純。

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JA31002型精密電子天平、D2F-6050型真空干燥箱，上海申光儀器儀表有限公司；TENSOR27型傅立葉變換紅外光譜儀，德國布魯克科技有限公司；40～120目分樣篩，東西湖科宇化驗設(shè)備行。

1.2 齊墩果酸粗品的制備

參照文獻(xiàn)[8]方法，將新鮮女貞子搗碎至皮仁分離后，用流水漂洗，收集果皮于80 ℃干燥后，按料液比1∶4(g∶mL)加入95%乙醇回流提取3次，每次1.0 h；合并提取液，按體積比1∶1加入石油醚萃取除去脂溶性雜質(zhì)，乙醇層減壓回收乙醇至漿狀，加入純化水洗滌，過濾，濾餅80 ℃干燥，即得齊墩果酸粗品。

1.3 齊墩果酸粗品的純化

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

市售的凝膠型陰離子交換樹脂比表面積小，交換容量不足。為此，本實驗先將凝膠型陰離子交換樹脂粉碎，使其顆粒變小，以提高其比表面積和離子交換容量。將粉碎的陰離子交換樹脂過篩分級，取25 mL裝柱，依次用10%氫氧化鈉溶液、10%鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液浸泡1.0 h，用純化水沖洗至中性備用。

1.3.2 齊墩果酸的純化

取2.0000 g齊墩果酸粗品溶解于30 mL 95%乙醇，上柱吸附1.0 h，先用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗滌至洗脫液無色，再用2.0%氫氧化鈉乙醇溶液洗脫(約30滴·min-1)，收集至洗脫液由亮黃色變成無色。洗脫液加10%鹽酸溶液調(diào)pH值至弱酸性(pH值6.5)，真空減壓濃縮成漿狀，純水洗滌后，減壓抽濾，濾餅于80 ℃干燥至恒重，即得齊墩果酸精品。

1.4 純化條件的優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

1)樹脂粒度的影響

取40目、60目、80目、100目、120目的陰離子交換樹脂顆粒，按1.3方法進(jìn)行齊墩果酸粗品的純化實驗，過程中保持吸附和洗脫溫度為10 ℃，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，考察不同樹脂粒度對齊墩果酸回收率和含量的影響。

2)吸附和洗脫溫度的影響

用40目陰離子交換樹脂按1.3方法進(jìn)行純化實驗，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，考察吸附和洗脫溫度分別為5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃條件下，齊墩果酸回收率和含量的變化。

3)洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

用40目陰離子交換樹脂按1.3方法進(jìn)行純化實驗，吸附和洗脫溫度為10 ℃，考察洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%、95%條件下，齊墩果酸回收率和含量的變化。

1.4.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以樹脂粒度、吸附和洗脫溫度、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響因素設(shè)計正交實驗(表1)，進(jìn)一步優(yōu)化純化工藝條件。

表1 正交實驗的因素與水平

Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.5 分析檢測

用化學(xué)法和紅外光譜法對齊墩果酸精品進(jìn)行定性檢測?；瘜W(xué)法：取樣品約50 mg，加2 mL氯仿溶解，滴加硫酸2滴，振蕩，靜置觀察。紅外光譜法：取少量樣品，與溴化鉀混合后壓片制樣，進(jìn)行紅外光譜測定。

參照衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第三冊方法測定齊墩果酸含量。具體操作為：準(zhǔn)確稱取樣品0.15 g，加30 mL乙醇振搖，微溫加熱溶解，冷卻至室溫，滴加酚酞3滴，用氫氧化鉀乙醇溶液滴定，并做空白實驗校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 齊墩果酸粗品的回收率和含量(表2)

表2 女貞子果皮中提取齊墩果酸粗品的回收率和含量

Tab.2 The yield and content of crude oleanolic acid extracted from the peel of Ligustrum lucidum Ait

本實驗提取的齊墩果酸粗品為淺黃綠色粉末。每千克女貞子鮮果可制成干果皮64.50 g。從表2可知，回收率以女貞子果皮計平均為17.52%，以女貞子鮮果計為1.13%，酸堿滴定法測定含量平均為70.20%，3次平行實驗的回收率和含量無顯著差異。

2.2 齊墩果酸精品的定性檢測

化學(xué)鑒別反應(yīng)觀察到氯仿自無色逐漸變成淡紅色，與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)現(xiàn)象相同。將樣品紅外光譜(圖1)顯示的羥基(3 424 cm-1)、飽和的CH(2 922 cm-1、2 850 cm-1)、羰基(1 686 cm-1)、甲基(1 468 cm-1、1 388 cm-1)、C-O伸縮振動(1 030 cm-1)等特征吸收峰及指紋區(qū)精細(xì)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比，結(jié)果一致，因此，判斷樣品為齊墩果酸。

圖1 齊墩果酸精品的紅外光譜圖(KBr壓片法)

2.3 樹脂粒度對齊墩果酸回收率和含量的影響(表3)

表3 樹脂粒度對齊墩果酸回收率和含量的影響

Tab.3 The effect of particle size of resin on yield and content of oleanolic acid

從表3可知，隨著樹脂粒度的減小，齊墩果酸精品回收率升高，當(dāng)樹脂粒度為100目時，齊墩果酸回收率達(dá)到90%以上；當(dāng)樹脂粒度為120目時，樣品溶液和洗脫液難以通過樹脂層，實驗無法進(jìn)行。原因可能是樹脂粒度減小，交換面積和交換容量增大，使齊墩果酸精品回收率升高；當(dāng)樹脂粒度進(jìn)一步減小時，樹脂之間的空隙嚴(yán)重變小，使液體流動速度減慢甚至停止。樹脂粒度對齊墩果酸精品含量的影響不明顯，說明離子交換法有效而且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

2.4 吸附和洗脫溫度對齊墩果酸回收率和含量的影響(表4)

表4 吸附和洗脫溫度對齊墩果酸回收率和含量的影響

Tab.4 The effect of adsorption and elution temperature on yield and content of oleanolic acid

從表4可知，隨著吸附和洗脫溫度的升高，齊墩果酸的回收率先降低后升高；而齊墩果酸含量先升高后降低。原因可能是齊墩果酸和雜質(zhì)的吸附-解吸行為在不同溫度下有不同表現(xiàn)。考慮到吸附和洗脫一般在室溫下進(jìn)行，故沒有考察低于5 ℃和高于40 ℃的條件。

2.5 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對齊墩果酸回收率和含量的影響(表5)

表5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對齊墩果酸回收率和含量的影響

Tab.5 The effect of ethanol volume fraction on yield and content of oleanolic acid

從表5可知，隨著洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，齊墩果酸回收率逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時，齊墩果酸的回收率趨于穩(wěn)定；同時隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，齊墩果酸含量逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時，含量已達(dá)98%以上。原因可能是在體積分?jǐn)?shù)較高的乙醇中，齊墩果酸易于溶解并洗脫。綜合考慮，宜選用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液。

2.6 正交實驗結(jié)果與分析(表6)

從表6可知，7#實驗得到的齊墩果酸回收率最高，為96.33%，含量98.78%；9#實驗得到的齊墩果酸回收率較高，為96.31%，含量98.64%；5#實驗得到的齊墩果酸含量最高，為99.86%，回收率65.21%。

表6 正交實驗結(jié)果與分析

Tab.6 The results and analysis of orthogonal experiment

實驗號因素ABC回收率/%含量/%1#11144．8097．882#12248．8498．643#13348．7898．784#21261．5997．985#22365．2199．866#23161．4698．897#31396．3398．788#32195．9298．699#33296．3198．64k1133．8548．2448．00k1244．5349．6149．14k1368．4148．9549．66極差R114．395．0818．75k2198．4398．2198．49k2298．9199．0698．42k2398．7098．7799．14極差R20．280．640．44

5#實驗雖然齊墩果酸含量最高，但回收率卻相對較低，洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)較大，成本高；7#、9#實驗回收率和產(chǎn)品含量都較高，但7#實驗吸附和洗脫溫度低、乙醇體積分?jǐn)?shù)大，成本高。

綜合考慮，優(yōu)化的純化工藝條件采用9#實驗的參數(shù)，即樹脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。

2.7 優(yōu)化條件下純化效果的穩(wěn)定性(圖2)

圖2 優(yōu)化工藝條件下連續(xù)10次純化實驗結(jié)果

由圖2可知，同一批陰離子交換樹脂連續(xù)進(jìn)行10次純化實驗，齊墩果酸回收率和含量無顯著變化，說明樹脂的吸附性能穩(wěn)定。樹脂顏色由最初的微黃色變?yōu)樽厣?，可能是雜質(zhì)滲入樹脂內(nèi)部所致，但對實驗效果無顯著影響。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗，探討了凝膠型強堿性陰離子交換樹脂對從女貞子果皮中提取的齊墩果酸粗品的純化效果。分別比較了樹脂粒度、吸附和洗脫溫度、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)對齊墩果酸回收率和含量的影響。確定最優(yōu)工藝條件為：樹脂粒度100目、吸附和洗脫溫度30 ℃、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。在此條件下，凝膠型強堿性陰離子交換樹脂純化齊墩果酸的精品純度達(dá)98%以上，且質(zhì)量穩(wěn)定；齊墩果酸回收率可達(dá)96%以上。

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Purification Technology of Oleanolic Acid Based on a Gel-Type Anion Exchange Resin

YANG Yu-qi1，2，LIU Yuan-he2，WANG Can2，ZHANG Nan-hai2，HUANG Qi-hong2，LI Yun-lei2，WU Yi-wei1

(1.Hubei Normal University，Huangshi 435002，China；2.Hubei Polytechnic University，Huangshi 435001,China)

ThecrudeoleanolicacidfromthepeelofLigustrum lucidumAitwaspurifiedusingagel-typeanionexchangeresins,andthepurifiedconditionswereoptimizedbyasinglefactorexperimentandorthogonalexperiment.Theoptimalconditionswereasfollowing:theparticlesizeofresinof100meshes,theadsorptionandelutiontemperatureof30 ℃,andtheethanolvolumefractionof80%.Thecontentandyieldofoleanolicacidwereover98%and96%,respectively.

oleanolicacid；gel-typeanionexchangeresin；purification

湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年創(chuàng)新團隊項目(201317)

2016-09-29

楊裕啟(1975-)，男，湖北黃石人，實驗師，研究方向：天然藥物提取和分析；通訊作者：吳一微，教授，E-mail：chemwuyiwei@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.007

R 284

A

1672-5425(2016)11-0036-04

楊裕啟，劉遠(yuǎn)河，王燦，等.基于凝膠型陰離子交換樹脂的齊墩果酸純化工藝[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(11)：36-39.