基于熱還原氧化石墨烯的單分子表面誘導(dǎo)熒光衰逝技術(shù)*

樊秦凱 楊晨光 胡書新 徐春華 李明 陸穎?

1) (中國科學(xué)院物理研究所,北京凝聚態(tài)物理國家研究中心,軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

2) (中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

單分子表面誘導(dǎo)熒光衰逝(single molecule surface-induced fluorescence attenuation,smSIFA)技術(shù)是一種基于二維材料受體、用于研究生物大分子法向運(yùn)動(dòng)的精密測量方法,該方法不受二維平面運(yùn)動(dòng)的干擾.作為受體的二維材料,其特征淬滅距離決定法向上探測的距離和精度.近年來以氧化石墨烯(graphene oxide,GO)和石墨烯作為介質(zhì)受體的SIFA 技術(shù)在生物大分子的研究中發(fā)揮了重要作用,但石墨烯和GO 具有固定的特征淬滅距離,探測范圍有限.調(diào)整探測范圍需要更換介質(zhì)材料,面臨材料選擇與制備的困難,亟需開發(fā)用于技術(shù)的可調(diào)控材料.本文改良了以GO 為介質(zhì)受體的單分子SIFA 技術(shù),利用熱還原的方法對GO 進(jìn)行還原,通過控制還原溫度,制備出了還原程度不同的還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO),調(diào)控特征淬滅距離,利用熒光標(biāo)記的DNA 測量rGO 的特征淬滅距離.將rGO 用于單分子SIFA 技術(shù),對Holliday junction 構(gòu)象變化的觀察,論證了rGO 的探測范圍.

1 引言

單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET)是研究生物大分子動(dòng)力學(xué)過程的常用方法,具有較高的時(shí)間和空間分辨率[1-4].膜蛋白是生物膜功能的主要承擔(dān)者,在細(xì)胞內(nèi)約有1/3 的基因編碼膜蛋白[5].研究膜蛋白在細(xì)胞膜上的取向和插膜深度對于理解其結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要[6,7].由于細(xì)胞膜具有流動(dòng)性,處于細(xì)胞膜上的膜蛋白會(huì)發(fā)生橫向位移,將FRET 用于膜蛋白的研究時(shí)具有局限性[8-10].近年來基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理發(fā)展的表面誘導(dǎo)熒光衰逝(surface-induced fluorescence attenuation,SIFA)技術(shù)是將二維介質(zhì)作為熒光受體,通過分析其對熒光供體的光強(qiáng)衰逝程度,可以計(jì)算出熒光供體距和材料表面的法向距離[11,12].熒光衰逝效率和供體距介質(zhì)表面法向距離的關(guān)系由(1)式描述:

式中:I0為沒有介質(zhì)存在時(shí)熒光供體的初始強(qiáng)度;I為當(dāng)介質(zhì)存在時(shí)測得的供體熒光強(qiáng)度;d0為介質(zhì)的特征淬滅距離,是I/I0=0.5 時(shí)熒光供體和介質(zhì)表面的法向距離.在選擇二維介質(zhì)作為熒光受體時(shí)不僅要考慮到材料的親生物性,同時(shí)還要考慮到材料的光學(xué)性能以及制備難易度.近年來基于氧化石墨烯(graphene oxide,GO)的SIFA 方法在膜蛋白的研究中有著廣泛的應(yīng)用[13,14],基于石墨烯的單分子熒光成像也取得了一定成果[15,16].以往研究表明,GO 的d0=4 nm[11],石墨烯的d0≈ 18 nm[16-18].GO 的d0較小,適合探測距離其表面2—6 nm 范圍內(nèi)的信號[11];石墨烯的d0較大,適合探測距離其表面12 nm 以外的區(qū)域[16].圖1(a)展示了利用GO和石墨烯作為介質(zhì)受體時(shí)的局限,以石墨烯和GO作為介質(zhì)受體時(shí)并不能全方位的覆蓋近細(xì)胞膜表面的區(qū)域,存在無法探測的區(qū)間.圖1(b)展示了不同d0的距離淬滅曲線,在d0附近衰減曲線的斜率最大,探測的靈敏度最高,當(dāng)熒光供體距離介質(zhì)表面較近或較遠(yuǎn)時(shí)探測的靈敏度顯著下降.不同的二維材料的d0不同,能夠探測的范圍不同,進(jìn)行SIFA實(shí)驗(yàn)時(shí)需要根據(jù)目標(biāo)大分子的尺寸以及熒光標(biāo)記位點(diǎn)等信息來選擇具有目標(biāo)d0的材料.

圖1 調(diào)控d0 的SIFA 方法 (a) SIFA 方法示意圖;(b) 熒光供體光強(qiáng)衰減和表面距離的關(guān)系;(c) SIFA 探測靈敏度和熒光供體距表面距離的關(guān)系Fig.1.SIFA method of adjustable d0: (a) Schematic representation of SIFA method;(b) relationship between degree of attenuation of a fluorescent donor and donor-surface distance;(c) relationship between detection sensitivity of SIFA and donor-surface distance.

SIFA 方法探測熒光供體距離細(xì)胞膜法向距離的變化是通過測量供體的光強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)的,因此SIFA的靈敏度受制于儀器對于熒光供體光強(qiáng)的探測.通常認(rèn)為儀器能夠分辨的光強(qiáng)變化率約為10%[11],基于此可以利用(1)式計(jì)算出不同d0的距離探測靈敏度.圖1(c)展示了SIFA 探測的距離靈敏度曲線,GO 的d0=4 nm,在d0附近的探測靈敏度可以接近0.5 nm,在距離其表面2—6 nm 的范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)1 nm 的分辨率,然而一旦超出3—6 nm 的靈敏范圍之后,GO 的探測分辨率將低至3 nm,并且隨著距離的增加分辨率呈指數(shù)下降.當(dāng)d0提高到10 nm 時(shí),雖然能夠探測距離介質(zhì)表面距離更遠(yuǎn)范圍的熒光信號,但即便是在最靈敏的d0附近也只能實(shí)現(xiàn)1 nm 的探測精度.在進(jìn)行SIFA 實(shí)驗(yàn)時(shí),如果要實(shí)現(xiàn)1 nm 的空間分辨率,則介質(zhì)受體的d0應(yīng)不大于10 nm.如圖1(c)所示,要對介質(zhì)受體表面12 nm 以內(nèi)的生物大分子進(jìn)行探測,以彌補(bǔ)石墨烯和GO 探測的局限,并保證1 nm 的空間分辨率,需要對d0在4—10 nm 之間進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié).制備d0在3—10 nm 的介質(zhì)材料并用于SIFA實(shí)驗(yàn)來觀察生物大分子面臨材料選擇和制備的困難.有研究表明,對石墨烯進(jìn)行通電使其氧化可以減小d0,但石墨烯氧化具有不均勻性[19].還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO)是GO 通過加熱、化學(xué)和電學(xué)等方法進(jìn)行還原后所得到的材料,rGO制備方便,且物理和化學(xué)性質(zhì)和石墨烯接近[20-22].有研究表明,rGO 對熒光的淬滅效果介乎與GO 和石墨烯之間[23,24],但rGO 仍缺乏單分子熒光成像的應(yīng)用.本文采用熱還原方法制備rGO,并用于單分子熒光成像.通過熒光白標(biāo)記的雙鏈DNA 標(biāo)尺精確測量了不同還原程度rGO 的d0,改良了已有的SIFA 技術(shù),并通過與GO進(jìn)行對比,驗(yàn)證了rGO-SIFA 技術(shù)的優(yōu)勢.

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 GO 分散液的制備

GO 分散液制作方法參照 Hummers 方法[25,26].取1 g NaNO3,46 mL H2SO4以及1 g 石墨,于0 ℃溫度下混合均勻,對混合物進(jìn)行冰浴以保持其環(huán)境溫度為0 ℃,并向混合物中緩慢加入6 g KMnO4.此后不斷攪拌約2 h,而后將混合物整體移至35 ℃繼續(xù)攪拌2 h,將120 mL 去離子水緩慢加入混合溶液中(30 min),最后將6 mL H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)緩慢加入混合溶液中,并培養(yǎng)20 min 左右.超高速離心(15000 r/min) 20 min 制得的混合溶液,去除上清液,將得到的沉淀再次分散溶于去離子水中,進(jìn)行超聲(100 W,30 min),對多層氧化石墨進(jìn)行剝離.對溶液進(jìn)行低速離心(1000 r/min)10 min,去除沉淀保留上清液,重復(fù)該步驟3—4 次,直到不再出現(xiàn)明顯的沉淀.將收集到的溶液進(jìn)一步離心,每次離心取走上清液后將沉淀再次溶解進(jìn)行下一次離心.分別以8000,6000,4000 r/min離心25 min,4000 r/min 離心后的沉淀溶解后再次以2000 r/min 離心25 min,所得到的上清液即為實(shí)驗(yàn)所用的GO 分散液.

2.2 XPS 方法分析GO 的還原

用硝酸纖維素膜(直徑47 mm,孔徑0.2 mm,Whatman)對制備的GO 分散液進(jìn)行真空抽濾[27],所形成的薄膜自然晾干之后從濾膜上分離下來.剪取少量GO 薄膜,用2 片干凈的蓋玻片將GO 薄膜夾在中間,放置于真空管式爐內(nèi)烘烤,升溫速度設(shè)為8 ℃/ min,升溫至目標(biāo)溫度后維持2 h,而后自然冷卻至室溫.將加熱還原后的rGO 薄膜與GO薄膜在中國科學(xué)院物理研究所的X 射線光電子能譜儀(XPS,Thermo Fisher Scientific ESCALAB 250X)上測量結(jié)合能,所用X-射線源為單色化的鋁Kα射線,能量為1486.6 eV.

2.3 rGO-SIFA 實(shí)驗(yàn)步驟

rGO-SIFA 實(shí)驗(yàn)包含rGO-SIFA 樣品腔室制備、單分子熒光實(shí)驗(yàn)材料與樣品制備,以及熒光觀測三部分.

2.3.1 rGO-SIFA 樣品腔室的制備過程

實(shí)驗(yàn)所用的蓋玻片需要清洗掉表面的熒光雜質(zhì),以免對單分子熒光成像實(shí)驗(yàn)造成影響.具體清洗流程是先使用丙酮對蓋玻片超聲清洗30 min,然后用去離子水超聲清洗洗去丙酮?dú)埩?再用甲醇超聲清洗30 min,并在超聲清洗結(jié)束后用去離子水超聲清洗洗去甲醇?xì)埩?用1 mol/L 的NaOH溶液對蓋玻片進(jìn)行超聲清洗,每次清洗10 min 后更換NaOH 溶液,共超聲清洗3 次,得到干凈且沒有熒光雜質(zhì)的蓋玻片.

利用LB(Langmuir-Blodgett)技術(shù)將GO 分散液中的單層GO 轉(zhuǎn)移至清洗干凈的蓋玻片上[28],將另一塊干凈的蓋玻片覆蓋其上,放置于真空管式爐內(nèi)烘烤,升溫速度設(shè)為8 ℃/min,升溫至目標(biāo)溫度后維持2 h,而后自然冷卻至室溫.用雙面膠將rGO 蓋玻片和清洗干凈的載玻片黏合在一起,做成適合裝載在全內(nèi)反射熒光顯微鏡上的樣品腔室.

2.3.2 單分子熒光實(shí)驗(yàn)材料與樣品制備

實(shí)驗(yàn)所用的DNA 序列采購于上生工生物工程(上海)股份有限公司,雙鏈DNA 的序列為TATGGTCAACTGCTGAGCGTAG-biotin,ATACCAGTTGACGACTCGCAT.DNA Holiday junction 的4 條鏈序列如表2 所示.退火緩沖液(pH=7.5)成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl.雙鏈DNA 退火時(shí)將2 條單鏈DNA 按照1∶1 混合,退火緩沖液(pH=7.5)成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl,加熱至95 ℃孵育5 min,而后在7 h 內(nèi)緩慢冷卻至室溫.

觀察雙鏈DNA 樣品時(shí)的緩沖液成分為50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl,pH=7.5.觀察DNA Holiday junction 樣品時(shí)的緩沖液成分為50 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,25 mmol/L Tris-HCl,pH=7.5.在進(jìn)行單分子熒光成像時(shí)緩沖液內(nèi)需要加入抗淬滅體系,成分為0.8% D-葡萄糖、1 mg/mL 葡萄糖氧化酶、0.4 mg/mL 過氧化氫酶、1 mmol/L Trolox.

2.3.3 rGO-SIFA 熒光觀測的步驟

首先,將1 mg/mL 生物素修飾的牛血清蛋白(biotin-BSA)注入樣品腔室,孵育5 min 后用PBS緩沖液沖洗掉游離的biotin-BSA;加入10 μg/mL鏈霉親和素(strepavidin,SA)溶液孵育5 min 后用PBS 緩沖液沖洗掉游離的SA.然后,將100 pmol/L末端標(biāo)記了biotin 的熒光標(biāo)記DNA 注入樣品腔室,孵育5 min 后用PBS 緩沖液沖洗掉游離的DNA.最后,將緩沖液和抗淬滅體系混合注入樣品腔內(nèi)進(jìn)行單分子熒光成像.實(shí)驗(yàn)裝置采用以全內(nèi)反射熒光顯微鏡和EMCCD 為基礎(chǔ)的雙通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移觀測裝置[29-31],EMCCD 曝光時(shí)間設(shè)為50 ms.利用ImageJ 和Matlab 等軟件記錄及分析光強(qiáng)數(shù)據(jù).

3 結(jié)果與討論

3.1 XPS 分析GO 的熱還原

利用LB 技術(shù)可以便捷、低成本地在蓋玻片上修飾單層GO,以制備成樣品腔室進(jìn)行單分子SIFA實(shí)驗(yàn)[11].實(shí)驗(yàn)所用的蓋玻片最高能夠在600 ℃高溫下不發(fā)生斷裂與形變,基于此,將修飾了單層GO的蓋玻片直接放置于真空管式爐內(nèi)進(jìn)行烘烤,便可得到修飾了rGO 的蓋玻片,并進(jìn)行SIFA 實(shí)驗(yàn).

不同還原程度的rGO 在物理、化學(xué)和光學(xué)等性質(zhì)上可能存在區(qū)別[32].通過XPS 方法測量GO與rGO 的表面化學(xué)成分和結(jié)合狀態(tài),可以分析經(jīng)過管式爐烘烤后GO 的還原情況[33].單層GO 片徑大多在微米級別[11],小于XPS 的探測范圍,直接對蓋玻片上的rGO 進(jìn)行測量時(shí)玻璃成分的蓋玻片會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾,因此將GO 分散液制備成GO 薄膜,用2 塊蓋玻片將GO 薄膜夾在中間,與修飾了GO 的玻片同時(shí)烘烤,并對熱還原后的rGO 薄膜進(jìn)行XPS 分析.

如圖2(a)所示,GO 的C1S 譜圖展示出了3 個(gè)峰,分別對應(yīng)C—C (sp2雜化碳)、C—O(羥基和環(huán)氧化物)、C=O(羰基)[27].經(jīng)過300 ℃和400 ℃烘烤2 h 進(jìn)行還原的rGO 其C—O 與C=O 的峰明顯變低(圖2(b),(c)),表明大部分含氧基團(tuán)已被去除.XPS 全譜的結(jié)果也表明經(jīng)過烘烤后GO 得到了很好的還原,如圖2 右側(cè)一列所示,未還原的GO,300 ℃溫度下烘烤2 h 還原的rGO (300 ℃-2h-rGO),以及400 ℃溫度下烘烤2 h 還原的rGO(400℃-2 h-rGO),C/O 比值分別是1.14,2.48 和3.29.這一結(jié)果和以往的研究一致,熱還原rGO 的還原程度主要取決于還原溫度和還原時(shí)間[34,35].還原溫度和還原時(shí)間的調(diào)節(jié)是連續(xù)的,通過設(shè)定不同還原參數(shù)可以對rGO 的還原程度進(jìn)行連續(xù)調(diào)控.

圖2 初始GO 以及rGO 薄膜的XPS 譜 (a) 初始GO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜(右);(b) 300 ℃-2 h-rGO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜(右);(c) 400 ℃-2 h-rGO 薄膜C 1s 的XPS 譜(左)以及XPS 全譜Fig.2.XPS spectra of original GO and rGO thin films: (a) C 1s XPS spectra (left) and XPS survey spectra (right) for original GO thin films;(b) C 1s XPS spectra (left) and XPS survey spectra (right) for 300 ℃-2 h-rGO thin films;(c) C 1s XPS spectra (left)and XPS survey spectra (right) for the 400 ℃-2 h-rGO thin films.

3.2 熱還原rGO 特征淬滅距離d0 的測定

在應(yīng)用以rGO 作為介質(zhì)受體的SIFA 技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞膜表面的法向運(yùn)動(dòng)之前還面臨2 個(gè)問題: 一是驗(yàn)證rGO 是否能夠用于生物大分子的研究;二是測定rGO 的d0.雙鏈DNA 在溶液中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,熒光標(biāo)記的DNA 不僅可以作為單分子熒光成像技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品來驗(yàn)證方法的可行性,還可以用于研究與DNA 相互作用的蛋白質(zhì).將同時(shí)標(biāo)記了Cy3 和biotin 的雙鏈DNA 通過biotin-BSA 以及SA 連接在rGO 表面,如圖3(a)所示.通過測量Cy3 的光強(qiáng),與玻璃表面測得的光強(qiáng)進(jìn)行對比,即可利用(1)式計(jì)算出rGO 的d0.圖3(b)左列是在DNA 未鏈接到表面上之前對樣品腔室進(jìn)行成像,右列是DNA 連接后的成像圖.經(jīng)過熱還原后的rGO 已不自發(fā)熒光,通過圖像已無法區(qū)分熒光點(diǎn)處于rGO 區(qū)域還是玻璃區(qū)域,因此需要分析和統(tǒng)計(jì)所有單個(gè)Cy3 分子的光強(qiáng).圖3(c)—(e)的首行分別展示了Cy3 標(biāo)記在雙鏈DNA 第1 bp、第9 bp、第21 bp 位點(diǎn)時(shí)單個(gè)Cy3 分子的光強(qiáng)曲線,以及光強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)圖.結(jié)果表明: Cy3 標(biāo)記在雙鏈DNA 上時(shí)的光強(qiáng)穩(wěn)定,并且熒光強(qiáng)度和標(biāo)記位點(diǎn)無關(guān).Cy3 的光強(qiáng)呈高斯分布,峰值即為I0.圖3(c)第2 行和第3 行分別是在300 ℃-2 h-rGO和400 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)對Cy3 標(biāo)記在第1 bp的DNA 進(jìn)行成像所得到的單個(gè)Cy3 的熒光強(qiáng)度曲線以及強(qiáng)度分布.在rGO 樣品腔內(nèi)觀察到Cy3具有2 個(gè)穩(wěn)定的光強(qiáng),較高的光強(qiáng)和玻璃上成像的強(qiáng)度相同,表明此時(shí)DNA 連接在了玻璃上.較低的光強(qiáng)是因?yàn)镈NA 連接在了rGO 上,rGO 對Cy3有衰逝作用,從而導(dǎo)致Cy3 光強(qiáng)降低.Cy3 光強(qiáng)較低的曲線光強(qiáng)穩(wěn)定、不波動(dòng),表明Cy3 距離rGO的高度保持恒定.

圖3 熒光標(biāo)記DNA 測量rGO 的d0 (a) DNA 成像實(shí)驗(yàn)示意圖;(b) 在300 ℃-2 h-rGO (上)以及400 ℃-2 h-rGO (下)樣品腔內(nèi)觀察DNA;Cy3 標(biāo)記在1 bp (c),9 bp (d)和21 bp (e) 處的DNA 在玻璃以及rGO 上成像時(shí)的單分子光強(qiáng)Fig.3.Determination of d0 of rGO by fluorescence labeled DNA: (a) Schematic representation of DNA imaging;(b) DNA imaging on 300 ℃-2 h-rGO (upper) and 400 ℃-2 h-rGO (lower);intensities of Cy3 labeled at 1 bp (c),9 bp (d) and 21 bp (e) of DNA on glass and rGO.

300 ℃-2 h-rGO 和400 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)Cy3的低光強(qiáng)存在差異,分別是0.66I0和0.45I0,表明400 ℃-2 h-rGO 對熒光的衰逝作用比300 ℃-2 h-rGO要強(qiáng).在rGO 樣品腔對Cy3 標(biāo)記在第9 bp 的DNA進(jìn)行成像并分析單個(gè)Cy3 分子的光強(qiáng),如圖3(d)所示,當(dāng)Cy3 標(biāo)記在第9 bp 時(shí)光強(qiáng)比標(biāo)記在第1 bp 時(shí)要強(qiáng),這是由于Cy3 距離rGO 表面的距離比標(biāo)記在1 bp 時(shí)要遠(yuǎn).在300 ℃-2 h-rGO 樣品腔內(nèi)對Cy3 標(biāo)記在第21 bp 的DNA 進(jìn)行成像,此時(shí)單個(gè)Cy3 分子只有一個(gè)光強(qiáng),且和玻璃樣品腔內(nèi)測得的光強(qiáng)接近,表明此時(shí)rGO 對Cy3 的熒光衰逝效果已經(jīng)不顯著了.統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Cy3 的光強(qiáng)只有一個(gè)峰,但峰寬較玻璃上測得的I0分布要寬.Cy3 標(biāo)記在第21 bp 的DNA 在400 ℃-2 h-rGO樣品腔內(nèi)依舊能夠展示出2 個(gè)光強(qiáng)分布,表明400℃-2 h-rGO 具有更強(qiáng)的熒光衰逝效果.

雙鏈DNA 在溶液中的駐留長度為50 nm[36],相鄰堿基對的距離是0.34 nm[37],因此實(shí)驗(yàn)所用的21 bp 雙鏈DNA 可以近似看作是長7.1 nm 的桿狀剛體.在計(jì)算Cy3 與rGO 表面的高度時(shí)只需要考慮雙鏈DNA 與rGO 表面法向的夾角.有研究表明溶液中固定在表面的短雙鏈DNA 和表面法向的夾角是恒定的,并且夾角約為60°[38,39],再結(jié)合以往研究表明BSA 的尺寸大約是3 nm[40],SA 的尺寸大約是4.2 nm[41],Cy3 標(biāo)記在第1 bp、第9 bp以及第21 bp 時(shí)和rGO 表面的法向距離便可以計(jì)算出來.表1 總結(jié)了不同熒光標(biāo)記的DNA在玻璃以及rGO 上進(jìn)行成像,利用光強(qiáng)與距離信息計(jì)算出的d0.在相同的rGO 樣品腔內(nèi)對不同熒光標(biāo)記的DNA 進(jìn)行成像并計(jì)算d0,所得到的結(jié)果接近,更加證實(shí)了rGO-SIFA 方法的可行性.在相同還原條件的rGO 上對不同熒光標(biāo)記位置的DNA 進(jìn)行成像并計(jì)算d0屬于獨(dú)立實(shí)驗(yàn),可將獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果聯(lián)合起來得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果,通過加權(quán)平均計(jì)算后可以得到300 ℃-2 h-rGO 的d0=(6.3 ±0.5) nm,400 ℃-2 h-rGO 的d0=(7.9 ± 0.5) nm.將計(jì)算得到的300℃-2 h-rGO 的d0以及Cy3 標(biāo)記在第21 bp時(shí)的高度代入(1)式可以計(jì)算出Cy3 的理論光強(qiáng),大約為0.9I0.由于單分子的差異以及儀器測量存在誤差,Cy3 的光強(qiáng)呈高斯分布,具有一定的峰寬,即便光強(qiáng)分布具有0.9I0和I0兩個(gè)峰也無法區(qū)分,和實(shí)驗(yàn)測量的結(jié)果一致.300 ℃-2 h-rGO 和400 ℃-2 h-rGO 的d0存在差異,可以預(yù)計(jì)的結(jié)果是通過降低還原溫度d0能從6.3 nm逐漸向4 nm 過渡.本文采用最高還原溫度為400 ℃,距離實(shí)驗(yàn)所用蓋玻片的600 ℃耐高溫上限還有升溫空間.另一方面也可以將玻璃蓋玻片更換為石英蓋玻片,從而實(shí)現(xiàn)更高溫度的熱還原,以進(jìn)一步提高d0.

表1 熒光標(biāo)記DNA 測量rGO 的d0Table 1. Determination of d0 of rGO by fluorescence labeled DNA.

3.3 rGO-SIFA 測量DNA Holliday junction 構(gòu)象變化

將不同d0的受體介質(zhì)用于單分子SIFA 技術(shù)時(shí)能夠探測距離細(xì)胞膜表面不同高度的生物大分子動(dòng)力學(xué)過程.利用熒光標(biāo)記的雙鏈DNA 來測量rGO 的d0時(shí)在rGO 上連接的DNA 只有一個(gè)光強(qiáng),即目標(biāo)生物大分子只有一個(gè)狀態(tài).為了更好地驗(yàn)證rGO-SIFA 方法的可行性,應(yīng)選擇一個(gè)熒光標(biāo)記位點(diǎn)距離rGO 高度發(fā)生變化的生物大分子來進(jìn)行研究,這個(gè)生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并且被研究得比較充分.Holliday junction 是DNA復(fù)制以及同源重組的重要中間體,是由4 條DNA鏈組成的四鏈結(jié)構(gòu)[42].在溶液中沒有2 價(jià)金屬離子存在時(shí),Holliday junction 呈現(xiàn)出靜止的十字形結(jié)構(gòu),當(dāng)溶液中有2 價(jià)金屬離子存在時(shí),Holliday junction 將堆疊成X 型結(jié)構(gòu)[43].Holliday junction堆疊成的X 型結(jié)構(gòu)存在2 種不同的構(gòu)象,并且這2 種構(gòu)象在不斷地互相轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換速率受到2 價(jià)金屬離子濃度的調(diào)控[44,45].Holliday junction 的構(gòu)象變換是發(fā)生同源重組的必要條件,其中心區(qū)域的核苷酸序列會(huì)影響2 種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換速率以及構(gòu)象持續(xù)時(shí)間[45,46].由于Holliday junction 的結(jié)構(gòu)簡單、易于制備,且在溶液中能夠穩(wěn)定觀察到2 種構(gòu)象的互相轉(zhuǎn)換,熒光標(biāo)記的Holliday junction 常用于高級單分子熒光成像技術(shù)的驗(yàn)證[47,48].構(gòu)建如圖3 所示的Holliday junction,表2 展示了構(gòu)成Holliday junction 的4 條短鏈DNA 的核苷酸序列,以及Cy3的標(biāo)記位置,該序列的Holliday junction 可被連接到蓋玻片表面,并在2 價(jià)金屬離子存在時(shí)存在穩(wěn)定的構(gòu)象變換[46,48].

表2 DNA Holliday junction 的核苷酸序列Table 2. Nucleotide sequence of DNA Holliday junction.

Cy3 標(biāo)記在H 鏈的3’末端,Holliday junction通過H 鏈5’末端標(biāo)記的biotin 固定在表面.在50 mmol/L Mg2+,50 mmol/L Na+條件下Holliday junction 不斷地發(fā)生構(gòu)象變化,處于state 1 時(shí)Cy3距離rGO/GO 或玻璃表面距離近(約7.5 nm),處于state 2 的時(shí)候距離表面距離遠(yuǎn).

圖4(a)是玻璃樣品腔內(nèi)對Holliday junction進(jìn)行觀察的結(jié)果,左列展示了單個(gè)Cy3 分子的光強(qiáng),光強(qiáng)穩(wěn)定未發(fā)生任何波動(dòng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Cy3的光強(qiáng)為高斯分布,中心值即為I0.圖4(b)是在GO 樣品腔內(nèi)對Holliday junction 進(jìn)行觀察,未觀測到Cy3 的光強(qiáng)發(fā)生變化.Cy3 距離表面最近的距離約為7.5 nm,GO 的d0=4 nm,通過(1)式可以計(jì)算出Cy3 距離GO 較近時(shí)的理論光強(qiáng)為0.94I0.距離7.5 nm 已經(jīng)超出了GO 的靈敏范圍,此時(shí)隨著距離的增大光強(qiáng)從0.94I0逐漸靠近I0,這一微小的光強(qiáng)變化已經(jīng)低于儀器探測的靈敏度.對GO 上Cy3 的光強(qiáng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果為高斯分布,但半高寬較玻璃上要大.這一現(xiàn)象的原因有2 個(gè):一是理論計(jì)算表明GO 上Cy3 有2 個(gè)光強(qiáng),并且這2 個(gè)光強(qiáng)大小都和I0很接近,實(shí)驗(yàn)上很難區(qū)分出這2 個(gè)光強(qiáng);二是GO 本身會(huì)自發(fā)微弱的熒光,在GO 上對單分子進(jìn)行成像所得到的信噪比要比玻璃上差,因此光強(qiáng)分布的峰寬會(huì)比玻璃上要大.圖4(c)是在400 ℃-2 h-rGO 樣品槽內(nèi)對Holliday junction 進(jìn)行觀察,Cy3 的光強(qiáng)不斷在高和低2 個(gè)值之間跳變.在400 ℃-2 h-rGO 上觀察Cy3 標(biāo)記的雙鏈DNA 時(shí)Cy3 的光強(qiáng)穩(wěn)定、不波動(dòng),表明400 ℃-2 h-rGO 只對Cy3 的光強(qiáng)有衰逝作用,但并不影響Cy3 光強(qiáng)的穩(wěn)定性.因此,觀察到Holliday junction所標(biāo)記的Cy3 光強(qiáng)發(fā)生變化是由于Cy3 距離400℃-2h-rGO 的高度發(fā)生了變化.對Cy3 的光強(qiáng)進(jìn)行時(shí)間加權(quán)統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明Cy3 的光強(qiáng)呈現(xiàn)2 個(gè)峰的分布,峰值分別是0.42I0和0.83I0.利用(1)式,代入400 ℃-2 h-rGO 的d0=(7.9±0.5) nm 可以計(jì)算出Cy3 與rGO 表面的法向距離分別是7.3 nm以及11.7 nm,與Cy3 的理論距離7.5 nm 以及11.1 nm 比較接近.根據(jù)圖4(c)中Cy3 的光強(qiáng)分布圖可以計(jì)算出高光強(qiáng)和低光強(qiáng)的峰高比為1∶2,表明Holliday junction 的state 1 構(gòu)象持續(xù)時(shí)間是state 2 的2 倍,和以往采用相同DNA 序列的Holliday junction 研究結(jié)果一致[46].基于以上兩點(diǎn),證實(shí)了用400 ℃-2 h-rGO 觀察到了Holliday junction的構(gòu)象變換,并且這一構(gòu)象變換無法被GO 觀察到.造成這一結(jié)果差異的原因是400 ℃-2 h-rGO具有比GO 更大的d0,能夠觀測更遠(yuǎn)的范圍.熱還原的rGO 可以通過控制還原溫度來調(diào)控d0,在進(jìn)行具體研究時(shí)應(yīng)根據(jù)目標(biāo)大分子的尺度和熒光標(biāo)記位點(diǎn)來靈活設(shè)還原溫度,以選擇適合觀測的d0.

圖4 SIFA 觀察Holliday junction 的構(gòu)象變換,在玻璃 (a),GO (b)和400 ℃-2 h-rGO (c)上觀察Cy3 標(biāo)記的Holliday junction,左列為單個(gè)Cy3 的光強(qiáng)時(shí)間曲線,中間為Cy3 的光強(qiáng)統(tǒng)計(jì)圖,右列為Holliday junction 構(gòu)象變換導(dǎo)致Cy3 光強(qiáng)變化的示意圖Fig.4.Observing conformational transformation of Holliday junction by SIFA,observing the Cy3 labeled Holliday junction on glass(a),GO (b) and 400 ℃-2 h-rGO (c),left columns show intensity-time curves of a single Cy3,middle columns show distribution of intensities of Cy3,right columns show schematic representation of the change of Cy3 light intensity caused by the conformational transformation of Holiday junction.

4 結(jié)論

本文進(jìn)一步拓展了課題組研究的SIFA 技術(shù),將修飾了GO 的蓋玻片置于真空管式爐內(nèi)烘烤,通過控制溫度獲取不同還原程度的rGO,從而調(diào)控特征淬滅距離,使得該方法廣泛用于具有二維體系的單分子研究.本文采用熒光標(biāo)記的DNA 測量出了300 ℃-2 h-rGO 的d0=(6.3±0.5) nm,400 ℃-2 hrGO的d0=(7.9±0.5) nm.可預(yù)計(jì)的結(jié)果是在室溫和400 ℃之間改變還原溫度能夠?qū)崿F(xiàn)d0從4 nm到7.9 nm 的連續(xù)調(diào)節(jié).本文分別在400 ℃-2 h-rGO和GO 上對Cy3 標(biāo)記的Holliday junction 進(jìn)行觀察,GO 不能探測到Cy3 光強(qiáng)發(fā)生變化,而400 ℃-2 h-rGO 上可以看到Cy3 的光強(qiáng)不斷地在高低之間跳變,并通過光強(qiáng)計(jì)算出了Cy3 和rGO 表面的距離,計(jì)算結(jié)果和理論距離接近,表明基于rGO的SIFA 不僅提升了SIFA 的適用范圍,更具有較高的測量精度以及空間分辨率.此外,由于rGO 本身不發(fā)熒光,在進(jìn)行單分子熒光成像時(shí)并不會(huì)影響圖像的信噪比,將SIFA 技術(shù)和FRET 技術(shù)聯(lián)用起來可以實(shí)時(shí)地觀察生物大分子的三維運(yùn)動(dòng)與構(gòu)象變換信息.期待未來在膜蛋白功能和結(jié)構(gòu)的研究中,rGO-SIFA 技術(shù)能得到更廣泛的應(yīng)用.