申克孢子絲菌基因分型的研究現(xiàn)狀與展望

趙莉佩 崔巖 李珊山

(吉林大學第一醫(yī)院皮膚性病科，長春 130021)

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·綜述·

申克孢子絲菌基因分型的研究現(xiàn)狀與展望

趙莉佩 崔巖 李珊山

(吉林大學第一醫(yī)院皮膚性病科，長春 130021)

申克孢子絲菌以往被認為單一菌種，呈全球性分布。然而不同區(qū)域來源的菌株，在藥物敏感性、致病力等方面差異較大。RAPD、RFLP等多種分子生物學技術曾被用于該菌基因分型的探討。近年來，以CAL基因結合菌株表型的分類方法，已成為申克孢子絲菌復合體公認的劃分方法。本文將對申克孢子絲菌的基因分型方法進行綜述，并著重闡述CAL基因分型的研究進展。

申克孢子絲菌；孢子絲菌?。换蚍中?；鈣調蛋白基因

[Chin J Mycol，2016，11(5):316-320]

1 概 述

孢子絲菌病 (sporotrichosis)是一種亞急性或慢性皮下組織真菌病，其致病菌為雙相型申克孢子絲菌 (Sporothrixschenckiisensulato)。該菌是一種腐生真菌，在自然界廣泛存在，并分布于世界各地，尤其以熱帶和亞熱帶多見，主要流行地區(qū)包括拉丁美洲、南非、印度、日本等地[1]，在我國各個省市均有報道[2]。

研究者發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的孢子絲菌病的臨床表現(xiàn)、菌株的致病力和藥物敏感性存在差異。流行病學顯示，孢子絲菌病在中國主要以固定型為主[3-7]，而巴西、秘魯、委內瑞拉等拉美國家以淋巴管型為主[2,8-10]。藥敏結果顯示，來自委內瑞拉的菌株對特比萘芬的MIC值最低，烏拉圭的菌株對伊曲康唑的MIC值最高[11]，而來源于中國[12]或印度[13]的菌株對伊曲康唑或伏立康唑的MIC值普遍低于巴西[14]的菌株。另外，不同地區(qū)菌株基因多態(tài)性與臨床分型的關系存有爭議[15-16]。可見，不同地區(qū)來源的菌株存在著顯著的差異，研究者甚至推測這些菌株可能不是單一種。因此，研究者一直試圖利用多種分子標記的方法對申克孢子菌進行基因多態(tài)性的研究，以期解答上述問題。本文將對申克孢子絲菌的基因分型研究加以綜述。

2 限制性片段長度多態(tài)性分析 (RFLP)

線粒體DNA (mtDNA)具有母系遺傳、拷貝數(shù)多、突變率高、極少發(fā)生重組等特性，在菌種鑒定和基因分型中具有重要的研究意義。日本學者Ishizaki及其課題組多年致力于通過限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法分析申克孢子絲菌mtDNA多態(tài)性。該課題組將分別來自墨西哥、危地馬拉、哥斯達黎加、美國、巴西、印度、日本和中國等地申克孢子絲菌臨床分離株的mtDNA進行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)片段產物可分為31個型別[17-18]，根據系統(tǒng)進化樹可將其分型分為2群：A群以南非、北美、中美和南美的菌株為主，B群以東亞、東南亞和大洋洲菌株為主。但近年來根據CAL基因結合表型特征將申克孢子絲菌重新劃分為6個種[19]，并發(fā)現(xiàn)每個種群地理分布有所不同[20]，其中常見致病菌球形孢子絲菌呈全球性分布，申克孢子絲菌 (S.schenckiisensustricto)主要分布于美國、阿根廷、巴西、秘魯?shù)让乐迖?，巴西孢子絲菌主要分布于巴西地區(qū)。上述申克孢子絲菌mtDNA的種系發(fā)生與地理關系密切，但申克孢子絲菌的重新劃分說明申克孢子絲菌不同菌種的存在，不同地區(qū)有其優(yōu)勢菌種，因此申克孢子絲菌mtDNA多態(tài)性仍需進一步探討。

3 隨機擴增DNA多態(tài)性 (RAPD)

隨機擴增DNA多態(tài)性 (random amplified polymorphic DNA，RAPD)是指利用隨機引物對基因組DNA進行擴增，基因組中堿基的缺失、重排、插入或突變，會形成圖譜條帶的多態(tài)性。國內學者廉翠紅、李麗莉、涂正可等分別[21-23]應用RAPD對來自不同地區(qū)、臨床型別各異的申克孢子絲菌株進行DNA多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)菌株基因組的帶型與地區(qū)來源相關，而Reis等[24]應用RAPD分析Rio de Janeiro的45株菌株，其中25株來源于當?shù)氐呢?，另外包?株來源于美國的菌株，發(fā)現(xiàn)當?shù)氐木昱c來源于美國的菌株存在明顯差異，但本地菌株的基因分型與地理區(qū)域并無相關性；另外，Kong等[15]利用RAPD的方法對15株來源于中國地區(qū)的固定型和淋巴管型臨床株進行基因分型，認為不同臨床型別的分離株分型與臨床分型相關，而Mesa-Arango對來自加勒比海地區(qū)的44株申克孢子絲菌，利用同樣方法分析，認為臨床分型與菌株的基因型無關[16]。

目前研究表明中國地區(qū)以球形孢子絲菌為主，而球形孢子絲菌呈全球性分布其進化與地域分布無明顯相關性，而上述研究表明應用RAPD分析基因分型與地域來源或臨床型別的相關性，仍存有爭議，并且需要利用多個引物共同分析，可能更適于區(qū)域內的菌株分型，因此作者認為我國病原菌株需進一步分類與鑒定。

4 擴增片段長度多態(tài)性 (AFLP)

AFLP是在RFLP基礎上，結合特異性引物擴增，而建立的一種分子標記技術。Neyra等[25]應用擴增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP)對來自秘魯、墨西哥等國家的43株申克孢子絲菌進行了多態(tài)性的分析，結果發(fā)現(xiàn)來自秘魯?shù)?2株菌株可分為兩群，其中A群23株，B群9株，但秘魯?shù)木昊蚍中团c其地理來源與臨床型別無關；非美洲國家的菌株僅南非的菌株與秘魯?shù)木昊蚍中徒咏?。該實驗由于菌株地理來源有限，實驗結果并未完全闡明不同國家間菌株的親緣關系。雖然AFLP具有重復性強、信息量大、多態(tài)性高等優(yōu)點，但該方法操作繁瑣、技術和設備要求較高，因此AFLP在申克孢子絲菌分型方面的研究相關報道較少。

5 rDNA序列分析

ITS區(qū) (Internal Transcribed Spacer)序列具有適合的保守性和可變性，使其作為進行真菌種間分類及種內分型最可靠方法之一。de Beer[26]等人利用ITS序列對申克孢子絲菌和其有性世代Ophiostomastenoceras進行分析，發(fā)現(xiàn)應用該方法可以區(qū)分申克孢子絲菌的臨床株和環(huán)境株，并且作者從系統(tǒng)進化樹中推測申克孢子絲菌可能分為不同的種。Galhardo等[14]利用ITS序列構建的系統(tǒng)樹顯示，盡管來自西班牙和巴西的菌株相似度約為90%，但兩者的菌株明確分為兩個群。

雖然利用ITS區(qū)序列進行基因分型可靠性和分辨率均較好，但是測序所需時間較長，操作繁瑣，并不適用于臨床的分型研究工作。研究者為了解決上述問題，將ITS與RFLP結合，進行了探討。Watanabe等[27]將204株菌株應用RFLP對ITS序列進行分析，PCR產物結果顯示，ITS-RFLP可分為4個rDNA類型 (Ⅰ-Ⅳ)，該結果支持了Ishizaki等人的分型結果，其中Ⅰ-Ⅲ型與A群一致，Ⅳ型與B群一致,Ⅰ型主要見于非洲、美洲，Ⅱ型主要見于南美，Ⅲ型主要見于北美，Ⅳ型主要見于澳洲和亞洲。Zhang等[28]利用RFLP對基因進化速率更快的非轉錄間隔區(qū) (Nontranscribed Intergenic Spacer，NTS)進行分析，結果表明來自中國的31株臨床株的NTS區(qū)可以分為15種帶型，并認為NTS區(qū)的多態(tài)性與菌株來源或臨床型別相關。

6 鈣調蛋白基因序列分析 (CAL)

盡管各國相關學者一致認為不同地區(qū)來源申克孢子絲菌的存在顯著差異，甚至申克孢子絲菌可能為幾個隱種 (cryptic species)的復合體[26,29]，但始終無法將基因型別與菌株表型相結合，區(qū)分申克孢子絲菌復合體不同種之間的差異。

2006年，Marimon等[30]通過對不同地理來源的60株菌株進行多基因位點 (幾丁質酶、β-tubulin、鈣調蛋白)序列分析，結果表明申克孢子絲菌至少存在6個地理分布不同的基因亞型，并發(fā)現(xiàn)鈣調蛋白基因位點提供的信息量最大。CAL基因大小約685個bp，其中不變位點474個，信息位點180個，非信息性位點34個。為進一步證實上述結果，Marimon等[31]對127株申克孢子絲菌進行表型特征和基因型的比較，發(fā)現(xiàn)CAL基因對區(qū)分申克孢子絲菌復合體種間差異具有一定特異性，且形態(tài)學、生理學等表型特征與CAL序列分析結果一致。最終，Marimon等[19]將申克孢子絲菌 (Sporothrixschenckiisensulato)確定為6個種的復合體 (complex)，包括狹義申克孢子絲菌 (S.schenckiisensustricto)、球形孢子絲菌 (S.globosa)、巴西孢子絲菌 (S.brasiliensis)、盧艾里孢子絲菌 (S.luriei,formly namedS.var.luriei)、墨西哥孢子絲菌 (S.mexicana)和蒼白球孢子絲菌 (S.pallida,synonymyS.albicans)(見圖1)，其中，球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌和墨西哥孢子絲菌為新鑒定的菌種。球形孢子絲菌、申克孢子絲菌 (S.schenckiis.str)和巴西孢子絲菌為常見致病菌；盧艾里孢子絲菌非常少見，僅有1例已證實來自南非[32]及2例未證實來自意大利[33-34]的感染病例；近年在南非、葡萄牙等地發(fā)現(xiàn)墨西哥孢子絲菌[35-37]與蒼白球孢子絲菌[38]的數(shù)例感染人類病例，多見于免疫抑制患者。

Marimon提出的分類法得到了多種分型方法的驗證。Zhang[20]等應用AFLP將來自世界各地的122株病原株分為13個group，盡管球形孢子絲菌地理來源廣泛，但均在一個group中；來自巴西的巴西孢子絲菌由3個group組成，各群區(qū)分與地理區(qū)域并無相關性；狹義申克孢子絲菌由5個group組成，與多位點序列分析 (CAL，TEF1，TEF3)分型一致，地理來源差異很小。Zhou等[39]利用ITS和β-tubulin通過構建系統(tǒng)樹也可將申克孢子絲菌復合體區(qū)分開。

圖1 申克孢子絲菌復合體表型鑒別要點[1]

Fig.1 Identification keys forSporothrixspecies of clinical interest,based on morphological and phenotypic tests

Rodrigues課題組分別發(fā)現(xiàn)滾環(huán)擴增 (Rolling Circle Amplification，RCA)、特異性擴增和限制性酶切[40-42]可以將不同菌種的CAL基因明確區(qū)分不同的帶型；Oliveira[43]等發(fā)現(xiàn)應用非特異引物T3B對gDNA進行擴增后，可以區(qū)分4種菌株，該課題組進一步利用MALDI-TOF-MS[44]分析申克孢子絲菌復合體，發(fā)現(xiàn)各菌體代謝產物質譜具有種特異性；Sasaki等[45]利用脈沖電場凝膠電泳 (pulsed field gel electrophoresis，PFGE)的方法，發(fā)現(xiàn)申克孢子絲菌復合體染色體的帶型和大小存在多態(tài)性，雖然該方法難以區(qū)分菌種，但作者認為通過帶型可以推測菌株的致病力強弱。

7 展 望

新分類法的提出，表明不同地域有其相應申克孢子絲菌復合體的優(yōu)勢菌種。動物實驗結果顯示，不同菌種的致病力存在一定的差異：巴西孢子絲菌與狹義申克孢子絲菌毒力最強，接種后小鼠的致死率及感染的播散能力均高于其他種，之后依次是球形孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌，蒼白球孢子絲菌毒力最弱，這與各地區(qū)臨床表現(xiàn)基本一致[46]。最近研究表明，致病力差異的重要原因可能由菌種的表面抗原差異造成[47]。來自多地的藥敏試驗報告表明[48-50]，巴西孢子絲菌、狹義申克孢子絲菌和球形孢子絲菌均對特比萘芬最為敏感(MIC GM 0.06-0.23 μg/ml)，但對伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B等藥物的MIC值差異較大，這是由實驗標準 (培養(yǎng)溫度、孢子濃度)不同造成的。因此，藥敏試驗需多中心采用統(tǒng)一標準，相互協(xié)助開展。

我國目前已知的申克孢子絲菌主要以球形孢子絲菌為主[51-52]，近年曾在江西地區(qū)發(fā)現(xiàn)狹義申克孢子絲菌[53]，而其他地區(qū)未見報道，相關研究需加以驗證。以CAL基因構建的系統(tǒng)進化樹中，我國球形孢子絲菌同處于一個群，但可分為2個亞群，這兩個亞群的菌株和地理分布是否相關尚不清楚。

綜上，申克孢子絲菌的重新劃分開啟了孢子絲菌研究的新領域。在新的分類法指導下，可以將CAL基因測序結合AFLP、mtDNA-RFLP、RAPD、T3B fingerprint等分子標記技術，深入探討種內基因分型與臨床類型、地域來源、藥物敏感性、菌株毒力相關性，以期為孢子絲菌病的臨床診斷與治療提供依據。

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[本文編輯] 王 飛

Research status and prospect of genotyping ofSporothrixschenckiisensulato

ZHAO Li-pei，CUI Yan，LI Shan-shan

(DepartmentofDermatologyandVenereology，F(xiàn)irstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

Sporothrixschenckiisensulato,previously considered to be a single species,has a worldwide distribution.Nevertheless,strains from different geographical regions differ greatly in their pathogenicity and susceptibility to different drugs.A wide variety of molecular techniques such as random amplified polymorphic DNA (RAPD),restriction fragment length polymorphism (RFLP) have been investigated for genotyping of the fungi.In recent years,classification methods based on calmodulin (CAL) gene and phenotypic features have been accepted to distinguish isolates in theSporothrixschenckiicomplex.The genotyping methods ofSporothrixschenckiis.l.have been summarized in this article and focus on the research progress of CAL gene.

Sporothrixschenckii;sporotrichosis;genotype;calmodulin gene

國家自然科學基金 (81573060)；吉林省科技廳科技創(chuàng)新人才培育計劃 (20150520039JH)

趙莉佩，女 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:zhaolp810@163.com

李珊山,E-mail:shansalee@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0316-05

2016-06-16