靈芝單、雙核菌絲差異研究

葉麗云,魯 欣,林 強,吳小平

(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350002)

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靈芝單、雙核菌絲差異研究

葉麗云,魯 欣,林 強,吳小平

(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350002)

通過菌絲形態(tài)特征、生長速度以及多糖和三萜含量的差異分析靈芝單核、雙核差異,同時應(yīng)用高效液相色譜法比較了靈芝單核、雙核菌絲指紋圖譜,并采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究三萜關(guān)鍵酶基因表達(dá)量。結(jié)果顯示,雙核菌株J-7/AL-2菌絲生長旺盛且整齊,單核菌株菌絲長勢較弱。雙核菌株的生長速度(0.55 cm/d)明顯快于兩株單核菌株(p<0.05)。單核菌株J-7多糖含量(42.11 mg/g)較雙核菌株高出20.8%。雙核菌株三萜含量(42.5 mg/g)顯著高于單核菌株30%左右(p<0.05)。高效液相色譜結(jié)果顯示,雙核菌株與兩株單核菌株在三萜組分上存在一定的差異,相似度為0.82;兩株單核菌株的菌絲三萜組分相似度極高,相似度達(dá)0.96。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,雙核菌株的6個三萜關(guān)建酶基因的表達(dá)量都要顯著高于其他兩株單核菌株,說明基因表達(dá)可能存在協(xié)調(diào)增效作用。

單核菌絲,雙核菌絲,多糖,三萜

靈芝是一種我國傳統(tǒng)的藥用真菌。隨著科研人員對靈芝的研究不斷深入,靈芝的營養(yǎng)價值和藥理作用也逐漸被開發(fā)利用。而靈芝的抗腫瘤、抗HIV、保肝和降血壓等藥理作用大部分是與靈芝多糖和三萜等活性成分有關(guān)[1-5]。面對我國靈芝資源與技術(shù)的現(xiàn)狀,迫切需要進一步深化靈芝產(chǎn)業(yè)開發(fā)與應(yīng)用[6]。

目前生產(chǎn)上獲得靈芝多糖和三萜類化合物的主要來源是成熟子實體和液體發(fā)酵的菌絲。而傳統(tǒng)的段木栽培需要消耗大量的木材資源,而且生產(chǎn)周期比較長,同時易受到外界環(huán)境的干擾[7]。近年來食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展,使得靈芝、蟲草、白靈菇等食用菌發(fā)酵菌絲體得到應(yīng)用,通過液體發(fā)酵技術(shù)來提取靈芝的多糖和三萜的周期較短,且操作簡單[8-10]。目前大量的研究主要集中于培養(yǎng)過程中的環(huán)境因素,如培養(yǎng)基的配方優(yōu)化、pH、溶氧和誘導(dǎo)劑的添加等。而對靈芝液體深層發(fā)酵中菌種的選育鮮有報道,且傳統(tǒng)液體發(fā)酵的研究對象均為雙核菌株,單核菌株的研究則主要應(yīng)用于雜交育種領(lǐng)域[11],而對于靈芝單核菌株活性成分的研究鮮有報道。

靈芝三萜的生物合成主要是通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA pathway)來完成的[12-13]。這個過程是以乙酰輔酶A為底物經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)形成異戊烯基焦磷酸(IPP),異戊烯基焦磷酸再經(jīng)過多步的酶催化反應(yīng)形成羊毛茲醇,最后由羊毛茲醇經(jīng)過各種氧化修飾形成不同類型的靈芝酸單體。近些年,Zhao[14]等已經(jīng)克隆出了一些靈芝三萜合成途徑中的關(guān)鍵酶基因,并對其功能進行了驗證,包括3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGS)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)錄水平還原酶(HMGR)、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合酶(SQS)和羊毛茲醇合酶(LS)。通過這六個關(guān)鍵基因的表達(dá)情況有助于進一步分析靈芝中三萜含量的差異。

本研究通過對比靈芝單雙核菌絲形態(tài)特征、生長速度以及液體發(fā)酵條件下菌絲多糖和三萜的成分差異,結(jié)合高效液相職位圖譜及六個關(guān)鍵基因表達(dá)量進行對比分析,以期為選育靈芝優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株提供理論依據(jù),并對靈芝活性成分研究及三萜合成分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株 由擔(dān)孢子萌發(fā)而來的靈芝單核菌株J-7和AL-2,方法參考柯斌榕等[15],以及它們雜交的雙核菌株J-7/AL-2,由福建省種質(zhì)資源保藏與管理中心提供;固體PDA培養(yǎng)基 200 g馬鈴薯加入1000 mL水煮沸后用四層紗布過濾,浸出液加入20 g瓊脂煮到完全溶解,最后加入20 g葡萄糖攪拌均勻,定容至1000 mL;液體PDA培養(yǎng)基 200 g馬鈴薯煮沸浸出液加入20 g葡萄糖攪拌均勻,定容至1000 mL;無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、苯酚、高氯酸、香蘭素、冰醋酸、氯化鈉等 均為國產(chǎn)分析純試劑;甲醇、乙腈 色譜純;Omega植物RNA提取試劑盒 Omega公司;TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒 全式金生物技術(shù)有限公司;Bio-rad熒光定量試劑盒 伯樂生物有限公司。

分析天平 奧豪斯儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申工科技有限公司;超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;紫外可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器有限公司;超快速分離液相色譜儀 日本島津;Stepone plus型熒光定量PCR儀 ABI公司;多用電泳儀 北京三恒公司;DNA檢測儀 NanoDrop;Tanon凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司;BIO-RAD CFX96 PCR儀 天津鈞星瑞科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試菌株菌落形態(tài)觀察 將母種接種到PDA斜面活化好后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板的中心,置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng),在三種菌株中有一株菌絲剛長滿平板時進行觀察并拍照。

1.2.2 單雙核菌株生長速度的測定 取剛長滿平板的活化菌株,用9 mm的打孔器在同一圓周的位置上打出相同的菌絲塊。無菌操作下將菌絲塊接種到倒有PDA培養(yǎng)基的平板中心。將平板置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。等到菌絲開始萌發(fā)長到1 cm左右,在菌落的邊緣劃起始生長線,等到生長最快的菌絲快要長滿平板時,取出所有平板,在菌落的邊緣劃終止生長線,采用十字交叉法用尺子測量起始生長線與終止生長線之間的距離,并按照如下公式計算菌絲的生長速度

菌絲生長速度(cm/d)=起始生長線與終止生長線之間的距離(cm)/菌絲生長的天數(shù)(d)

1.2.3 菌絲液體培養(yǎng)和收集 取剛長滿平板的活化菌株,用9 mm的打孔器在同一圓周的位置上打出相同的菌絲塊。無菌操作下取8塊菌絲塊接種到裝有100 mL液體PDA的250 mL三角瓶中,置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃靜置培養(yǎng),培養(yǎng)2周后用紗布收集菌絲并除去接種塊,用蒸餾水反復(fù)洗滌3次,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重。

2017 年春節(jié)期間該站點監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示， ρ(PM2.5) 、 ρ(PM10) 最大值分別為 142μg/m3、172μg/m3。同時，ρ(PM2.5) /ρ(PM10) 平均值為74.5%，表明春節(jié)期間南京市城區(qū)細(xì)粒子所占比例較大。二次無機離子SNA(NO3-、SO42-、NH4+)共占總離子濃度的81.5%，這表明了大氣二次污染較為嚴(yán)重。

1.2.4 靈芝菌絲生物量的測定 于分析天平上準(zhǔn)確稱量1.2.3中得到烘干菌絲的重量并記錄。

1.2.5 靈芝菌絲粗多糖的提取與測定 多糖的提取方法參考胡斌杰等的方法[16]。稱取0.1 g的靈芝菌絲粉,90 ℃熱水浸提4 h,料液比為1∶20。離心收集上清液,重復(fù)提取一次,合并2次提取液。醇沉過夜,然后5000 r/min離心10 min,棄去上清液,所得沉淀用2 mL蒸餾水溶解,最后用sevag法去除蛋白,吸取上層清液用蒸餾水定容至25 mL。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[17]。每組3個重復(fù)。

1.2.6 靈芝菌絲總?cè)频奶崛∨c測定 菌絲三萜的提取參考湯坤鵬的方法[18]。稱取0.2 g靈芝菌絲體粉,并加入30 mL的85%乙醇常溫浸提2 h,然后進行超聲提取0.5 h,功率為150 W。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃減壓蒸餾去除乙醇,最后用甲醇定容至25 mL。采用香草醛-冰醋酸法[19]測定總?cè)坪俊Ｃ拷M3個重復(fù)。

1.2.7 高效液相色譜檢測 以0.1%乙酸水為流動相A和乙腈為流動相B進行梯度洗脫,色譜柱為Inertsustain C18,柱溫為40 ℃,流速為0.8 mL/min,檢測波長為254 nm,進樣量為10 μL。所有檢測三萜樣品需過0.45 μm的有機濾膜后上機進樣檢測[20]。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版中應(yīng)用平均值法生成對照指紋圖譜進行相似度分析。

1.2.8 三萜關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量的檢測 內(nèi)參基因為GADPH,關(guān)鍵基因HMGS、HMGR、MVD、FPS、SQS、LS引物設(shè)計參考Xu[21]等報道,引物設(shè)計由上海生工合成。

表1 內(nèi)參基因與6個目標(biāo)基因的引物序列

收集液體靜置培養(yǎng)2周后的靈芝單、雙核菌絲,立即儲存于液氮中。使用Omega植物RNA提取試劑盒提取菌絲的總RNA。使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA。反應(yīng)體系如表2。擴增程序為42 ℃,15 min;80 ℃,5 s;4 ℃保存。獲得的短片段cDNA用于后續(xù)的熒光定量。

表2 反轉(zhuǎn)錄RNA反應(yīng)體系

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

將六個基因在菌株AL-2中的表達(dá)量設(shè)為1,其他菌株相對應(yīng)的表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔT法計算得到[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS、DPS軟件、中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版;每個實驗處理設(shè)計3個重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單雙核菌株的形態(tài)特征

觀察單核菌株和雙核菌株的菌落形態(tài)特征,如圖1所示,發(fā)現(xiàn)雙核菌株和單核菌株之間菌落形態(tài)存在明顯的差異。雙核菌株在平板上的生長速度快于單核菌株。雙核菌株J-7/AL-2菌絲生長旺盛且整齊,單核菌株AL-2菌絲長勢最弱,且生長邊緣比較不規(guī)則。而單核菌株J-7的菌絲相對稀疏。

圖1 三菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology of three strains

2.2 單雙核菌株在PDA培養(yǎng)基的生長速度

對單雙核菌株的生長速度差異性進行分析結(jié)果如圖2所示,單雙核菌株的生長速度差異顯著,且雙核菌株的生長速度明顯快于兩株單核菌株。雙核菌株J-7/AL-2的生長速度為0.55 cm/d,是生長速度較慢的單核菌株AL-2的兩倍(p<0.05)。

圖2 三菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長速度Fig.2 The growth rate fo three strains in PDA culture-medium注 *表示與J-7/AL-2有顯著差異(p<0.05)。

2.3 靈芝單雙核菌絲多糖和三萜含量的比較

比較了靈芝單雙核菌株生物量、菌絲多糖和三萜含量的差異,結(jié)果如表4所示。在液體靜置培養(yǎng)2周后,單雙核菌株在液體表面均形成一層白色的菌絲層。雙核菌株J-7/AL-2的生物量極顯著(p<0.01)高于兩株單核菌株,兩株單核菌株之間差異不顯著。單核菌株J-7的菌絲多糖含量最高,約為42.11 mg/g與其他兩株菌株差異極顯著(p<0.01),高出雙核菌株20.8%。而雙核菌株J-7/AL-2與單核菌株AL-2菌絲多糖含量差異不顯著。雙核菌株J-7/AL-2的總?cè)坪匡@著高于兩株單核菌株(p<0.05)。雙核菌株的總?cè)坪考s為42.54 mg/g,比兩株單核菌株高出30%左右。

表4 靈芝單雙核菌絲多糖和三萜含量比較

注:同列不同小寫字母表示顯著差異(p<0.05);不同大寫字母表示極顯著差異(p<0.01)。

2.4 靈芝單雙核菌絲三萜指紋圖譜分析

圖3是單雙核菌株液體靜置培養(yǎng)下HPLC指紋圖譜比較。從圖3中可以看出單雙核菌株在組分上存在著相似性,同時也存在差異性。不同菌株在相同組分上也存在著表達(dá)量的差異。如雙核菌株在14.9 min有一個峰,而在兩株單核菌株中都未被檢測到。表2為單雙核菌株液體靜置培養(yǎng)三萜相似度比較。從表5中可以看出,液體靜置培養(yǎng)方式下雙核菌株J-7/AL-2在三萜組分上與兩株單核菌株存在一定的差異性。在兩株單核菌株的三萜組分相似度很高,達(dá)到了96.2%。

圖3 三菌株液體靜置培養(yǎng)HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint of three strains in liquid static cultures注:S1為雙核菌株J-7/AL-2,S2為單核菌株J-7,S3為單核菌株AL-2,R為對照指紋圖譜;表2同。

S1S2S3RS1(J-7/Al-2)10 8260 8160 899S2(J-7)10 9620 983S3(AL-2)10 979R1

2.5 靈芝單雙菌絲三萜關(guān)鍵酶基因差異分析

運用熒光定量PCR技術(shù)對靈芝雙核菌株J-7/AL-2和單核菌株J-7與AL-2在液體靜置培養(yǎng)下2周的菌絲三萜關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進行了分析。結(jié)果如圖4所示,六個三萜關(guān)鍵酶基因在雙核菌株J-7/AL-2中的表達(dá)量均顯著高于2株單核菌株(p<0.05)。其中HMGS和HMGR的差異最大,雙核菌株J-7/AL-2的HMGS基因表達(dá)量是單核菌株J-7的13.5倍,同時也是單核菌株AL-2的6.5倍,而雙核菌株J-7/AL-2的HMGR基因表達(dá)量是單核菌株J-7的10.8倍,同時也是單核菌株AL-2的7倍。而其他四個基因也都存在著顯著性差異。這可能與雙核菌株中2個細(xì)胞核出現(xiàn)了相互作用有關(guān),使得三萜關(guān)鍵酶基因出現(xiàn)了變化,在雙核菌株中基因出現(xiàn)了協(xié)調(diào)增效作用。單核菌株AL-2在HMGS、HMGR和MVD的基因表達(dá)量上比單核菌株J-7要高,而在FPS和SQS的基因表達(dá)量比單核菌株J-7要低。兩個菌株在LS基因的表達(dá)量上差異不大。

圖4 六個三萜關(guān)鍵酶基因在三菌株中的表達(dá)情況Fig.4 Expression levels of six triterpene genes in three strains

3 結(jié)論

通過比較靈芝單雙核菌株生長速度發(fā)現(xiàn)雙核菌株J-7/AL-2的生長速度為0.55 cm/d顯著高于兩單核菌株(p<0.05)。單雙核菌株的生物量檢測結(jié)果表明雙核菌株的生物量為0.64 g,極顯著(p<0.01)高于單核菌株。采用苯酚-硫酸法測定單雙核菌株中多糖的含量,測得單核菌株J-7的菌絲多糖含量最高,約為42.11 mg/g與其他兩株菌株差異極顯著(p<0.01),高出雙核菌株20.8%。而雙核菌株J-7/AL-2與單核菌株AL-2菌絲多糖含量差異不顯著。這與連瑞麗[23]、Niederpruem[24]等報道的單核菌株在產(chǎn)菌絲多糖能力上不弱于雙核菌株,有的甚至高于雙核菌株的結(jié)果相一致。通過香草醛-冰醋酸法檢測菌絲中三萜含量發(fā)現(xiàn)雙核菌株J-7/AL-2的總?cè)坪考s為42.54 mg/g,比兩株單核菌株高出30%左右,顯著高于兩株單核菌株(p<0.05)。HPLC技術(shù)對比單雙核菌株的三萜指紋圖譜可以看出單雙核菌株產(chǎn)三萜組分存在一定的差異,單核菌株之間的三萜組分差異不大。在雙核菌株J-7/AL-2中,HMGS、HMGR、MVD、FPS、SQS和LS基因均明顯的上調(diào),表明雙核菌株在三萜合成能力上得到加強,這與雙核菌株在液體培養(yǎng)中總?cè)坪烤哂趩魏司甑难芯拷Y(jié)果相一致。

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Study on the differences of monokaryotic mycelium and dikaryotic mycelium ofGanodermalucidum

YE Li-yun,LU Xin,LIN Qiang,WU Xiao-ping*

(Mycological Research Center of Fujian Agricultural and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

The morphological characteristics,growth rate,and the difference of the contents of polysaccharides and triterpenoids of monokaryotic mycelium and dikaryotic mycelium ofGanodermalucidumwere compared. Meanwhile,the fingerprint of triterpenoids ofGanodermalucidumwas analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC)method and the expression levels of six triterpeniods enzyme genes were analyzed by real-time quantitative PCR. The result showed that the dikaryotic strain J-7/AL-2 grew vigorously and neatly while monokaryotic strain grew weaker. The growth rate of dikaryotic strain(0.55 cm/d)was significantly faster than that of the two strains with thep<0.05. The content of polysaccharide of monokaryotic strain J-7(42.11 mg/g)was higher than dikaryotic strain out of 20.8%. The content of the triterpenoids(42.5 mg/g)was significantly higher than that of monokaryotic strain about 30% and thep<0.05. The result of HPLC showed that there was a certain difference between the fingerprints of dikaryotic strain and two monokaryotic strains and the similarity was 0.82. But the triterpenoids compounds of two monokaryotic strains had the highest similarity at 0.96. The result of real-time quantitative PCR showed that the expression of six triterpeniods enzyme genes in dikaryotic strain J-7/AL-2 was much more than two monokaryotic strains because of synergistic gene expression effect.

monokaryotic strain;dikaryotic strain;polysaccharide;triterpenoids

2016-04-18

葉麗云(1991-)，女，碩士，主要從事食用菌遺傳育種研究，E-mail：jhyeliyun@126.com。

*通訊作者:吳小平(1965-)，男，博士，教授，從事食用菌教學(xué)與研究，E-mail：fjwxp@126.com。

福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程專項項目(2014S1477-21)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000