響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法提取繡球菌多糖

蔣孟如,王錫昌,胡曉倩,陶寧萍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法提取繡球菌多糖

蔣孟如,王錫昌,胡曉倩,陶寧萍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

為了提高得率,本文采用纖維素酶提取繡球菌多糖。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比、pH、對(duì)多糖得率的影響。在此基礎(chǔ)上,選取對(duì)多糖得率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。最優(yōu)工藝為:酶添加量為1.3%、酶解溫度為40 ℃、酶解時(shí)間2.5 h、液料比42 mL/g、pH為5.5,在此條件下多糖得率為22.90%±0.26%。

繡球菌,多糖,纖維素酶,響應(yīng)面分析

繡球菌[Sparassiscrispa(Wulf.)Fr.],又名荷仙菇、花瓣菇等,隸屬真菌界,擔(dān)子菌門(basidiomycota),異隔擔(dān)子菌綱(Heteroba-sidiomycetes)、無(wú)褶菌目(Aphyllophorales)、繡球菌科(Sparassidaceae)[1]。它是一種藥食兩用的真菌,含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),此外還有豐富的活性多糖,據(jù)報(bào)道,繡球菌活性多糖以葡聚糖為主,其葡聚糖含量占干重的40%～50%[2],大量文獻(xiàn)表明繡球菌多糖能提高人體免疫力[3]、改善機(jī)體造血功能,并具有抗癌、防癌[4-6]的功效。因此分離提取繡球菌中的活性多糖具有很好的應(yīng)用前景。

目前,繡球菌多糖的提取工藝多采用熱水浸提[7-8],但該方法得率較低。而酶法提取具有條件溫和、綠色節(jié)能、產(chǎn)品品質(zhì)好、得率高等特點(diǎn)[9],已在多種植物原料的多糖提取中得到應(yīng)用[10-11]。洪小君等[12]采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶3種酶復(fù)合提取繡球菌多糖,有效提高了得率,但成本較高,并增加了后期多糖純化難度。因此本研究擬選用單一纖維素酶處理提取多糖,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化,以獲得更為經(jīng)濟(jì)高效的繡球菌多糖提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干繡球菌子實(shí)體由上海荷仙菇股份有限公司提供 真空干燥箱中60 ℃烘干,粉碎過200目篩后放于干燥器中備用;纖維素酶(100000 U/g、最適pH4～5) 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司;一水合檸檬酸、濃硫酸、苯酚 分析純,國(guó)藥集團(tuán)有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,Sigma公司。

ZM200超離心研磨儀 弗爾德儀器設(shè)備有限公司;Kjeltec 8400全自動(dòng)定氮儀、Soxtec自動(dòng)索氏抽提系統(tǒng)、Fibertec 2010膳食纖維分析系統(tǒng)Fiber E FOSS福斯分析儀器公司;UV 2003紫外分光光度計(jì) 尼克龍(上海)儀器有限公司;恒溫振蕩器 優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Avanti J-26xP真空冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 一般營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 水分含量:參照GB/T20264-2006常壓干燥失重法測(cè)定;灰分含量:參照GB/T5505-2008馬弗爐550 ℃灼燒法測(cè)定;粗蛋白含量:參照GB/T5009.5-1985凱氏定氮法測(cè)定,測(cè)定總氮后,再乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25,即為粗蛋白含量;粗脂肪含量:參照GB/T5009.6-2003食品中脂肪的測(cè)定方法索氏提取法測(cè)定;膳食纖維含量:參照AOAC 991.43酶-重量法(MES-TRIS緩沖液)測(cè)定。

1.2.2 繡球菌多糖的提取 參考李波等[13]方法作部分修改:取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按一定的液料比加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至4.5,然后加入適量的纖維素酶,一定溫度下水浴振蕩(120 r/min)一定時(shí)間后,迅速于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液稀釋數(shù)倍后進(jìn)行測(cè)定。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15.05+0.0059,R2=0.9992,線性范圍在0～0.05 mg/mL。

繡球菌多糖得率的計(jì)算公式:

式中:C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的多糖的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液的體積,mL;n為提取液稀釋的倍數(shù);M為繡球菌粉末的質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶添加量對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至4.5,分別加入占原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的纖維素酶,混合均勻,50 ℃水浴振蕩2 h,迅速于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液測(cè)定多糖含量。

1.2.3.2 液料比對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按液料比10、20、30、40、50 mL/g加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至4.5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的纖維素酶,混合均勻,50 ℃水浴振蕩2 h,迅速于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液測(cè)定多糖含量。

1.2.3.3 pH對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的纖維素酶,混合均勻,50 ℃水浴振蕩2 h,迅速于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液測(cè)定多糖含量。

1.2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至5.5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的纖維素酶,混合均勻,50 ℃水浴振蕩1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后取出,于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液測(cè)定多糖含量。

1.2.3.5 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.001 g)繡球菌干粉,按液料比40 mL/g加入蒸餾水,低速攪拌至樣品完全分散,用4 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至5.5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的纖維素酶,混合均勻,分別于40、45、50、55、60 ℃水浴振蕩2.5 h,于95 ℃水浴中滅酶10 min,離心10 min(10000 r/min、15 ℃),取上清液測(cè)定多糖含量。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化繡球菌多糖提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取對(duì)多糖得率影響較大的因素酶添加量(A)、液料比(B)、酶解時(shí)間(C)對(duì)繡球菌多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用Box-Behnken中心組合方法。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0單因素方差分析中的LSD、S-N-K法、Origin8.0和Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌的一般營(yíng)養(yǎng)成分

由表2可知,繡球菌含有蛋白質(zhì)、脂肪等一般營(yíng)養(yǎng)成分,其中脂肪含量較低,總膳食纖維含量較高,符合健康食品的理念。與黃建成等人[14]的研究結(jié)果相比,本研究所測(cè)粗蛋白含量偏高和粗脂肪含量偏高,可能是因?yàn)槔C球菌的栽培方式、培養(yǎng)基組成不同。其中,不溶性膳食纖維占總膳食纖維的67%左右,而纖維素作為不溶性膳食纖維的主要成分,是構(gòu)成真菌類細(xì)胞壁的主要物質(zhì),故本研究采用纖維素酶破壞細(xì)胞壁,以提高繡球菌的多糖得率。

表2 繡球菌一般營(yíng)養(yǎng)成分含量(g/100 g干重,n=3)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知,隨著酶添加量的增加,多糖得率先上升后趨于平穩(wěn)。當(dāng)酶添加量為1.2%時(shí),多糖得率達(dá)到最大?？赡苁且?yàn)殚_始階段,酶的活性部位與底物結(jié)合量增加,菌體的細(xì)胞壁逐漸被纖維素酶水解,胞內(nèi)多糖溶出;但當(dāng)酶活性部位與底物數(shù)量濃度飽和時(shí),細(xì)胞壁被水解完全,胞內(nèi)多糖完全溶出,體系趨于平穩(wěn)。因此,酶添加量1.2%為宜。

圖1 酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of enzymatic addition on yield of polysaccharide注:字母不同代表不同多糖得率之間存在顯著性差異(p<0.05)(圖2～5同)。

2.2.2 液料比對(duì)多糖得率的影響 由圖2可知,隨著液料比的增加,多糖得率先增加后下降,當(dāng)液料比為40 mL/g時(shí),多糖得率最大?？赡苁且?yàn)橐毫媳仍黾佑欣谒蚣?xì)胞內(nèi)擴(kuò)散,利于多糖的溶出,但隨著液料比的增加,胞內(nèi)的雜質(zhì)也易于溶出,造成的得率略有下降[15]。因此,液料比40 mL/g為宜。

圖2 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of liquid/solid ratio on yield of polysaccharide

2.2.3 pH對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知,隨著pH增加,多糖得率先增加后減少,當(dāng)pH為4.5時(shí),多糖得率最大。這與纖維素酶的最適pH為4.5有關(guān)。當(dāng)偏離酶的最適pH時(shí),酶活性中心的構(gòu)象甚至整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,甚至?xí)姑赴l(fā)生變性而失活[16],從而導(dǎo)致細(xì)胞壁水解不完全,影響胞內(nèi)多糖無(wú)法溶出。結(jié)果表明,pH在3.5～5.5范圍內(nèi)對(duì)多糖得率無(wú)顯著影響(p<0.05),從經(jīng)濟(jì)和環(huán)保角度綜合考慮,選取pH5.5為后期提取pH,且該因素不作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。

圖3 pH對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of pH value on yield of polysaccharide

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖4可知,隨著酶解時(shí)間的增加,多糖得率先增加后減少,當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí),多糖得率最大?？赡苁且?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加,纖維素酶水解細(xì)胞壁作用增強(qiáng),使得多糖溶出增多;但達(dá)到一定時(shí)間后,多糖的大量溶出使溶液黏度較大,導(dǎo)致體系分散不均勻[17],影響纖維素酶與細(xì)胞壁的結(jié)合,造成多糖得率略有下降。因此,酶解時(shí)間為2.5 h左右為宜。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis time on yield of polysaccharide

2.2.5 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 由圖5可知,隨著酶解溫度的增加,多糖得率先增加后減少,當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),多糖得率最大。可能是因?yàn)槔w維素酶的最適溫度為50 ℃,可以最大程度的水解細(xì)胞壁,使胞內(nèi)多糖溶出,低于或者高于此溫度酶的活性都降低,細(xì)胞壁未被水解完全。但不同酶解溫度下的多糖得率無(wú)顯著差異(p<0.05),綜合考慮節(jié)能和產(chǎn)出經(jīng)濟(jì)因素,選擇酶解溫度為40 ℃,且該因素不作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。

圖5 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on yield of polysaccharide

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不同的pH和酶解溫度對(duì)多糖得率無(wú)顯著性影響,因此選擇在pH為5.5、酶解溫度為40 ℃時(shí),以酶添加量(A)、液料比(B)、酶解時(shí)間(C)為自變量,多糖得率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),共17組,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸方程方差分析表

注:*p<0.05,代表顯著,**p<0.01,代表非常顯著。 運(yùn)用Design-expert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析,分析結(jié)果見表4,得到二次多元回歸方程:Y=22.77+0.46A+0.47B+0.22C+0.19AB+0.25AC-0.12BC-0.82A2-1.43B2-1.17C2。

由表4可知,該模型回歸顯著,失擬項(xiàng)不顯著,無(wú)失擬因素存在,該模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9522,校正決定系數(shù)R2(adj)為0.8907>0.80,變異系數(shù)CV=1.94%,模型擬合程度較好,因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[18]。

由回歸方程的顯著性結(jié)果可以看出,酶添加量(A)、液料比(B)對(duì)響應(yīng)值有影響,各因素的二次方對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響,表明各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值無(wú)顯著影響。各因素的F值可以反映因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性,F值越大,表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大,即重要性越大[19],從方差分析表可知,各因素對(duì)多糖得率影響的強(qiáng)弱次序?yàn)?A(酶添加量)>B(液料比)>C(酶解時(shí)間)。

2.3.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程,作出響應(yīng)面和等高線,考察擬合響應(yīng)面的形狀,分析酶添加量、液料比、提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。各因素及其相互作用對(duì)相應(yīng)值的影響可以通過各圖直觀反應(yīng)出來(lái)。Design-Expert 8.0.6軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線圖見圖6～圖8。

圖6 酶添加量、液料比的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for interactive effect of enzymatic addition and liquid/solid ratio on the yield of polysaccharide

圖7 酶添加量、酶解時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for interactive effect of enzymatic addition and enzymatic hydrolysis time on the yield of polysaccharide

圖6～8直觀的反映了各因素間的交互作用,各曲面都存在最高點(diǎn),即在所選范圍內(nèi)存在最大值,說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。因此,由圖可知,酶添加量和液料比對(duì)多糖得率有影響,表現(xiàn)為曲面陡峭,且隨著數(shù)值的增加或減少,響應(yīng)值有較大變化;各因素的交互作用不顯著,它們對(duì)響應(yīng)值的影響規(guī)律并不會(huì)隨著另一因素的改變而有明顯變化,這也與方差分析表結(jié)果一致。

2.3.3 提取工藝條件的驗(yàn)證 通過Design-Expert8.0.6軟件對(duì)非線性回歸方程進(jìn)行求解,得出理論最優(yōu)三因素的條件為酶添加量1.3%、液料比41.8 mL/g、提取時(shí)間2.56 h。但考慮到實(shí)際操作的可操作性,將提取工藝修正為酶添加量1.3%、液料比42 mL/g、提取時(shí)間2.5 h。在此條件下,連續(xù)進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn),繡球菌多糖得率為(22.90%±0.26%),與預(yù)測(cè)值22.92%接近,說明該方程與實(shí)際情況擬合良好。經(jīng)該方法所得多糖產(chǎn)量?jī)?yōu)于熱水浸提法(多糖得率為9.90%)[8],是一種高效經(jīng)濟(jì)的提取工藝。

3 結(jié)論

本研究用單一纖維素酶法提取繡球菌多糖,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定最佳提取工藝為:酶添加量1.3%、液料比42 mL/g、酶解時(shí)間2.5 h、pH5.5、酶解溫度40 ℃,多糖得率可達(dá)22.90%±0.26%,提高了繡球菌多糖的得率。活性多糖經(jīng)提取純化后可作為功能性食品的原料,也可開展功能活性研究,為繡球菌的深層次開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Optimization of cellulase extraction ofSparassiscrispapolysaccharides using response surface methodology

JIANG Meng-ru1,WANG Xi-chang2,HU Xiao-qian3,TAO Ning-ping1,*

(College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201503,China)

In order to get higher extraction efficiency,the polysaccharides fromSparassiscrispawere extracted using cellulase. A single-factor study was designed to investigate the effects of different factors on the yield of polysarccharides,such as enzymatic addition,enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time,liquid/material ratio and pH value. Based on the results of single-factor assay,several factors were chosen to be further optimized by response surface methodology. The optimal process parameters were shown as following:pH5.5,extraction temperature of 40 ℃,enzymatic addition of 1.3%,hydrolysis time of 2.5 hours,and the liquid/solid ratio of 42 mL/g. Under these above conditions,the content of polysaccharides could be up to 22.90%±0.26%.

Sparassiscrispa;polysaccharide;cellulase;response surface experiments

2016-03-04

蔣孟如(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)評(píng)價(jià),E-mali:1551330742@qq.com。

*通訊作者:陶寧萍(1968-),女,博士,教授,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)評(píng)價(jià),E-mali:nptao@shou.edu.cn。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAD17B01)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000