采用蠶豆根尖微核試驗(yàn)檢測自來水廠水體的遺傳毒性

王 超，阮鴻潔，豆捷雄，段 鏈，張宏偉*

（中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021）

采用蠶豆根尖微核試驗(yàn)檢測自來水廠水體的遺傳毒性

王 超，阮鴻潔，豆捷雄，段 鏈，張宏偉*

（中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021）

飲用水與人類健康和生活密切相關(guān)。我國的飲水衛(wèi)生現(xiàn)狀表明，飲用水的生物性污染和化學(xué)性污染是同時(shí)存在的，但飲用水對(duì)健康的不良影響，除了水質(zhì)被污染的原因外，還有其他一些原因[1]。氯化消毒是我國沿用多年且仍普遍采用的自來水消毒技術(shù)，而且日常飲用水化學(xué)污染物對(duì)健康的危害成了城市飲水安

全面臨的首要問題[2]。目前的一些研究主要是評(píng)價(jià)城市地表水(江、河、湖泊等)的致突變性，對(duì)城市飲用水凈化系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)研究還非常有限[3]。蠶豆根尖微核檢測技術(shù)利用蠶豆初生根尖細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)物反應(yīng)敏感的特點(diǎn)，以細(xì)胞染色體受損傷程度為指標(biāo)，用于檢測污染物對(duì)環(huán)境污染的程度，能更好地反映污染物對(duì)生物和人類的危害狀況，具有化學(xué)監(jiān)測不能達(dá)到的效果，其取材簡便，不受季節(jié)和氣候條件限制而廣泛應(yīng)用于各種污染物的遺傳性檢測[4-5]。本文選取了北方A、B、C 3個(gè)城市6座自來水廠的水源水、出廠水、末梢水共12個(gè)水樣，分別利用蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)進(jìn)行了遺傳毒性檢測。該方法簡單、靈敏，可有效的評(píng)價(jià)飲用水凈化系統(tǒng)潛在的遺傳毒性效應(yīng)，為評(píng)價(jià)城市飲用水水質(zhì)，保障居民的安全用水提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

松滋青皮蠶豆選用常州市環(huán)境監(jiān)測中心培植的松滋青皮蠶豆。無水乙醇、醋酸、鹽酸等均為市售國產(chǎn)分析純?？ㄖZ氏固定液(乙醇和冰醋酸按照體積比3∶1配制)，席夫(Schiff)試劑購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采樣點(diǎn)的布設(shè)和水樣采集 于2015年4月份分別選擇A、B、C 3市共6個(gè)自來水廠作為采樣點(diǎn)，這些自來水廠水質(zhì)處理均采用絮凝沉淀與過濾后氯化消毒凈化工藝。水樣采集共設(shè)3個(gè)采樣點(diǎn)，分別為待凈化工藝處理的水廠水源水、經(jīng)氯化消毒后的出廠水以及管網(wǎng)末梢水。A、B、C 3市自來水廠水源水分別為：地下水、周邊水庫水以及南水北調(diào)水的混合水；南水北調(diào)水以及灤河河水的混合水；水庫水。各水廠具體的氯化消毒工藝為：A市4座水廠均采用次氯酸鈉消毒；B市為氯胺消毒；C市為二氧化氯消毒。每個(gè)采樣點(diǎn)平行取3個(gè)水樣，每個(gè)水樣100mL，裝于潔凈棕色玻璃瓶中，并置于4℃冰箱中避光保存，盡快分析。去離子水作為陰性對(duì)照。A市采集了自來水1廠的出廠水、2廠出廠水、3廠水源水與出廠水、4廠出廠水與末梢水。B市采集了某水廠的水源水、出廠水及末梢水。C市采集了某水廠的水源水、出廠水及末梢水作為檢測對(duì)象。

1.2.2 蠶豆根尖的培養(yǎng)及處理 蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》(2002)測定[6]。將蠶豆于25℃恒溫箱中浸泡24h后催芽，待初生根長至2～3 cm，選取初生根尖生長良好，根長一致的種子放入盛有被測液的培養(yǎng)皿中，被測液浸沒根尖即可，染毒24h。將染毒后的種子用蒸餾水浸洗3次，置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃下恢復(fù)培養(yǎng)24h。將恢復(fù)培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端切下長1 cm左右的幼根，卡諾氏固定液固定22～24h。固定后的根尖如不及時(shí)制片，可換入70%乙醇中，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。固定好的幼根用蒸餾水浸洗兩次，用5mol/L鹽酸于28℃水解約15min，至幼根被軟化即可。蒸餾水浸洗2次，席夫試劑染色10min，二氧化硫洗滌液浸洗幼根兩次，蒸餾水浸洗1次，將幼根放入新?lián)Q的蒸餾水中，置于4℃冰箱內(nèi)保存，可供隨時(shí)制片之用。將幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截下1mm左右的根尖。在根尖上滴上少許45%的醋酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。然后加蓋一片清潔的蓋玻片，注意不要有氣泡。再在蓋玻片上加一小塊濾紙，輕輕敲打壓片，切勿讓蓋玻片與載玻片之間滑動(dòng)。

1.2.3 鏡檢計(jì)數(shù) 每一處理組觀察3～5個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)。按下式計(jì)算微核千分率(micronucleus frequency，MCN，‰)和綜合污染指數(shù)(pollution index，PI)。

MCN=具有微核的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×1 0 00‰

PI=樣品MCN平均值/陰性對(duì)照組MCN平均值

為避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的MCN本底的波動(dòng)，使用了PI來劃分污染程度。污染指數(shù)的評(píng)價(jià)：0

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Dunnett’s t檢驗(yàn)對(duì)各染毒組與對(duì)照組之間的MCN進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同自來水廠水樣對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率的影響

對(duì)A市4個(gè)自來水廠的6個(gè)采樣點(diǎn)，即1廠出廠水，2廠出廠水，3廠水源水和出廠水，4廠出廠水和末梢水進(jìn)行檢測分析。各水樣及去離子水引起的蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率和PI差異顯著性分析結(jié)果如表1所示。其中，3廠出廠水可誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率顯著增加，與陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)污染指數(shù)判斷屬于中度污染。其余水樣均未引起蠶豆根尖微核千分率增高，均屬于基本無污染。根據(jù)污染指數(shù)來判斷各水樣致突變性強(qiáng)度大小順

序依次為：3廠出廠水>水源水，4廠出廠水>末梢水。

B市某水廠的水源水、出廠水和末梢水，屬于一個(gè)完整的自來水處理系統(tǒng)的3種不同水質(zhì)狀態(tài)進(jìn)行的檢測分析。結(jié)果如表1所示，出廠水可誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率顯著增加，與陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)污染指數(shù)判斷屬于輕度污染。末梢水誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其污染指數(shù)為1.5，屬于輕度污染，但是正處于判定屬于輕度污染的臨界點(diǎn)。根據(jù)污染指數(shù)來判斷各水樣致突變性強(qiáng)度大小順序依次為：出廠水>末梢水>水源水。

C市某水廠的水源水、出廠水和末梢水屬于一個(gè)完整的自來水處理系統(tǒng)的3種不同水質(zhì)狀態(tài)進(jìn)行的檢測分析。結(jié)果如表1所示，水源水、出廠水、末梢水致蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，根據(jù)污染指數(shù)判斷均屬于輕度污染。根據(jù)污染指數(shù)來判斷各水樣致突變性強(qiáng)度大小順序依次為：出廠水>末梢水>水源水。

表1 3市自來水廠水樣的微核千分率(MCN)及污染指數(shù)(PI)

2.2 3 市自來水廠水樣處理蠶豆根尖后微核鏡檢結(jié)果

從圖1可知，以3市自來水廠不同采樣點(diǎn)水樣處理蠶豆根尖后，不僅可以誘導(dǎo)根尖細(xì)胞形成微核(圖1A、B)，同時(shí)還可以觀察到染色體斷片(圖1C)。

圖1 自來水廠水樣誘發(fā)蠶豆根尖微核圖片及染色體異常(×400)

3 討 論

飲用水水質(zhì)安全與人體健康息息相關(guān)。由于自來水中存在大量氯的衍生物，此類有機(jī)物大都呈低劑量、長期暴露的特點(diǎn)，常規(guī)的理化分析不足以對(duì)水質(zhì)狀況作出全面的評(píng)價(jià)。因此，有必要建立一種有效的測試方法評(píng)價(jià)水中有機(jī)物對(duì)生物特別是對(duì)人體的遺傳毒性，以準(zhǔn)確直觀地反映飲用水對(duì)人體健康的潛在危害。植物遺傳毒性實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)低濃度的有機(jī)物非常敏感，可通過微核率、雙核率、有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率等一系列指標(biāo)得以體現(xiàn)，是一種快速、有效的體外短期生物學(xué)檢測方法[9]。

本文以蠶豆根尖微核千分率為指標(biāo)，檢測了A市1、2廠出廠水、3廠的水源水和出廠水、4廠的出廠水和末梢水，以及B、C市的屬于一個(gè)完整的自來水處理系統(tǒng)的水源水、出廠水和末梢水這3種不同水質(zhì)狀態(tài)，結(jié)果表明，根據(jù)污染指數(shù)來判斷各水樣致突變性強(qiáng)度大小順序依次為：出廠水>末梢水>水源水，認(rèn)為出廠水潛在致突變性最強(qiáng)。這與多數(shù)研究的結(jié)果相同，化學(xué)性消毒處理過程可增強(qiáng)水體的致突變性[10-12]。原因主要是化學(xué)性消毒劑可與存在于水源水中的天然有機(jī)物或化學(xué)污染物產(chǎn)生一系列的化學(xué)反應(yīng)形成致突變性的消毒副產(chǎn)物(DBPs)[13-14]。Zeng等[12]利用SOS/Umu試驗(yàn)、HGPRT基因突變試驗(yàn)以及微核試驗(yàn)對(duì)武漢自來水廠水樣的遺傳毒性進(jìn)行了監(jiān)測分析，結(jié)果顯示氯化消毒可以增加飲用水的DNA損傷效應(yīng)。這也與本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行的SOS/Umu實(shí)驗(yàn)以及彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

對(duì)于B市與C市表現(xiàn)出的末梢水出現(xiàn)遺傳毒性，但卻低于出廠水的現(xiàn)象，可能是因?yàn)殡S著自來水在管道中持續(xù)流動(dòng)，氯的某些殘留物因揮發(fā)作用而導(dǎo)致水樣中污染物質(zhì)濃度降低，遺傳毒性減小。但是，自來水在輸送管網(wǎng)中，氯的殘留物可能會(huì)和管道壁中的一些化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，如腐殖酸等有機(jī)物氯化脫碳，形成氯仿等三氯甲烷類潛在致突變物質(zhì)，從而導(dǎo)致新的致突變物質(zhì)的產(chǎn)生。自來水在加壓、輸送、儲(chǔ)存等過程中，由于管網(wǎng)的常年使用，管內(nèi)壁上積累了不同程度的有毒有害物質(zhì)，導(dǎo)致水質(zhì)受到污染，表現(xiàn)為蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率的增高[3]。

研究證明，自來水廠廣泛采用的氯化消毒，其處理后的自來水仍舊可以引起較高的微核千分率，即氯化消毒法產(chǎn)生的消毒副產(chǎn)物可能也具有較強(qiáng)的遺傳毒性。故除繼續(xù)保護(hù)水源水免受污染外，還應(yīng)進(jìn)一步改善水處理工藝，降低自來水在消毒、輸送過程中產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，進(jìn)而保證城市居民的飲水安全。

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Use of the Vicia faba root tipmicronucleus test tomonitor the genotoxicity of tap water

WANG Chao，RUANhongjie，DOU Jiexiong，DUAN Lian，ZHANGhongwei*
(Institute of Environmenthealth and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China)

目的： 利用蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)對(duì)北方3個(gè)城市自來水廠水樣進(jìn)行致突變性檢測。方法：分別采集A、B、C 3個(gè)城市自來水廠的水源水、出廠水及末梢水，以采集的水樣直接處理蠶豆根尖，測定各采樣點(diǎn)水樣的蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率以及污染指數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：A市4個(gè)水廠水樣中，3廠出廠水誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率顯著高于陰性對(duì)照組，且呈中度污染，其余水樣所致微核千分率與陰性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，屬于基本無污染。B市出廠水誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率顯著高于陰性對(duì)照組，屬于輕度污染。其余水樣所致微核千分率與陰性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但末梢水屬于輕度污染，水源水為基本無污染。C市3個(gè)水樣所致蠶豆根尖細(xì)胞微核千分率與陰性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均屬于輕度污染，污染程度比較為：出廠水>末梢水>水源水。結(jié)論：根據(jù)A、B、C 3個(gè)城市自來水廠水樣對(duì)蠶豆根尖微核千分率的影響，并據(jù)污染指數(shù)判斷，認(rèn)為出廠水潛在致突變性最強(qiáng)。其中，A市的整體水質(zhì)要優(yōu)于B市和C市。

蠶豆根尖細(xì)胞；微核千分率；自來水廠水樣；水質(zhì)評(píng)價(jià)

OBJECTIVE:Them icronucleus t est with Vicia faba root tip cells was u sed to study the genotoxicity of tap water from three northern cities.METHODS：12 samples：including the source water，chlorinated water and supply tap water，were c ollected from six waterworksin the northern cities of A ，B，C.The samples were used to treat V icia faba root t ip cells directly.Micronuclei frequencies and pollution index (PI) were determined and statistics analyses were performed to evaluate differencesinmicronuclei rates among different samples.RESULTS：Among the 3 waterworksin city A，the chlorinated water In waterwork # 3 Inducedh igherm icronuclei r ates than the n egative c ontrol，and the P I wasm oderate.O ther water s amples f rom city A did not Inducem icronuclei.In city B ，the chlorinated water Inducedh igherm icronuclei r ate than the negative control，and the PI was slight.The other water samples did not inducemicronuclei.However，the PI for the supply tap water was s light.In city C ，them icronuclei r atesinduced byall 3water samples were not different from thatof the negative control.However，the PI for all samples were slightand the orderof the PI levels was：chlorinated water>supply tap water>source water.CONCLUSION：Based on the evaluation usingmicronuclei rates and PI，themutagenic potential of chlorinated water was the s trongest.In a ddition，the water q uality of city A was better than that in cities Band C .

Vicia faba root tip cells；micronucleus frequency；waterworks sample；water quality evaluation

X824

A

1004-616X(2016)06-0481-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.014

2016-09-08；

2016-10-20

國家衛(wèi)生計(jì)生委衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201302004)

作者信息： 王 超，E-mail：greece-wang@163.com。*通信作者，張宏偉，E-mail：Zhw66@sohu.com。