JNK信號通路活化與BCMA表達(dá)對MM細(xì)胞的作用研究

徐 光，班永宏，鞠少卿，朱寶立△

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210028；2.江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心 226001)

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·論 著·

JNK信號通路活化與BCMA表達(dá)對MM細(xì)胞的作用研究

徐 光1，班永宏1，鞠少卿2，朱寶立1△

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210028；2.江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心 226001)

目的 研究多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞中B細(xì)胞活化因子(BAFF)及B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)的表達(dá)及作用，JNK信號通路的表達(dá)及活化情況，探討JNK信號通路活化與BCMA表達(dá)間的相互作用。方法 采用實時熒光定量(QRT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測MM患者及健康對照者單核細(xì)胞(PBMCs)中BAFF及其受體BCMA、TACI、BAFF-R的表達(dá)。采用Western Blot方法檢測MM細(xì)胞中BCMA蛋白的表達(dá)及信號通路蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38的表達(dá)及活化情況；采用WST-1法檢測MM細(xì)胞的增殖與存活。結(jié)果 MM患者PBMCs中BAFF及BCMA的表達(dá)顯著高于健康對照者。人BAFF重組體(rhBAFF)促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖，Si-BCMA可抑制rhBAFF對MM細(xì)胞的增殖作用。除了ERK、JNK及p38的表達(dá)外，MM細(xì)胞中還有活化蛋白p-JNK的表達(dá)。Si-BCMA可下調(diào)p-JNK的表達(dá)，JNK信號通路抑制劑可下調(diào)p-JNK及BCMA的表達(dá)。結(jié)論 MM細(xì)胞中，BAFF通過BCMA促進(jìn)MM細(xì)胞增殖。JNK信號通路活化與BCMA表達(dá)相互作用，共同促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖與存活。

多發(fā)性骨髓瘤； B細(xì)胞活化因子； B細(xì)胞成熟抗原； JNK信號通路

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是常見的B細(xì)胞惡性腫瘤，以骨髓中異常漿細(xì)胞的過度增生、骨損傷及免疫缺陷為特征。盡管近年來MM的治療取得了顯著進(jìn)步，但其平均5年存活率及10年存活率僅為32%及3%，仍然不可能完全治愈MM。研究證實，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、干擾素(INF)-α、B細(xì)胞活化因子(BAFF)等促進(jìn)MM細(xì)胞生長及介導(dǎo)細(xì)胞耐藥[1-2]，且BAFF的表達(dá)影響MM細(xì)胞的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥[3]。

BAFF是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一，屬Ⅱ型跨膜蛋白，通過與B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)、BAFF受體(BAFF-R)結(jié)合來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化、增生和分泌[4-5]。異常的BAFF表達(dá)可調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的增殖，表明其受體在促進(jìn)腫瘤生長的過程中發(fā)揮一定作用。有研究報道，BAFF-R是B細(xì)胞發(fā)生及存活的主要受體，TACI在調(diào)節(jié)B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及自身免疫方面起重要負(fù)調(diào)控作用，而MM標(biāo)本中BCMA的持續(xù)表達(dá)表明BCMA可作為調(diào)控惡性漿細(xì)胞促存活途徑的主要受體。將上述分子作為治療腫瘤(包括MM)的潛在靶點(diǎn)，極大地引起了研究者們的興趣?？笲AFF抗體、TACI-Fc及BR3-Fc在自身免疫性疾病和B細(xì)胞惡性腫瘤中的作用仍需進(jìn)一步臨床試驗評估；同時，破壞BCMA免疫球蛋白Fc段或BCMA抗體也被認(rèn)為是一種控制惡性腫瘤的治療策略，但目前仍不可能完全治愈B細(xì)胞惡性腫瘤。有研究表明，BAFF與BCMA或TACI結(jié)合后，可激活不同信號通路，如NF-κB、p38 MAPK及JNK信號通路。盡管信號通路活化和BCMA表達(dá)在細(xì)胞存活與增殖中都有重要作用，但在MM細(xì)胞中兩者是否存在相互作用及其作用機(jī)制仍不清楚。

本試驗擬研究MM細(xì)胞中BCMA表達(dá)及JNK信號通路活化情況，初步探討JNK信號通路與BCMA表達(dá)間的相互關(guān)系，進(jìn)一步明確MM細(xì)胞發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為MM的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的MM患者18例，平均年齡為(60.0±10.0)歲。所有患者均符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊咧饕卣鳛楣峭?、疲乏、漿細(xì)胞浸潤、感染和腎功能受損，均排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病等疾病。健康對照者23例。收集外周血3 mL，采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞(PBMCs)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 采用人重組BAFF(rhBAFF，美國R&D公司)，JNK信號通路特異性抑制劑SP600125(美國Sigma公司)，BAFF抗體、BCMA抗體 (美國R﹠D公司)，兔抗ERK抗體、兔抗磷酸化ERK抗體、兔抗p38抗體、兔抗磷酸化p38 抗體、兔抗JNK 抗體、兔抗磷酸化JNK抗體(美國Cell Signal公司)，β-Actin抗體(美國SANTA CRUZ公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，山羊抗兔IgG(H+L)，山羊抗鼠IgG(H+L)，BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)，WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI1640完全培養(yǎng)基[RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素、鏈霉素及谷氨酰胺]，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)人MM細(xì)胞株U266。2周后培養(yǎng)基中需補(bǔ)充1% 200 mmol/L谷氨酰胺。

1.4 熒光定量(QRT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度儀測定總RNA水平。分別取等量RNA以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。BAFF引物序列：上游引物5′-TGT CAC CGC GGG ACT GAA AAT CT-3′，下游引物5′-TGT CTG CAA TCA GTT GCA AGC AGT-3′；BAFF-R上游引物5′-CTT TCT GGG ACC AGG CTA ACC-3′，下游引物5′-TTC AAG GGC TGT CAA AGA TGG T-3′；BCMA上游引物5′-GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG-3′，下游引物5′-TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC-3′；TACI上游引物5′-GCT GAA GCT GAG TGC AGA TCA-3′，下游引物5′-CCC TCT TCT TGA GGA AGC AGG-3′。同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH上游引物5′-TGC TGT TCT GAC TGG AGT TG-3′，下游引物5′-GCT GTC TTG CTG CCT CAC-3′。反應(yīng)終體積20 μL中，10 μL SYBR Green Ⅰ mix (Rox)，3 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL 。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 31 s，重復(fù)40個循環(huán)。

1.5 WST-1細(xì)胞增殖檢測 收集對數(shù)生長期U266細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，加入96孔板，每孔加入約3 000個細(xì)胞，再加入一定體積干預(yù)物質(zhì)，每孔補(bǔ)加培養(yǎng)基至100 μL。每孔加入10 μL WST溶液，培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀以450 nm(650 nm參考)波長測量各孔的吸光度值。每組設(shè)定3個復(fù)孔。重復(fù)試驗3次，取其均值。

1.6 Western Blot 分別提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白水平，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白水平。取50 μg 總蛋白進(jìn)行150 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并在恒流300 mA下120 min將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。50 g/L的脫脂奶粉/TBST液封閉。一抗JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、BAFF、BCMA及β-actin抗體4 ℃孵育過夜。加二抗(山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG)，室溫孵育2 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL) 進(jìn)行顯影。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×106/mL細(xì)胞密度接種于六孔板內(nèi)，每孔接種2 mL。培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為70%～80%。BCMA-SiRNA或非特異性SiRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min。將轉(zhuǎn)染混合物以40 nmol/L水平加入到細(xì)胞懸液內(nèi)，前后搖晃孔板，輕輕混勻。細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育8 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他檢測步驟。

2 結(jié) 果

2.1 BAFF及其受體在MM細(xì)胞株及MM患者細(xì)胞中的表達(dá) 收取MM患者及健康對照者PBMCs提取總RNA及總蛋白，QRT-PCR試驗結(jié)果，見表1。18例MM患者PBMCs中BAFF、BCMA的表達(dá)(1.51±0.24、1.21±0.15)顯著高于23例健康對照者(0.74±0.20、0.70±0.08)，Western Blot檢測總蛋白結(jié)果顯示MM患者PBMCs及MM細(xì)胞株U266細(xì)胞中BCMA的表達(dá)顯著高于健康對照者，見圖1。結(jié)果表明MM細(xì)胞中BAFF和BCMA均高表達(dá)，因此，筆者后續(xù)試驗著重于兩者異常表達(dá)對MM細(xì)胞的作用及其相互作用。

表1 PBMCs中BAFF及其受體的表達(dá)

注：與健康對照者比較，#P<0.05。

注：采用Western Blot，P為MM患者，N為健康對照者。

2.2 BAFF通過BCMA促進(jìn)MM細(xì)胞生長 為進(jìn)一步明確BAFF及BCMA對MM細(xì)胞生長的作用，筆者分別用rhBAFF和BCMA-SiRNA干預(yù)后行WST-1細(xì)胞增殖試驗，結(jié)果顯示：隨著rhBAFF水平的增加(50、 100、200、400 ng/mL)，U266細(xì)胞的增殖顯著增加，見圖2A。不同BCMA-SiRNA轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞篩選出最有效的SiRNA(即Si-392)用于后續(xù)試驗，見圖2B。rhBAFF和Si-392共同干預(yù)U266細(xì)胞，WST-1細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示，Si-392可抑制rhBAFF的促增殖作用，見圖2C。rhBAFF和Si-392干預(yù)后提取總蛋白，Western Blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：rhBAFF能上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，而Si-392能抑制rhBAFF上述作用，見圖2D。結(jié)果表明，BAFF通過BCMA促進(jìn)MM細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡。

2.3 MM細(xì)胞中BAFF及BCMA參與的信號通路 有研究報道，MM細(xì)胞中NF-κB通路的活化介導(dǎo)了BAFF促存活、增殖、分化和轉(zhuǎn)移。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，rhBAFF可誘導(dǎo)NF-κB活化增加[6]。為研究MM細(xì)胞中rhBAFF對MAPK信號通路蛋白表達(dá)與活化情況的影響，rhBAFF干預(yù)后收集U266細(xì)胞提取總蛋白。Western Blot結(jié)果顯示，隨著rhBAFF水平增加，ERK、JNK、p38及活化蛋白p-JNK的表達(dá)上調(diào)，未見p-p38及p-ERK的表達(dá)，見圖3A。上述結(jié)果表明，MM細(xì)胞中有JNK信號通路的活化，且rhBAFF可誘導(dǎo)JNK信號通路的活化。rhBAFF和/或Si-392干預(yù)U266細(xì)胞后行Western Blot，結(jié)果顯示rhBAFF可上調(diào)p-JNK的表達(dá)，Si-392可下調(diào)p-JNK的表達(dá)，且Si-392可部分抑制rhBAFF對p-JNK的上調(diào)作用，如圖3B。上述結(jié)果表明，BAFF及BCMA均可誘導(dǎo)JNK信號通路的活化，且BAFF誘導(dǎo)JNK活化的作用具有BCMA依賴性。

注：A為WST-1細(xì)胞增殖試驗檢測不同水平rhBAFF對U266細(xì)胞增殖的影響；B為QRT-PCR篩選最有效的BCMA沉默基因；C為WST-1細(xì)胞增殖試驗檢測rhBAFF及si-392對U266細(xì)胞增殖的影響；D為Western Blot檢測rhBAFF及si-392對U266中凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的影響；*P<0.05。

圖3 BAFF通過BCMA誘導(dǎo)JNK信號通路的活化

注：A為Western Blot檢測不同水平SP600125對p-JNK蛋白表達(dá)的影響；B為QRT-PCR檢測SP600125對BCMA基因表達(dá)的影響；C為Western Blot檢測檢測SP600125對BCMA蛋白表達(dá)的影響；*P<0.05。

2.4 JNK信號通路調(diào)節(jié)BCMA的表達(dá) 不同水平的JNK信號通路抑制劑SP60015(10、20、40、80 μM)作用于U266細(xì)胞，48 h后提取總RNA和總蛋白。Western Blot結(jié)果顯示，隨著抑制劑SP60015水平的增加，p-JNK的表達(dá)逐漸下降，JNK通路活化顯著受抑制，見圖4A。QRT-PCR及Western Blot檢測BCMA表達(dá)，結(jié)果均顯示，隨著抑制劑SP60015水平的增加，BCMA的表達(dá)逐漸減低，見圖4B、4C。結(jié)果表明，JNK通路活化可調(diào)節(jié)BCMA表達(dá)，JNK通路活化與BCMA表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討 論

MM是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種惡性腫瘤，由于骨髓中有大量異常漿細(xì)胞增殖，引起溶骨性破壞，臨床主要表現(xiàn)為貧血、骨痛等[7]。盡管初始化療藥物對大多數(shù)MM患者有一定療效，但最后幾乎所有患者由于藥物耐受而復(fù)發(fā)。預(yù)計從2010年到2030年，MM復(fù)發(fā)患者將增長57%，故尋找有效治療措施成為未來醫(yī)學(xué)界的主要奮斗目標(biāo)[8]。有文獻(xiàn)報道，BAFF可調(diào)控惡性B細(xì)胞的增殖，BAFF及其受體參與了MM的存活、分化與增殖，在MM的病理生理中發(fā)揮重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性BCMA在骨髓瘤患者中高表達(dá)，其表達(dá)高低與患者疾病進(jìn)展及預(yù)后具有相關(guān)性。除此之外，有報道稱BCMA可誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的存活與增殖[9]。上述所有結(jié)果表明，BAFF-BCMA軸在B細(xì)胞腫瘤的細(xì)胞生理中至關(guān)重要。

盡管臨床前試驗及早期臨床試驗表明，某些單克隆抗體可作為治療MM的潛在靶點(diǎn)[10-11]，但是否有明確臨床效果仍未見報道。故尋求對MM有效的新免疫學(xué)療法依然重要。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)MM患者PBMCs和U266細(xì)胞系中BAFF及BCMA高表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，rhBAFF可上調(diào)U266細(xì)胞的增殖和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而Si-392沉默BCMA表達(dá)后，可抵消rhBAFF的上調(diào)作用，結(jié)果表明BAFF通過BCMA促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖。

BAFF可活化經(jīng)典及非經(jīng)典NF-κB通路、JNK信號通路等，上述通路的活化可促進(jìn)MM細(xì)胞的存活與增殖[9,12]。BAFF與BCMA、TACI或BAFF-R的結(jié)合可活化經(jīng)典及非經(jīng)典NF-κB通路，進(jìn)而上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)。本研究中，筆者采用U266細(xì)胞篩選通路活化蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示p-JNK表達(dá)即MM細(xì)胞中有JNK信號通路活化。隨后，筆者經(jīng)Western Blot驗證了JNK信號通路活化對MM細(xì)胞增殖的作用及對BCMA表達(dá)的影響，即JNK信號通路活化可促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，抑制JNK信號通路活化可下調(diào)BCMA的表達(dá)。筆者以rhBAFF及BCMA的Si-392干預(yù)U266細(xì)胞后，采用Western Blot檢測p-JNK的表達(dá)，結(jié)果顯示rhBAFF上調(diào)p-JNK的表達(dá)，Si-392可抑制rhBAFF對p-JNK的上調(diào)作用。上述結(jié)果表明BCMA參與了JNK信號通路的活化，BAFF通過BCMA活化JNK信號通路。由于JNK信號通路活化和BCMA表達(dá)都可促進(jìn)MM細(xì)胞的存活與增殖，且彼此相互影響，所以筆者有理由認(rèn)為，JNK信號通路活化和BCMA表達(dá)間可形成正反饋回路，共同促進(jìn)MM細(xì)胞的存活與增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，在MM中有JNK信號通路活化和BCMA表達(dá)，且JNK信號通路活化可上調(diào)BCMA表達(dá)，沉默BCMA表達(dá)可抑制JNK信號通路活化。JNK信號通路活化和BCMA表達(dá)相互影響，共同促進(jìn)MM細(xì)胞的存活與增殖。本研究初步探討了JNK信號通路、BCMA及MM3者間的關(guān)系，揭示了MM細(xì)胞中JNK信號通路活化和BCMA表達(dá)間存在正反饋回路，為MM的治療提供了1個新的免疫靶點(diǎn)。

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Interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression collectively promotes the survival of multiple myeloma cells

XUGuang1,BANYonghong1,JUShaoqing2,ZHUBaoli1△

(1.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing,Jiangsu210028,China; 2.MedicalLaboratoryCenter,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To investigate the expression and role of B-cell activating factor(BAFF) and B-cell maturation antigen(BCMA) in multiple myeloma(MM) cells,expression and activation of JNK signal pathway and to explore the interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression.Methods The expression of BAFF and its receptor BCMA,TACI and BAFF-R in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of MM patients and healthy controls were detected by the quantitative real-time fluorescence PCR(QRT-PCR).Western blot was adopted to detect the expression of BCMA protein and the expression and activation of signal pathway protein ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38 and p-p38.MM cell proliferation and survival were measured by WST-1 assay.Results The expression of BAFF and BCMA in PBMCs of MM patients was significantly higher than that of healthy controls.Recombinant human BAFF(rhBAFF) promoted the proliferation of MM cells,while Si-BCMA could restrain the proliferative effect of rhBAFF on MM cells.In addition to the expression of ERK,JNK,p38,p-JNK was also expressed in MM cell lines.Si-BCMA could down-regulate the expression of p-JNK,while the JNK pathway inhibitor could down-regulate the expression of p-JNK and BCMA.Conclusion BAFF promotes the proliferation of MM cells via BCMA.The interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression commonly promotes the proliferation and survival of MM cells.

multiple myeloma; B cell-activating factor; B-cell maturation antigen; JNK signal pathway

徐光，女，技師，主要從事免疫方面的研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.009

A

1673-4130(2016)22-3117-04

2016-03-21

2016-06-18)