特異性損傷內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元小鼠模型的建立*

張志堅(jiān) 管紅霞# 楊琨 肖伯奎 廖華 江洋 周濤 華清泉

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·實(shí)驗(yàn)研究·

特異性損傷內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元小鼠模型的建立*

張志堅(jiān)1管紅霞1#楊琨1肖伯奎1廖華1江洋1周濤1華清泉1

目的 建立小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷的耳聾模型，為研究干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定基礎(chǔ)。方法 成年雌性SPF級(jí)CBA/J小鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水組，每組30只，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物經(jīng)圓窗滲透給予10 μl哇巴因(ouabain)，生理鹽水組同法給予等量生理鹽水。每組于給藥前及給藥后7、14及30天分別檢測(cè)小鼠聽性腦干反應(yīng)(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)，并用免疫組織熒光技術(shù)和基底膜鋪片技術(shù)分別觀察耳蝸螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGNs)細(xì)胞及內(nèi)耳毛細(xì)胞(hair cells，HCs)的變化。結(jié)果 ①與生理鹽水組比較，實(shí)驗(yàn)組給藥后各時(shí)間點(diǎn)ABR反應(yīng)閾均明顯升高，波Ⅰ潛伏期延長(zhǎng)，振幅明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②實(shí)驗(yàn)組及生理鹽水組小鼠DPOAE均可正常引出。③與生理鹽水組相比，實(shí)驗(yàn)組耳蝸各回螺旋神經(jīng)元的數(shù)量及密度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。④實(shí)驗(yàn)組在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，耳蝸各回內(nèi)、外毛細(xì)胞均排列整齊、形態(tài)完整、未見明顯損傷或丟失。結(jié)論 哇巴因經(jīng)圓窗滲透給藥可特異性損傷CBA/J小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元及其功能，而不損傷內(nèi)、外毛細(xì)胞，是一種理想的研究干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾的動(dòng)物模型。

哇巴因； 螺旋神經(jīng)元； 感音神經(jīng)性聾； 動(dòng)物模型； 干細(xì)胞治療； 小鼠

內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元受損導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss, SNHL)是人類最常見的多發(fā)病之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的交流障礙，嚴(yán)重影響患者工作、學(xué)習(xí)及生活質(zhì)量；因此，建立合適的感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型，對(duì)研究耳聾及其治療具有十分重要的意義[1]。傳統(tǒng)動(dòng)物造模多選用氨基糖苷、順鉑、慶大霉素類等藥物經(jīng)肌肉或腹腔注射誘導(dǎo)其內(nèi)耳感覺細(xì)胞的損傷，但這種造模方式不僅損傷耳蝸結(jié)構(gòu)，且因其有全身毒性還可能損傷其他組織或器官。哇巴因(ouabain)是一種Na+-K+-ATP酶抑制劑，可抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣、毛細(xì)胞和血管紋的Na+-K+-ATP酶，有效阻斷其離子轉(zhuǎn)運(yùn)而降低內(nèi)淋巴電位，從而損傷內(nèi)耳，造成感音神經(jīng)性聾[2～5]。

本研究擬通過(guò)使用ouabain經(jīng)小鼠內(nèi)耳圓窗滲透給藥，并在給藥后動(dòng)態(tài)觀察ouabain對(duì)小鼠聽功能、內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元的影響，建立小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷的耳聾模型，探討該方法用于內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷動(dòng)物模型造模的可行性，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇北京華阜康公司提供的成年雌性SPF級(jí)的CBA/J小鼠(8～10周齡，體重22～25克)60 只，其外耳形態(tài)及耳廓發(fā)射正常，所有小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)于武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組30只小鼠；各組按給藥后時(shí)間再分為7、14和30天組，每組10只小鼠。

1.2 內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)損傷小鼠造模 兩組小鼠完成術(shù)前聽性腦干反應(yīng)(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)測(cè)試后，所有動(dòng)物均以右耳為手術(shù)耳。實(shí)驗(yàn)組小鼠麻醉后，使用動(dòng)物剃毛刀剃除小鼠術(shù)耳后的毛發(fā)，將小鼠頭部固定，75%酒精消毒術(shù)野皮膚，切開小鼠耳后皮膚，在解剖顯微鏡的直視下鈍性分離皮下脂肪及肌肉，充分暴露聽泡；用鼓膜切開刀于聽泡下方挑開聽泡，暴露耳蝸底回、圓窗龕及鐙骨動(dòng)脈等解剖標(biāo)志；用微量注射器將10 μl ouabain溶液分次注入圓窗龕，切勿刺破圓窗膜；在60分鐘內(nèi)完成給藥，給藥過(guò)程避光操作。對(duì)照組以生理鹽水代替ouabain溶液，余步驟相同。給藥完成后用棉球蘸干術(shù)腔的液體，以薄層骨蠟封閉聽泡，仔細(xì)檢查術(shù)腔有無(wú)出血，關(guān)閉術(shù)腔，縫合皮膚；待其清醒后放回飼養(yǎng)籠中。注意術(shù)中、術(shù)后保溫及術(shù)后營(yíng)養(yǎng)支持。

1.3 ABR及DPOAE測(cè)試 兩組動(dòng)物分別于給藥前及給藥后7、14、30天檢測(cè)ABR、DPOAE。以1% 戊巴比妥鈉按(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，使用Tucker Davis Technologies equipment III (TDT, USA) 行聽性腦干反應(yīng)(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測(cè)。在隔聲屏蔽室內(nèi)，將麻醉好的實(shí)驗(yàn)小鼠置于37 ℃的熱水袋上。ABR檢測(cè)：記錄電極置于兩外耳道連線中點(diǎn)處的頭皮下，參考電極置于檢測(cè)耳乳突皮下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳乳突皮下，聲源置于檢測(cè)耳外耳道口水平的1.0 cm處，click短聲刺激，持續(xù)時(shí)間100 ms，刺激頻率為21.1次/秒，疊加次數(shù)為1 024次；低通濾波為50 Hz，高通濾波為3 000 Hz，刺激強(qiáng)度從80 dB SPL至10 dB SPL，依次遞減10 dB， ABR閾值以波Ⅰ作為觀察指標(biāo)，隨著刺激聲強(qiáng)度的遞減，當(dāng)波Ⅰ消失時(shí)，將刺激聲強(qiáng)度遞增5 dB SPL，重復(fù)2次，以確定閾值；同時(shí)，分別記錄不同強(qiáng)度下ABR波Ⅰ的振幅和潛伏期。DPOAE檢測(cè)：將連接有刺激聲的耳塞塞入檢測(cè)耳內(nèi)，給與刺激強(qiáng)度分別為65和55 dB SPL的純音f1、f2，設(shè)置f0依次為1、2、3、4、8、12、16、20、24以及32 kHz，f1=0.911×f0，f2=1.099×f0，f2與f1的頻率比值為1.2，并記錄各頻率DPOAE的幅值。

1.4 分離耳蝸并制作切片 兩組動(dòng)物完成各時(shí)間點(diǎn)ABR及DPOAE檢測(cè)后分別斷頭處死，小心分離并取出聽泡，分離耳蝸，挑破蝸尖骨質(zhì)、前庭窗和圓窗膜，各組部分耳蝸以0.5%的硝酸銀從蝸?lái)敼嗔?，再?%多聚甲醛灌流，并置于固定液中室內(nèi)光照下放置2小時(shí)，以備基底膜鋪片使用；其余耳蝸4%多聚甲醛經(jīng)蝸?lái)敼嗔骱笾糜诠潭ㄒ褐? ℃冰箱過(guò)夜，以備切片使用。第二天將4 ℃固定的耳蝸用PBS沖洗2遍，再將其放入盛有10% EDTA脫鈣液的標(biāo)本瓶中，4 ℃脫鈣3天，于10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水，放入OCT中浸泡后用冰凍切片機(jī)沿蝸軸切片，切片厚度為10 μm。

1.5 免疫熒光染色 每只耳蝸間隔取出多張切片；用預(yù)先配置的0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；將切片置于0.2% TritonX-100溶液浸泡10分鐘；用0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；加5%正常山羊血清，室溫封閉30分鐘；移液器吸去封閉液，直接加上預(yù)先檢測(cè)好工作濃度的一抗(兔多抗，beta-III tubulin, 1:500，ab18207，Abcam)稀釋液，并置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；濾紙吸去標(biāo)本周圍水珠，加相應(yīng)的熒光二抗(1:500)，室溫暗盒孵育1小時(shí)；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；DAPI溶液染核，室溫暗盒孵育10分鐘；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；加抗熒光淬滅封片劑封片；暗室內(nèi)使用正置熒光顯微鏡觀察拍照。運(yùn)用ImageJ圖片處理軟件計(jì)數(shù)Rosenthal’s canal內(nèi)耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞(spiral ganglion neurons,SGNs)細(xì)胞的數(shù)量和面積。以神經(jīng)特異性抗體β Ⅲ tubulin陽(yáng)性染色的細(xì)胞計(jì)為SGNs細(xì)胞，引入校正因子Abercromie[6]以減小計(jì)數(shù)偏差，計(jì)算公式為A=T/(T+D)，T是切片厚度，D是細(xì)胞直徑。本實(shí)驗(yàn)底、中、頂回校正因子分別為0.667、0.669、0.673。螺旋神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)=計(jì)數(shù)數(shù)量×A。

1.6 耳蝸基底膜鋪片 將固定好的耳蝸置于PBS(0.01 mM)的培養(yǎng)皿中，顯微鏡直視下運(yùn)用顯微鑷小心剔除骨性外殼、螺旋韌帶、血管紋及蓋膜，小心將基底膜從骨螺旋板上分離，用虹膜刀將基底膜分為三段，并將其正面朝上平鋪于中間涂有甘油的載玻片上，封片；光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)并拍照保存。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Graphpad prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)ABR、DPOAE各檢測(cè)指標(biāo)和SGNs細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR及DPOAE檢測(cè)結(jié)果 各組動(dòng)物給藥前后ABR檢測(cè)結(jié)果見表1，可見給藥前實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間ABR反應(yīng)閾、波Ⅰ潛伏期及振幅的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);給藥后7、14、30天，對(duì)照組ABR反應(yīng)閾、波Ⅰ潛伏期振幅與給藥前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組給藥后與自身給藥前比較及與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，其ABR反應(yīng)閾均明顯升高，潛伏期均明顯延長(zhǎng)，振幅均明顯降低，甚至在80 dB SPL時(shí)未引出波形，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

DPOAE結(jié)果顯示(表2)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間術(shù)前及給藥后兩組間同時(shí)間點(diǎn)比較，DPOAE幅值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

表1 兩組給藥前后ABR反應(yīng)閾(dB SPL)、波I振幅(μV)、潛伏期(ms)比較

注：*與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較,P<0.05；▲與同組給藥前對(duì)應(yīng)指標(biāo)比較,P<0.05；#與同組給藥后30 d組比較，P<0.05

表2 各頻率對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間DPOAE幅值(μV)比較

注：*對(duì)照組給藥后30 d測(cè)試結(jié)果

2.2 免疫熒光染色SGNs計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)照組在術(shù)后7、14和30天其β-Ⅲ tubulin 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯改變，其骨螺旋板內(nèi)神經(jīng)纖維密度也未見明顯降低。而與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組耳蝸各回Rosenthal’s canal內(nèi)β-Ⅲ tubulin 染色陽(yáng)性細(xì)胞在給藥后7天后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，術(shù)后30天，Rosenthal’s canal內(nèi)僅見少數(shù)β Ⅲ tubulin陽(yáng)性細(xì)胞存在，可見實(shí)驗(yàn)組SGNs數(shù)在給藥后明顯減少，且與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較其SGNs數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在給藥后14天及30天實(shí)驗(yàn)組底回仍有SGNs細(xì)胞死亡發(fā)生，給藥后30天底回SGNs數(shù)降至最低(表3，圖1)。

表3 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組耳蝸各回螺旋神經(jīng)元細(xì)胞的密度(個(gè)/mm2)

注：△對(duì)照組給藥后30 d測(cè)試結(jié)果；*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與同組7、14 d組比較，P<0.05

圖1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給藥后耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞變化

a～c顯示實(shí)驗(yàn)組耳蝸底回螺旋神經(jīng)元(綠色細(xì)胞，紅色箭頭所示)，d為對(duì)照組給藥后30天螺旋神經(jīng)元，可見實(shí)驗(yàn)組螺旋神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)在給藥后明顯減少，給藥后30天神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)降至最低，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較神經(jīng)元數(shù)量顯著減少

2.3 基底膜鋪片內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)觀察 在術(shù)后7、14和30天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組耳蝸底、中及頂回的內(nèi)、外毛細(xì)胞均排列整齊，未見明顯形態(tài)異常或缺失；給藥30天后小鼠基底膜鋪片可見內(nèi)外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖2)。

圖2 給藥后30天小鼠耳蝸底回基底膜鋪片

給藥30天后，耳蝸底回內(nèi)毛細(xì)胞(黃色箭頭指示)及外毛細(xì)胞(白色箭頭指示)結(jié)構(gòu)完整，未見缺失

3 討論

耳蝸螺旋神經(jīng)元存在于耳蝸蝸軸螺旋管( Rosenthal’s canal)內(nèi)，分2型，Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是雙極神經(jīng)元，占神經(jīng)元細(xì)胞的絕大部分，約95%，胞體大，軸突有髓鞘，每10～20個(gè)Ⅰ型神經(jīng)元的傳入纖維與一個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞建立聯(lián)系；Ⅱ型螺旋神經(jīng)元為單極神經(jīng)元，數(shù)量少，約占神經(jīng)元細(xì)胞的5%，胞體較小，軸突無(wú)髓鞘，每根Ⅱ型傳入神經(jīng)纖維與數(shù)十個(gè)外毛細(xì)胞聯(lián)系。耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞是聽覺系統(tǒng)非常重要的結(jié)構(gòu)之一，任何原因造成其損傷均可導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。目前感音神經(jīng)性聾的治療方法有助聽器、人工耳蝸植入等人工聽覺技術(shù)，但是其功能的有效發(fā)揮仍有賴于殘余一定數(shù)量的螺旋神經(jīng)元[7]。近年來(lái)，以修復(fù)耳蝸螺旋神經(jīng)元為手段來(lái)治療感音神經(jīng)性聾的干細(xì)胞替代治療越來(lái)越受到關(guān)注[8]，因此，建立精準(zhǔn)的相關(guān)動(dòng)物模型，對(duì)研究干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾有重要作用。

哇巴因(ouabain)可以選擇性抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣、毛細(xì)胞和血管紋的Na+-K+-ATP酶，已被用于感音神經(jīng)性聾的動(dòng)物造模[2～5]。Schmedit等[4]研究發(fā)現(xiàn)ouabain經(jīng)圓窗用藥可導(dǎo)致沙鼠出現(xiàn)類似聽神經(jīng)病的聽力學(xué)改變;Lang[9]采用1 mM ouabain經(jīng)沙鼠圓窗滲透給藥，發(fā)現(xiàn)給藥后24 h時(shí)可以觀察到大部分SGNs細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變，認(rèn)為ouabain可特異性導(dǎo)致沙鼠Ⅰ型SGNs損傷，而不損傷毛細(xì)胞；Lang等[5]在小鼠內(nèi)耳用1 mM ouabain經(jīng)圓窗給藥也得出類似結(jié)論。有研究表明0.01、0.02及0.05 mM ouabain 經(jīng)圓窗給藥可損傷大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元[10]，10 mM 高濃度ouabain不僅損傷大鼠螺旋神經(jīng)元而且損傷毛細(xì)胞[11]；張雪茹等[12]選擇了與人類更加類似的貴州小型豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較0.1 mM和1 mM兩個(gè)濃度ouabain對(duì)貴州豬內(nèi)耳的影響，發(fā)現(xiàn)隨著ouabain濃度的升高，貴州小型豬SGNs的損傷加重。上述研究結(jié)果顯示ouabain對(duì)內(nèi)耳組織的損傷程度及部位與動(dòng)物種屬、藥物濃度等密切相關(guān)。由于小鼠是目前耳聾研究中最常用的哺乳動(dòng)物，故本研究選用小鼠作為研究對(duì)象；既往研究用于小鼠的ouabain濃度為1 mM，為減少ouabain對(duì)小鼠螺旋神經(jīng)元以外內(nèi)耳組織的可能影響，本研究使用0.5 mM ouabain經(jīng)圓窗給藥方式，結(jié)果表明0.5 mM ouabain同樣可特異性損傷小鼠耳蝸各回螺旋神經(jīng)元細(xì)胞，而不損傷內(nèi)外毛細(xì)胞，表現(xiàn)為給藥后實(shí)驗(yàn)組小鼠ABR波Ⅰ潛伏期均明顯延長(zhǎng)、閾值明顯升高、振幅明顯減低，而DPOAE幅值無(wú)改變，且實(shí)驗(yàn)組在給藥后7天耳蝸各回螺旋神經(jīng)元即大量缺失，顯著被損傷，而基底膜鋪片顯示內(nèi)外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。另外，本研究中，在給藥14、30天后除實(shí)驗(yàn)組底回仍有少數(shù)螺旋神經(jīng)元死亡發(fā)生，給藥后30天底回SGNs數(shù)降至最低，表明0.5 mM ouabain對(duì)螺旋神經(jīng)元的損傷是急性重度并不可逆的。

本研究成功建立了特異性損傷內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元的小鼠動(dòng)物模型，是一種理想的研究干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性聾的動(dòng)物模型。

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(2016-08-30收稿)

(本文編輯 雷培香)

An Animal Model of Specific Damage to Spiral Ganglion Neurons in the Inner Ear

Zhang Zhijian, Guan Hongxia, Yang Kun, Xiao Bokui, Liao Hua, Jiang Yang, Zhou Tao, Hua Qingquan

(Department of Otolaryngology & Head and Neck Srugery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, 430060, China)

Objective To establish an animal model of specific loss of spiral ganglion neurons in the mouse inner ear, and to lay the foundation for the study of stem cell transplantation in the treatment of sensorineural hearing loss.Methods Sixty adult female SPF grade CBA / J mice were randomly divided into experimental group and normal saline group, with 30 mice in each. The animals in the experimental group received 0.5 mM ouabain via the round window membrane, while the normal saline group used normal saline. Auditory brainstem responses (ABR) and distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) were recorded before the administration, 7 days, 14 days and 30 days after the administration respectively. Meanwhile, immunofluorescence histochemical staining was used to detect spiral ganglion neurons(SGNs)damages, and basilar membrane preparation was used to observe the changes of hair cells.Results ABR: compared with those of in the normal saline group, in the experimental group , the thresholds were elevated , the Wave I latency was prolonged, and the amplitude reduced. The differences were statistically significant (P<0.05). DPOAE: DPOAE was normally recorded in the experimental group and the control group，without significant differences between the 2 groups. The immunofluorescence results show that compared with the normal saline group, the number and density of SGNs in the cochlea of the experimental group were significantly decreased, and the differences between the 2 groups were statistically significant (P<0.05). The basilar membrane preparation showed that at different time points after the administration of ouabain , the inner and outer hair cells in the experiment group cochlear were intact , no damage or loss were observed.Conclusion The application of ouabain to the mouse inner ear via the round window membrane can specifically induce the damages of SGNs, but spare the inner and outer hair cells, thus, it is an ideal animal model for the research of stem cell transplantation treatment of sensorineural hearing loss.

Ouabain; Spiral ganglion neurons; Sensorineural hearing loss; Animal model; Stem cell therapy; Mouse

* 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81271073)、教育部留學(xué)回國(guó)基金(302-153775)資助

張志堅(jiān)，女，湖北人，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槎茖W(xué)、聽力學(xué)、干細(xì)胞定向分化。

華清泉(Email: hqqrm@sina.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.013

時(shí)間：2016-11-2 16:18

R764.3

A

1006-7299(2016)06-0583-05

1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 (武漢 430060)

# 共同第一作者

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.008.html