‘無籽’甌柑小孢子母細胞減數(shù)分裂特性基因RAD51和MS1的表達差異分析

朱咪咪，張 遲,2，常愛玲，黨婉譽，周彩紅，俞狄虎，吳瑩瑩，張 敏

（1.浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300； 2.浙江農(nóng)林大學 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質改良技術研究重點實驗室， 浙江 臨安 311300）

‘無籽’甌柑小孢子母細胞減數(shù)分裂特性基因RAD51和MS1的表達差異分析

朱咪咪1，張 遲1,2，常愛玲1，黨婉譽1，周彩紅1，俞狄虎1，吳瑩瑩1，張 敏1

（1.浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300； 2.浙江農(nóng)林大學 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質改良技術研究重點實驗室， 浙江 臨安 311300）

‘無籽’甌柑Citrus suavissima ‘Seedless’是野生型甌柑Citrus suavissima的芽變，其花粉完全敗育，敗育起始于小孢子母細胞減數(shù)分裂形成四分體時期。研究 ‘無籽’甌柑小孢子母細胞減數(shù)分裂異常的分子機制，有利于深入認識果樹芽變的發(fā)生機制。隨機選擇 “無籽”甌柑和甌柑各3株，根據(jù)花蕾直徑采集花粉母細胞時期（Ⅰ），四分體時期（Ⅱ），單核花粉粒時期（Ⅲ），雙核花粉粒時期（Ⅳ）及花粉粒成熟期（Ⅴ）共5個時期的花蕾并分離花藥，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析減數(shù)分裂特性基因RAD51和MS1的相對表達量，3次重復。通過SPSS 16.0的最小顯著差法（LSD）在0.01水平上進行各樣品間的相對表達量差異分析。結果表明：RAD51和MS1基因的表達高峰均集中在第Ⅰ時期和第Ⅱ時期，且此時花藥中的相對表達量均極顯著（P＜0.01）高于花蕾。第Ⅰ時期花藥中， ‘無籽’甌柑RAD51的相對表達量為甌柑的3.7倍，MS1可達300倍；但同時期花蕾中，RAD51的相對表達量僅1.1倍，MS1為140.0倍。 ‘無籽’甌柑RAD51基因在第Ⅰ時期和第Ⅱ時期的相對表達量極顯著 （P＜0.01）高于甌柑，說明 ‘無籽’甌柑小孢子母細胞和四分體時期的細胞內(nèi)均存在DNA受損現(xiàn)象； ‘無籽’甌柑MS1基因在第Ⅰ時期的相對表達量極顯著（P＜0.01）高于甌柑，但第Ⅱ時期極顯著（P＜0.01）低于甌柑，推測 ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成與MS1基因表達紊亂引起油脂分泌、轉運異常密切相關。圖6表1參24

園藝學； ‘無籽’甌柑；減數(shù)分裂；花蕾；花藥；RAD51；MS1；實時熒光定量聚合酶鏈式反應

減數(shù)分裂是植物生活史中的一個重要環(huán)節(jié)，是有性生殖的前提，是保持物種穩(wěn)定性的基礎［1］。本研究的實驗材料 ‘無籽’甌柑Citrus suavissima ‘Seedless’是1996年發(fā)現(xiàn)的一個甌柑Citrus suavissima的無核突變體，具有果實完全無核的特性［2］。張遲等［3］采用半薄樹脂切片、掃描電鏡、透射電鏡等方法對其花藥發(fā)育過程和花粉形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)在四分體時期出現(xiàn)異常，在單核期出現(xiàn)明顯異常，認為花粉敗育開始于小孢子母細胞減數(shù)分裂期至四分體時期。近年來，模式植物減數(shù)分裂行為中的染色體配對和聯(lián)會方面的研究取得了較大進展。PANOLI等［4］研究了擬南芥Arabidopsis thaliana的直系同源基因Atspo11-1，染色體重組起始于Spoll調(diào)控的DNA雙鏈解開，Atspo11-1突變體中Atspo11-1的缺失會抑制染色體破碎化。LI等［5］利用熒光原位雜交技術觀察了擬南芥突變體rad51c-1的早期減數(shù)分裂行為，發(fā)現(xiàn)該突變體的同源染色體無法正常配對并出現(xiàn)嚴重的破碎化現(xiàn)象。敲除RAD51C基因后得到的不育植株伴隨有大孢子和花粉母細胞粗線期染色體異常［6］。ITO等［7］研究了擬南芥中的MALE STERILITY1（MS1）基因，它對減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育很重要，與花粉壁、花粉細胞質內(nèi)容物和絨氈層發(fā)育有關。在果樹方面，目前的研究多采用分子標記法來發(fā)掘育性相關基因。如王躍進等［8］通過分離、提取和純化經(jīng)隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）標記獲得的特異片段，根據(jù)其序列人工合成一條寡聚核苷酸作引物（5′CCAGT TCGCC CGTAA ATG 3′），在多個葡萄Vitis vinifera品系中進行驗證，凡出現(xiàn)約590 bp的DNA片段者即為葡萄無核基因攜帶者和無核性狀表現(xiàn)者。楊英軍等［9］又進一步根據(jù)此特異片段設計合成了2對引物，開發(fā)出鑒別無核品種的SCAR（特定序列擴增標記）。姚春潮等［10］利用RAPD技術對美味獼猴桃Actinidia deliciosa var.deliciosa海瓦德×秦雄201雜交F1代雌雄分離群體進行分析，通過對300個隨機引物的篩選和研究，得到了與獼猴桃雄性基因鏈鎖的RAPD標記S1032-850。NWAFOR等［11］采集了野生型葡萄和一個無核突變體材料的果實進行轉錄組測序技術（RNA-Seq）分析，對得到的差異表達基因進行表達模式和功能富集分析，發(fā)現(xiàn)花粉和胚囊兩者的發(fā)育途徑具有密切關聯(lián)，但無核性狀具體由哪些基因控制仍不明了。本研究根據(jù) ‘無籽’甌柑及其野生型小孢子母細胞時期花藥轉錄組的測序結果，選擇了RAD51和MS1這2個減數(shù)分裂特性基因，研究它們在 ‘無籽’甌柑和甌柑花粉發(fā)育不同時期的相對表達量差異，來分析 ‘無籽’甌柑小孢子母細胞減數(shù)分裂異常的分子機制。此外，鑒于減數(shù)分裂只在特定時期和特定部位發(fā)生，本研究選取了花蕾和花藥2種材料進行基因相對表達量的測定，進而分析不同材料所得結果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料甌柑和 ‘無籽’甌柑采自麗水市林業(yè)科學研究院百果園。當花蕾剛露白時開始取樣，根據(jù)預備試驗的結果，采集 ‘無籽’甌柑和甌柑花粉母細胞形成期（Ⅰ），四分體時期（Ⅱ），單核花粉粒時期（Ⅲ），雙核花粉粒時期（Ⅳ）和花粉粒成熟期（Ⅴ）共5個時期的花蕾和對應花藥，5個時期的花蕾直徑分別為2.0～2.4 mm，2.8～3.1 mm，3.5～4.5 mm，4.5～6.5 mm和即將開放的花蕾（6.5～7.1 mm，圖1），保存

于-70℃超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 采用改良的Trizol法提取甌柑和 ‘無籽’甌柑各5個時期花蕾的RNA，用Aidlab公司的 ‘EASYspin PLUS植物RNA快速提取試劑盒’提取花藥RNA，10.0 g· kg-1的瓊脂糖凝膠對各樣品的 RNA進行電泳檢測，再經(jīng)NanoDrop-1000測吸光度值，檢測樣品RNA的質量。

1.2.2 熒光定量PCR cDNA的合成參照TaKaRa反轉錄試劑盒PrimeScripRRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）的說明指南。根據(jù)轉錄組測序結果中的基因序列（已提交GenBank）設計熒光定量特異引物（表1），以甜橙Citrus sinensis的Actin基因（GU911361）為內(nèi)參，采用定量儀器CFX96 real-time system實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad）和熒光染料SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進行實時表達量測定。反應程序為95℃,30 s；95℃，5 s；57℃，30 s，39個循環(huán)；65～95℃，隔5 s上升0.5℃做融解曲線。設立重復3個·樣品-1，根據(jù)2-△△Ct法［12］進行基因相對表達量計算，利用SPSS 16.0的最小顯著差（LSD）法在0.01水平上比較2個基因在不同組織和不同時期中的表達量差異。

圖1 花粉發(fā)育5個時期的花蕾Figure1 Flower buds of five pollen developments

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）特異引物Table 1 Specific primers for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 RAD51基因的時空定量表達

2.1.1 花蕾中RAD51基因的表達 以甌柑第Ⅰ時期花蕾的表達量為基準計算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時期花蕾的RAD51的相對表達量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花蕾中RAD51的表達主要集中在第Ⅰ時期； ‘無籽’甌柑中RAD51基因的相對表達量逐漸下降，甌柑先下降，在第Ⅳ時期和第Ⅴ時期略有上升（圖2）。

2.1.2 花藥中RAD51基因的表達 以甌柑第Ⅰ時期花藥的表達量為基準計算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時期花藥的RAD51相對表達量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花藥中RAD51的表達主要集中在第Ⅰ時期和第Ⅱ時期，且此時 ‘無籽’甌柑中的相對表達量均極顯著（P＜0.01）高于甌柑，第Ⅰ時期達3.7倍左右； ‘無籽’甌柑中RAD51基因的相對表達量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時期最高，隨后逐漸下降（圖3）。

2.2 MS1基因的時空定量表達

2.2.1 花蕾中MS1基因的表達 以甌柑第Ⅰ時期花蕾的表達量為基準計算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時期花蕾的MS1相對表達量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花蕾中MS1的表達主要集中在第Ⅰ時期和第Ⅱ時期，且此時期存在極顯著（P＜0.01）差異；第Ⅰ時期 ‘無籽’甌柑是甌柑的140.0倍左右，但第Ⅱ時期甌柑是‘無籽’甌柑的2.5倍； ‘無籽’甌柑中MS1基因的相對表達量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時期相對表達量最高，隨后逐漸下降（圖4）。

2.2.2 花藥中MS1基因的表達 以甌柑第Ⅰ時期花藥的表達量為基準計算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時期花藥的MS1相對表達量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花藥中MS1的表達也主要集中在第Ⅰ時期和第Ⅱ時期，且存在極顯著（P＜0.01）差異；第Ⅰ時期 ‘無籽’甌柑是甌柑的300.0倍左右，但第Ⅱ時期甌柑是 ‘無籽’甌柑的2.0倍； ‘無籽’甌柑中MS1基因的相對表達量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時期相對表達量最高，隨后逐漸下降（圖5），此趨勢與花蕾中相似（圖4）。

圖2 甌柑和 ‘無籽’甌柑花蕾RAD51的相對表達量Figure 2 Expression alteration of RAD51 in flower bud of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

圖3 甌柑和 ‘無籽’甌柑花藥RAD51的相對表達量Figure 3 Expression alteration of RAD51 in anther of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

圖5 甌柑和 ‘無籽’甌柑花藥MS1的相對表達量Figure 5 Expression alteration of MS1 in anther of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

2.3 同種（品種）花蕾和花藥之間基因表達量的比較分析

分別以 ‘無籽’甌柑和甌柑各自花蕾第Ⅰ時期的表達量為基準計算同種（品種）花蕾和花藥間的相對表達量，比較同一基因在不同組織材料中的表達差異。除個別時期無極顯著（P＜0.01）差異外，2個種（品種）的其他時期均是花藥中的相對表達量極顯著（P＜0.01）高于各自時期的花蕾（圖6）。

3 討論

3.1 RAD51的基因功能和表達分析

RAD51的功能是修復SPO11引發(fā)產(chǎn)生的雙鏈DNA分子斷裂（double-strand breaks，DSBs）。RAD51會附著到由蛋白復合體MRX產(chǎn)生的3′單鏈末端上，以促進單鏈 DNA入侵到同源染色體雙鏈中形成重組中間體，在復合體解開的過程中形成染色體的交換（crossover,CO）和非交換（noncrossover,NCO）［13］。AtRAD51基因單突變體雌、雄減數(shù)分裂過程均不正常，單突變體植株不育，減數(shù)分裂細胞中無法正常形成聯(lián)會復合體且存在大量染色體碎片，而Atspo11-1Atrad51雙突變體中不存在染色體碎片，說明 A-trad51中的染色體碎片來自于AtSPO11引發(fā)的DSBs［14］。動物RAD51基因是大腸埃希菌Escherichia coli RecA的同源基因，與植物RAD51也具有一定同源性［15］，在動物生命科學研究中發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在多

種受損組織中表達增高，認為這是DNA被損傷后細胞的一種反應［16－17］。

圖6 同品種花蕾和花藥間的相對表達量Figure 6 Expression alteration of flower buds and anther from the same variety

OSAKABE等［18］對擬南芥進行不同強度的γ射線照射，誘導產(chǎn)生DSBs，對不同器官內(nèi)RAD51基因進行半定量PCR分析，結果顯示：花芽中RAD51表達量最高，且隨照射強度增加而增高，說明細胞內(nèi)產(chǎn)生的DSBs越多，RAD51基因越活躍。本研究中， ‘無籽’甌柑第Ⅰ時期和第Ⅱ時期的花藥中RAD51的相對表達量極顯著（P＜0.01）高于甌柑（圖3），表明 ‘無籽’甌柑小孢子母細胞時期和四分體時期細胞內(nèi)可能存在某種機制引起的DNA受損現(xiàn)象。

3.2 MS1的基因功能和表達分析

MS1基因編碼一個含有植物同源域（plant homeo domain，PHD）指基序的轉錄因子，參與絨氈層的發(fā)育和花粉壁的形成［19］。擬南芥ms1突變體花粉的透射電鏡觀察［20］顯示，前期突變體與野生型均能正常發(fā)育，但從四分體解體開始，突變體中的小孢子和絨氈層細胞的細胞質中出現(xiàn)顆粒狀物質和非正常液泡，小孢子內(nèi)孢粉素分布及外壁柱狀基粒棒的發(fā)育均異常，并在隨后的發(fā)育中被液泡充斥而萎縮退化。而‘無籽’甌柑花藥的絨氈層和花粉壁結構與甌柑無明顯差異，但最終花粉粒形態(tài)出現(xiàn)明顯差異，甌柑花粉粒飽滿， ‘無籽’甌柑的花粉粒大多干癟、畸形且無內(nèi)含物，說明MS1在不同物種中的功能存在一定差異［3］。正常情況下，MS1在小孢子母細胞減數(shù)分裂完成、單個小孢子從四分體分離時在絨氈層細胞中表達量較高［19］。本研究中，甌柑MS1的表達趨勢符合此規(guī)律。擬南芥ms1-1突變體［21］MS1的轉錄本在小孢子母細胞時期（PMC）到減數(shù)分裂期間表達量是野生型的27.0倍，四分體到有絲分裂Ⅰ時期表達量是野生型的600.0倍。本研究中 ‘無籽’甌柑在小孢子母細胞時期（第I時期）的表達異常升高，在花蕾中是甌柑的140.0倍，花藥中更是高達300.0倍，反而在四分體時期（第Ⅱ時期）顯著降低，僅為甌柑的1/2。

YANG等［21］利用花椰菜Brassica oleracea var.botrytis花葉病毒35S啟動子（CaMV35S）使MS1基因過量表達，得到一些花器官及花粉變異的擬南芥類型，并對ms1變異花芽進行基因芯片分析，其中3個有關油脂合成和花粉壁發(fā)育的基因（At5g07550，At5g07410和At5g07560）經(jīng)RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)在MS1過表達的擬南芥類型中均表現(xiàn)為下調(diào)表達，推測ms1變異株中這些油脂蛋白的缺失影響了TAGs從內(nèi)質網(wǎng)上的釋放，導致了油質的積累和不正常分泌。張敏等［22］通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn) ‘無籽’甌柑中脂轉移酶基因（CsLTP）和脂氧合酶基因（CsLOX）的相對表達量在花粉粒形成期顯著下降，LTP是MYB99的下游基

因，而MYB99是受MS1調(diào)控的轉錄因子［7,21］， ‘無籽’甌柑成熟花粉粒時期花藥的絨氈層附近有大量的脂類物質殘存［3］，因此， ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成與MS1基因過表達引起油脂分泌、轉運異常密切相關。

3.3 不同組織材料的比較分析

本研究利用花蕾與花藥2種組織材料對RAD51和MS1基因進行表達量比較，發(fā)現(xiàn)同一基因在同一時期的花蕾和花藥中相對表達量差異極顯著（P＜0.01）（圖6）。任磊等［23］采用相對熒光定量的方法對 7個花器官發(fā)育相關基因在牡丹Paeonia suffruticosa根、莖、葉、花瓣、萼片、雄蕊和心皮中的表達差異進行分析，其中PsPI和PsMADS1主要在花瓣和雄蕊中表達，其他器官幾乎沒有表達，表明不同的基因在不同的器官中有不同的表達模式，具有一定的組織特異性。本研究的重點是 ‘無籽’甌柑減數(shù)分裂異常的分子機制，因此，采用花藥作為研究材料可以更準確地反映減數(shù)分裂特性基因的表達水平。

4 結論與展望

在花粉母細胞形成期（Ⅰ），四分體時期（Ⅱ），單核花粉粒時期（Ⅲ），雙核花粉粒時期（Ⅳ），花粉粒成熟期（Ⅴ）等5個時期的花蕾和花藥中，同種（品種）中各時期RAD51和MS1的表達量均是花藥極顯著（P＜0.01）高于花蕾。第Ⅰ時期花藥中，‘無籽’甌柑RAD51的相對表達量為甌柑的3.7倍，說明 ‘無籽’甌柑的小孢子母細胞時期和四分體時期可能存在某種機制引發(fā)的DNA受損現(xiàn)象，從而引起RAD51的異常高量表達。第Ⅰ時期花藥中MS1的表達量為甌柑的300.0倍，但第Ⅱ時期（四分體時期）銳減為甌柑的1/2；MS1基因的提早過量表達可能引起油脂分泌、轉運的異常，與 ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成密切相關。

CHEN等［24］收集擬南芥性母細胞進行RNA-Seq測序，結果顯示：減數(shù)分裂特性基因MND1，At-SPO11-2，AtSRP2，MSS等的表達量在性細胞中是花藥中的2.0倍，AtSPO11-1，AtDMC1，AtRAD51C，AtXRCC3等在性細胞和花藥中表達量又比種子高，說明基因表達量與組織特性密切相關。在后續(xù)的減數(shù)分裂分子機制研究中，可嘗試利用激光顯微切割技術獲取花藥中的性母細胞進行轉錄組測序，以獲得更精確的基因信息，推進 ‘無籽’甌柑減數(shù)分裂異常的研究進程。

［1］ 鄭湘如，王麗．植物學［M］．2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2007:160－170．

［2］ 徐象華，顏福花，葉榮華，等．甌柑研究進展［J］．浙江林業(yè)科技，2008，28（3）：75－77．

XU Xianghua,YAN Fuhua,YE Ronghua,et al.Advances in research of Citrus reticulata ‘Suavissima’［J］.J Zhejiang For Sci Technol,2008,28（3）:75－77.

［3］ 張遲，張敏，朱銓，等．甌柑及其無籽突變體花粉發(fā)育的細胞學觀察［J］．果樹學報，2014，31（2）：265－269．

ZHANG Chi,ZHANG Min,ZHU Quan,et al.Cytological observation of pollen development in ‘Ougan’（Citrus suavissima Hort.ex Tanaka）and its seedless mutant［J］.J Fruit Sci,2014,31（2）:265－269.

［4］ PANOLI A P,RAVI M,SEBASTIAN J,et al.At mnd1 is required for homologous pairing during meiosis in Arabidopsis［J］.Bmc Mol Blol,2006,7（16）:20－34.

［5］ LI Wuxing,YANG Xiaohui,LIN Zhenguo,et al.The atrad51c gene is required for normal meiotic chromosome synapsis and double-stranded break repair in Arabidopsis［J］.Plant Physiol,2005,138（2）:965－976.

［6］ KOU Yanjun,CHANG Yuxiao,LI Xianghua,et al.The rice RAD51C gene is required for the meiosis of both female and male Gametocytes and the DNA repair of somatic cells［J］.J Exp Bot,2012,63（14）:5323－5335.

［7］ ITO T,NAGATA N,YOSHIBA Y,et al.Arabidopsis male sterility1 encodes a phd-type transcription factor and regulates pollen and tapetum development［J］.Plant Cell,2007,19（11）:3549－3562.

［8］ 王躍進，OLUSOLA L.檢測普通無核基因DNA探針的合成與應用［J］．西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2002，30（3）：42－46.

WANG Yuejin,OLUSOLA L.Synthesis and application of DNA probe in the detection of seedless genes［J］.J Northwest A&F Univ Nat Sci Ed,2002,30（3）:42－46.

［9］ 楊英軍，王躍進，周鵬，等．葡萄無核基因的SCAR標記及Southern blot分析［J］．西北農(nóng)林科技大學學報：自

然科學版，2002，30（6）：77－80．

YANG Yingjun,WANG Yuejin,ZHOU Peng,et al.SCAR marker linked to seedless genes in grapes and Southern blot analysis［J］.J Northwest A&F Univ Nat Sci Ed,2002,30（6）:77－80.

［10］ 姚春潮，王躍進，劉旭峰，等．獼猴桃雄性基因RAPD標記s1032-850的獲得及其應用［J］．農(nóng)業(yè)生物技術學報， 2005，13（5）：557－561．

YAO Chunchao,WANG Yuejin,LIU Xufeng,et al.Obtainment and application of RAPD marker S1032-850 linked to male gene in Actinidia［J］.J Agric Biotechnol,2005,13（5）:557－561.

［11］ NWAFOR C C,GRIBAUDO I,SCHNEIDER A,et al.Transcriptome analysis during berry development provides insights into co-regulated and altered gene expression between a seeded wine grape variety and its seedless somatic variant［J］.Bmc Genom,2014,15（1）:1030－1052.

［12］ LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔctmethod［J］.Methods,2001,25（4）:402－408.

［13］ ANDERSON L K,OFFENBERG H H,VERKUIJLEN W M,et al.Reca-like proteins are components of early meiotic nodules in lily［J］.Proc Nat Acad Sci,1997,94（13）:6868－6873.

［14］ 張峰．擬南芥減數(shù)分裂重組相關基因RAD51，PTD功能分析［D］．上海：上海師范大學，2013．

ZHANG Feng.The Function Analysis of Meiosis Recombination Related Genes:PTD,Mus81 and Four of the RAD51 Gene Family Members RAD51 and PTD in Arabidopsis thaliana［D］.Shanghai：Shanghai Normal University,2013.

［15］ 袁瑛，葉俊，董琦，等．DNA修復基因Rad51表達調(diào)控區(qū)結構分析［J］．中華醫(yī)學遺傳學雜志，2004，21（3）： 248－251．

YUAN Ying,YE Jun,DONG Qi,et al.Structural characterization of 5′-flanking regulatory region of DNA repair gene Rad51［J］.ChinJ Med Genet,2004,21（3）:248－251.

［16］ MAACKE H,JOST K,OPITZ S,et al.DNA repair and recombination factor Rad51 is over-expressed in human pancreatic adenocarcinoma［J］.Oncogene,2000,19（23）:2791－2795.

［17］ MAACKE H,OPITZ S,JOST K,et al.Over-expression of wild-type Rad51 correlates with histological grading of invasive ductal breast cancer［J］.Int J Cancer,2000,88（6）:907－913.

［18］ OSAKABE K,YOSHIOKA T,ICHIKAWA H,et al.Molecular cloning and characterization of Rad51-like genes from Arabidopsis thaliana［J］.Plant Mol Biol,2002,50（1）:71－81.

［19］ WILSON Z A,MORROLL S M,DAWSON J,et al.The arabidopsis MALE STERILITY1 （MS1）gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis,with homology to the PHD-finger family of transcription factors［J］.Plant J, 2001,28（1）:27－39.

［20］ VIZCAYBARRENA G，WILSON Z A.Altered tapetal PCD and pollen wall development in the Arabidopsis ms1 mutant［J］.J Exp Bot,2006,57（11）:2709－2717.

［21］ YANG C,VIZCAY-BARRENA G,CONNER K,et al.MALE STERILITY1 is required for tapetal development and pollen wall biosynthesis［J］.Plant Cell,2007,19（11）:3530－3548.

［22］ 張敏，劉志輝，宋雪恩，等．‘無籽’甌柑CsLTP和CsLOX基因的克隆與表達分析［J］．浙江農(nóng)林大學學報，2014，31（6）：823－830．

ZHANG Min,LIU Zhihui,SONG Xueen,et al.Cloning and expression analysis of CsLTP and CsLOX in seedless Ougan（Citrus suavissima‘Seedless’）［J］.J Zhejiang A&F Univ,2014,31（6）:823－830.

［23］ 任磊．牡丹花器官發(fā)育相關基因的克隆與表達［D］．北京：中國林業(yè)科學研究院，2011．

REN Lei.Cloning and Expression of Floral Organ Development Related Genes in Tree Peony［D］.Beijing:Chinese Academy of Foresty,2011.

［24］ CHEN Changbin,FARMER A D,LANGLEY R J,et al.Meiosis-specific gene discovery in plants:RNA-seq applied to isolated Arabidopsis male meiocytes［J］.Bmc Plant Biol,2010,10（1）:242－247.

Expression of microsporocyte meiosis with special genes RAD51 and MS1 in Citrus suavissima ‘Seedless’

ZHU Mimi1,ZHANG Chi1,2,CHANG Ailing1,DANG Wanyu1,ZHOU Caihong1,YU Dihu1, WU Yingying1,ZHANG Min1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.The Key Laboratory for Quality Improvement of Agriculture Products of Zhejiang Province, Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To obtain the relative expression of two meiosis special genes--RAD51 and MS1 （Male Sterility1）, Citrus suavissima ‘Seedless’,a bud variation of its wild type Ougan （Citrus suavissima）with completely aborted pollens that appear abnormally from the tetrad stage,were studied through the molecular mechanism of abnormal meiosis.According to flower bud diameter,five stages of flower buds and anther--pre-meiotic（PM,Ⅰ）,tetrad（T,Ⅱ）,single-celled（SC,Ⅲ）,dual-core（DC,Ⅳ）,and mature pollen（MP,Ⅴ）--were collected and each was an composite sample from three trees.An experiment in real-time quantitative polymerase chain

horticulture;Citrus suavissima‘Seedless’;meiosis;flower buds;anther;RAD51;MS1;qRT-RCR

S666.1；S759.3

A

2095-0756（2016）06-0921-07

2015-12-19；

2016-01-15

國家自然科學基金資助項目（31000897）；浙江省自然科學基金資助項目（Y3090494）； 浙江省團隊科技特派員服務計劃項目（浙科發(fā)農(nóng)〔2013〕215-122）；浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃項目（2016R412003）

朱咪咪，從事經(jīng)濟林栽培與利用研究。E-mail：mmzjessica@163.com。通信作者：張敏，副教授，博士，從事經(jīng)濟林遺傳育種研究。E-mail：mzhang@zafu.edu.cn

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.001

reaction （qRT-PCR）was conducted by three replications in each sample and the method of least significant difference（LSD）with SPSS 16.0 was used to test the expression differences between samples under the level of P＜0.01.Results showed that expression of RAD51 at Stage I of the anther and the flower buds for C. suavissima‘Seedless’was significantly higher（P＜0.01）than Ougan.At Stage I of the anther,the relative expression of RAD51 in C.suavissima ‘Seedless’was 3.7 times higher than in Ougan with MS1 reaching about 300 times higher.However,at Stage I of the flower buds,RAD51 was only 1.1 times higher and MS1 was about 140 times higher.The significantly higher expression of RAD51 at Stage I indicated that a phenomenon of DNA damage might exist in the microsporocyte and tetrad periods of C.suavissima ‘Seedless’;for gene MS1,significantly higher expression of C.suavissima ‘Seedless’ for Stage I also meant that the aborted pollens of C. suavissima ‘Seedless’had a relationship with the abnormal secretion and transfer of oil lipids that were influenced by disordered expression of MS1.［Ch,6 fig.1 tab.24 ref.］