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    超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速檢驗全血中扎來普隆及其代謝產(chǎn)物

    2016-12-08 00:33:54徐多麒張蕾萍王繼芬黃健郭震林寬
    分析化學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:甲酸乙腈質(zhì)譜

    徐多麒+張蕾萍+王繼芬+黃健+郭震+林寬

    摘要 建立了全血中扎來普隆及其代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜(UPLC-TQ/MS)快速檢驗方法。采用改良后的QuEChERS前處理方法,全血樣品用0.1%甲酸-乙腈提取,經(jīng)無水MgSO4脫水凈化,Waters BEH C18色譜柱分離,0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈進行梯度洗脫。采用電噴霧電離,正離子(ESI+)模式掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。扎來普隆及其代謝產(chǎn)物在0.5~100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.997),回收率為92.0%~100.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%~5.3%,方法檢出限(S/N=3)均為0.05 ng/mL,定量限(S/N=10)在0.1~0.5 ng/mL范圍內(nèi)。

    關(guān)鍵詞 扎來普隆;5-氧扎來普?。幻撘一鷣砥章?;QuEChERS方法;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

    2016-01-13 收稿 ;2016-04-14接受

    本文系公安部重點研究計劃項目(No.201302ZDYJ002)、公安技術(shù)交流培訓(xùn)計劃項目(No.B2014004A)和2015年北京市教委科學(xué)研究與研究生共建項目資助

    E-mail:zlpbjft@sohu.com ,wangjifen58@126.com

    1 引 言

    扎來普隆(Zaleplon)又名曲寧,化學(xué)名稱為3-[3-氰基吡唑(1,5-a)并嘧啶-7]-N-乙基乙酰苯胺,分子式為C17H15N5O。扎來普隆為新一代非苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的代表,與苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥相比,具有高效、低毒、成癮性小等特點,并且半衰期短,不會產(chǎn)生次日的宿醉現(xiàn)象。該藥上市后得到廣泛認(rèn)可,目前已廣泛用于治療失眠癥。但與此同時,有不法分子利用此類藥物實施麻醉搶劫、迷奸、毒駕等犯罪行為,也有將該類藥物與其它毒品混合使用的案件發(fā)生[1,2]。扎來普隆主要在肝臟經(jīng)醛氧化酶作用形成5-氧扎來普隆,少數(shù)經(jīng)CYP3A4作用形成脫乙基扎來普?。▓D1)[3]。單劑量服用扎來普隆,口服吸收快,代謝迅速,活性代謝物濃度低,且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[4,5]。因此,在刑事案件中,對扎來普隆原藥及其代謝物同時定性與定量檢測,有利于還原案件客觀情況。目前檢測生物樣品中扎來普隆原體的方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9~11]。但還未見同時檢測扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物的報道。因此,建立一種快速、簡便、高靈敏度的分析方法具有重要意義。

    2002年,Anastassiades 等[12]首次提出了QuEChERS快速樣品前處理方法,因其具有快速、簡單、廉價、有效、可靠及安全(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)的特點而迅速成為研究熱點[13]。QuEChERS前處理技術(shù)多用于農(nóng)藥殘留檢測[14~16]、臨床醫(yī)學(xué)[17]、獸藥及醫(yī)藥殘留[18]等領(lǐng)域。在法庭科學(xué)中應(yīng)用鮮見報道。

    本實驗采用QuEChERS 前處理方法并進行了改進,超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測,建立了同時檢測全血中扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆QuEChERS- UPLC-TQ/MS方法。在30 s內(nèi)可以完成樣品的測定,滿足了辦案中快速準(zhǔn)確獲得定性與定量分析數(shù)據(jù)的要求。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Shimadzu 30A-LC超高效液相色譜儀和Shimadzu 30A 自動進樣器(日本 Shimadzu 公司);API 5500 QTrap三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore 公司);Eyela Cute Mixer CM100高速振蕩器(日本Eyela公司);高速離心機(美國Thero公司);96孔去磷酯板ISOLUTE PLD+ 50mg 96孔板(瑞典Biotage公司);PSA萃取柱SEP-Pak Vac PSA 1mL(Waters公司)。

    標(biāo)準(zhǔn)品: 扎來普隆、5-氧-扎來普隆、脫乙基扎來普隆(加拿大Toronto公司);乙腈、0.1%甲酸-乙腈、甲酸、乙醇(色譜純,Thermo Fisher公司);無水Na2SO4(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);無水MgSO4(分析純,北京百靈威科技有限公司)??瞻籽獦尤∽员本?fù)興醫(yī)院。

    標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備: 分別準(zhǔn)確稱取10 mg(精確到0.01 mg)的扎來普隆、5-氧扎來普隆、脫乙基扎來普隆標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取適量單標(biāo)儲備液,用乙腈逐級稀釋為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,密封,于 10℃保存。使用前,用乙腈稀釋至所需要的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    2.2 樣品制備

    取0.5 mL空白血液樣品置于15 mL塑料離心管中,添加200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品,振蕩10 s,混勻后加入300 mg無水MgSO4,并加入1.3 mL 0.1%甲酸-乙腈,振蕩5 min,充分混勻。使用離心機8000 r/min離心10 min。取部分上清液經(jīng)0.22 μm有機膜過濾,濾液供UPLC-MS/MS分析。

    2.3 檢測條件

    2.3.1 超高效液相色譜條件 選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm× 2.1 mm,1.7 μm)色譜柱; 柱溫40℃; 進樣量1 μL; 0.1%甲酸(A相)和0.1%甲酸-乙腈(B相)作為流動相,流速0.4 mL/min。采用4 min梯度洗脫模式: 0~0.5 min,10% B; 0.5~0.51 min,10%~50% B; 0.51~1.6 min, 50% B; 1.6~1.7 min,50%~10% B; 1.7~4.0 min, 10% B。

    2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(MRM); 離子源電壓(IS): 5500 V; 源溫度(TEM): 600℃; 氣簾氣(CUR): 0.20 MPa; 噴霧氣(GSI): 0.38 MPa; 輔助氣(GS2): 0.34 MPa; 碰撞氣(CAD): High。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 色譜條件的優(yōu)化

    比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)和ZORBAX Eclipse PlusC18(150 mm×2.1 mm,1.8 μm)兩種色譜柱,前者對目標(biāo)物分離效果更好,且呈現(xiàn)更好的峰形,因此選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。

    從選擇性、分離效果及靈敏度角度考慮,流動相的有機相選擇乙腈比甲醇更理想。從目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)分析,目標(biāo)物具有氰基,能夠電離吸收電子。流動相中加入適當(dāng)甲酸,可以提高離子化效率。優(yōu)化實驗表明,使用水(A)和乙腈(B)作為流動相,3種目標(biāo)物保留時間集中,無法分離。使用0.1%甲酸(V/V)(A)和0.1%甲酸-乙腈(V/V)(B)作為流動相,扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物可以實現(xiàn)很好的分離(圖2)。

    比較了3種洗梯度脫程序?qū)δ繕?biāo)的分離效果: (1) 0~1.0 min, 10% B; 1.0~1.1 min, 10%~90% B; 1.1~2.0 min, 90% B; 2.0~2.1 min, 90%~10% B; 2.1.0~4.0 min, 10% B。(2) 0~1.0 min, 10% B; 1.0~1.1 min, 10%~50% B; 1.1~2.0 min, 50% B; 2.0~2.1 min, 50%~10% B; 2.1~4.0 min, 10% B。(3) 0~0.5 min, 10% B; 0.5~0.51 min, 10%~50% B; 0.51~1.6 min, 50% B; 1.6~1.7 min, 50%~10% B; 1.7~4 min, 10% B。實驗結(jié)果表明,第3種洗脫程序?qū)δ繕?biāo)物的分離效果最佳。

    3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    選擇ESI+電離模式,使用注射針泵分別注入扎來普隆及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品。在m/z 100~350范圍內(nèi)進行母離子掃描,在一級全掃描質(zhì)譜中得到母離子質(zhì)量數(shù) +。調(diào)節(jié)儀器參數(shù),選擇+作為母離子進行二級質(zhì)譜裂解分析,不斷增加碰撞能,子離子碎片逐漸增多。最終選定強度最高的兩對子離子與母離子組成兩對離子對,作為定性分析離子,并以最強的離子對作為定量分析離子。同時,對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明,在選定的條件下,扎來普隆及其代謝產(chǎn)物均有良好的色譜峰(表1)。

    3.3 前處理提取溶劑的優(yōu)化

    基質(zhì)效應(yīng)是指在樣品測定過程中,待測物以外的其它物質(zhì)直接或間接影響待測物響應(yīng)的現(xiàn)象[19]。隨著QuEChERS方法應(yīng)用范圍拓寬,實驗人員可根據(jù)具體實驗情況對樣品提取溶劑[20]、樣品凈化過程[21]、提取液濃縮過程[22]等進行優(yōu)化,以達到降低基質(zhì)效應(yīng)的作用。血液樣品中基質(zhì)成分非常復(fù)雜,主要是內(nèi)源性的磷脂、脂肪、膽固醇、甘油三酯和蛋白質(zhì)[23,24]。為避免復(fù)雜的基質(zhì)成分在液質(zhì)檢測中產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),影響定量檢測,實驗選用有機溶劑提取。根據(jù)文獻 [24] 報道,甲酸可沉淀蛋白質(zhì)和脂肪。本研究發(fā)現(xiàn),在有機溶劑中添加適量甲酸(0.1%, V/V)可提高蛋白沉淀效果。因此優(yōu)化前處理條件后,選擇0.1%甲酸-乙腈(V/V)作為提取溶劑

    為避免緩沖鹽對質(zhì)譜檢測造成基質(zhì)效應(yīng),在提取過程中未使用緩沖溶液。實驗選用無水MgSO4作為脫水用鹽,同時對比無水Na2SO4脫水效果。結(jié)果表明,Na2SO4遇水易板結(jié),不易在血液中充分混勻,與文獻[25]一致。

    3.4 前處理凈化方法的優(yōu)化

    樣品凈化的目標(biāo)是要盡可能除去生物樣品中的雜質(zhì),同時最大限度保留目標(biāo)物,降低基質(zhì)效應(yīng)的同時,保證較高回收率。

    考察了3種凈化方法: 方法(1)為傳統(tǒng)QuEChERS方法,將離心后的提取液過PSA(乙二胺-N-丙基)固相萃取柱,并用0.1%甲酸-乙腈洗脫、定容。PSA用于去除有機酸、酚類和少量的色素等,在農(nóng)殘檢測中有效消除有機酸和色素等干擾,從而降低了基質(zhì)效應(yīng); 方法(2)是將離心后的提取液過96 孔去磷酯板 ISOLUTE PLD,以便有效除去血液中磷脂成分,從而降低基質(zhì)效應(yīng)對實驗的影響; 方法(3)為省略凈化過程,將離心后的提取液直接經(jīng)0.22 μm有機膜過濾,濾液供LC/MS分析。

    采用國際上通行的 Matuszewski方法[26],比較不同條件下的峰面積平均值??疾旎|(zhì)效應(yīng)(ME)和回收率(RE)。

    A組: 標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣分析所得峰面積; B組: 經(jīng)前處理方法提取后添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液樣品,分析所得峰面積; C組: 全血中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液后經(jīng)前處理方法提取所得峰面積。

    3種凈化方法對目標(biāo)物的回收率及基質(zhì)效應(yīng)的影響見圖3。結(jié)果表明,3種前處理方法均有效降低了基質(zhì)效應(yīng),同時回收率均達到90%以上,均滿足實際辦案要求。綜合考慮,方法(3)的回收率最高,同時簡化了凈化過程,一步完成萃取凈化,節(jié)省了時間,減少了耗材。因此,本實驗選用第3種凈化方法。

    3.5 方法評價

    3.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 在優(yōu)化的實驗條件下進行方法學(xué)的考察。取空白全血5份各0.5 mL。分別配制成0.5, 1.0, 5.0, 10, 50和100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品。按2.3節(jié)方法進行前處理后,再進行儀器分析。以不同濃度目標(biāo)物的峰面積進行線性回歸,結(jié)果表明,扎來普隆及其代謝產(chǎn)物在0.5~100 ng/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9975~0.9987,以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的添加水平作為檢出限(LOD),10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的添加作為定量限(LOQ),結(jié)果見表2。

    3.5.2 方法回收率和精密度 方法采用空白血樣添加標(biāo)準(zhǔn)混合目標(biāo)物方式,在空白血樣中分別添加0.5, 5和50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品,每個濃度血樣平行配制3份樣品, 按照2.3節(jié)的方法進行處理。通過對比峰面積計算回收率(見表3),結(jié)果令人滿意。

    4 結(jié) 論

    采用QuEChERS方法處理樣品,以超高效液相色譜-質(zhì)譜法對血液中的扎來普隆及其代謝產(chǎn)物進行分析。通過對色譜、質(zhì)譜條件和前處理方法的優(yōu)化,建立了同時檢測全血中扎來普隆及其代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆QuEChERS-UPLC-TQ/MS分析方法。優(yōu)化的QuEChERS前處理方法綜合了除蛋白方法簡便快速和固相萃取方法低基質(zhì)效應(yīng)的優(yōu)勢,在有效降低基質(zhì)效應(yīng)的同時,保證了較高的回收率。本方法快速靈敏、回收率高,能夠滿足實際辦案的需求。

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    Abstract A fast testing method was established for the determination of zaleplon and its two metabolites, 5-oxozaleplon and desethylzaleplon, in blood by ultra performance liquid chromatography tandem electrospray ionization triple quadrapole-mass spectrometry (UPLC-TQ/MS). The optimized QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) method was used for sample preparation. The blood samples were extracted with 0.1% acetic acid and dehydrated by adding anhydrous magnesium sulfate. The targets were separated on a Waters BEH C18 column by gradient elution with 0.1% formic acid-0.1% formic acid/acetonitrile as mobile phase, ionized with positive electrospray (ESI+), and detected under multiple reaction monitoring (MRM) mode. As a result, zaleplon and its two metabolites displayed excellent linearity in the concentration of 0.5-100 ng/mL (R2>0.997). The average recoveries ranged from 92.0% to 100.1%. The RSD were in the range of 1.9%-5.3%. Besides, the limit of detection(LOD)of this method for target drugs was 0.05 ng/mL (S/N=3), while limits of quantification (LOQ) were in the range of 0.1-0.5 ng/mL (S/N=10) . This method can meet the demand of rapidity and accuracy in the analysis of actual cases.

    Keywords Zaleplon; 5-Oxozaleplon; Desethylzaleplon; QuEChERS; Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

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