天然活性小分子靶標蛋白識別方法學研究進展

屠鵬飛　曾克武　廖理曦　宋小敏

[摘要]藥物靶標是指人體內(nèi)與藥物相互作用并賦予藥物效應(yīng)的特定分子。作為傳統(tǒng)中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，天然活性小分子的作用機制闡明，特別是作用靶標的鑒定一直是藥學研究者關(guān)注的重要課題，然而目前該領(lǐng)域一直未取得長足的進展。作者針對近年來在天然活性小分子靶標蛋白識別鑒定方面出現(xiàn)的新技術(shù)、新方法進行了總結(jié)，系統(tǒng)介紹了目前該領(lǐng)域的主流研究方法，原理以及成功案例，同時還探討了每種方法的適用性及不同方法之間的優(yōu)劣。相信該文對從事天然藥物化學、藥理學以及化學生物學領(lǐng)域的研究人員有一定的啟發(fā)和借鑒作用。

[關(guān)鍵詞]天然活性小分子；靶標蛋白；方法學；分子親和色譜；活性蛋白質(zhì)譜

天然活性小分子是新藥研發(fā)的重要來源，目前有相當比例的臨床用藥都直接或間接來源于天然藥物。然而，以往針對天然活性分子的活性研究大多集中在細胞表型變化的觀測及初步的藥效學指標評價上，即使是分子機制研究也大多僅關(guān)注一些經(jīng)典的藥理信號通路，往往忽略這些活性分子直接作用靶標的鑒定。主要原因可能在于天然活性分子的結(jié)構(gòu)多樣性和復雜性。例如不同科屬、不同地域生長的藥用植物性狀差別很大，導致其所含有的活性化學成分多種多樣，結(jié)構(gòu)更是千差萬別。由于化合物的結(jié)構(gòu)直接決定著其藥理活性作用，而天然活性分子的結(jié)構(gòu)如此復雜，因此其可能作用的蛋白靶標非常繁多，即使是一個活性分子也可能同時作用于多個蛋白靶標，鑒定工作非常具有挑戰(zhàn)性。另外一個原因就是天然活性分子中很大一部分化合物的結(jié)構(gòu)含有多個活性位點，也就是說其中包含了多個可以成為藥效團的亞結(jié)構(gòu)，因此到底是哪一部分發(fā)揮了藥效，其與靶標蛋白是如何作用的？這些問題均難以得到解答，或至少在技術(shù)上存在相當?shù)碾y度，因此這也是制約天然活性分子靶標蛋白闡明工作的一個障礙。

目前，在探索天然活性分子的靶標蛋白方面，前人已經(jīng)積累了一些經(jīng)驗，在此該文就當前主流的天然活性分子靶標蛋白鑒定工作進行了總結(jié)和分類，旨在為今后該領(lǐng)域的研究提供一些技術(shù)和方法上的借鑒。就目前的研究進展來看，天然活性小分子的靶標蛋白識別主要采用如下一些方法，各種方法互有優(yōu)劣，可相互借鑒，也可綜合運用。①基于分子親和色譜技術(shù)識別天然活性小分子靶標蛋白（化學蛋白質(zhì)組學）；②基于活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)識別天然活性小分子靶標蛋白；③基于活性小分子結(jié)構(gòu)的計算機輔助反向?qū)ぐ屑夹g(shù)；④基于生物物理學方法推測天然活性小分子靶標蛋白；⑤基于關(guān)鍵疾病信號通路識別天然活性小分子靶標蛋白；⑥其他新方法。

下面就分別對這些方法的原理和應(yīng)用進行詳細的論述和分析

1基于分子親和色譜技術(shù)識別天然活性小分子靶標蛋白（化學蛋白質(zhì)組學）

在目前所采用的各種靶標蛋白識別技術(shù)中，小分子親和色譜法（small molecule affinity chromatography）是應(yīng)用最為廣泛的一種。目前應(yīng)用該法已經(jīng)識別并鑒定了包括天然活性分子在內(nèi)的大量藥物分子的靶標蛋白。目前的小分子親和色譜法一般需要對活性小分子的結(jié)構(gòu)進行修飾，通過化學手段引入標簽分子進而將其連接到免疫親和載體上，并進行靶標蛋白的富集和識別。標簽分子主要是biotin，此外還包括熒光基團、化學反應(yīng)基團、光反應(yīng)基團、放射性同位素等。下面分別進行具體的介紹。

1.1通過引入biotin標簽分子構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體biotin是一種相對分子質(zhì)量為244的生物小分子，廣泛分布于動植物體內(nèi)。在生物學研究中，人們常利用hio-tin與avidin（親和素）之間的穩(wěn)定結(jié)合能力，對蛋白質(zhì)及其他生物大分子進行標記和純化富集等操作。目前已經(jīng)發(fā)展出了一套十分成熟的biotin-avidin系統(tǒng)（BAS）用于活性小分子的靶標蛋白富集和識別。即通過將biotin與活性小分子進行化學共價鍵連接進而構(gòu)建一種biotin修飾的活性小分子探針，并用于后續(xù)的靶標蛋白識別研究。該方法的優(yōu)勢在于，biotin與avidin之間存在天然的特異性強相互作用，因此利用avidin包被的瓊脂糖（agarose）固相載體與biotin修飾的天然活性小分子之間進行反應(yīng)，利用biotin與avidin的相互作用將活性小分子固定并包被在固相載體上，進而再通過活性小分子與蛋白之間的相互作用，富集和純化到相應(yīng)的靶標蛋白（圖1）。

由于該法易于操作、適用面廣，因此研究人員采用該法已經(jīng)富集并識別到了一批新穎的藥物靶標蛋白。陳國強教授課題組針對天然活性分子腺花素（adenanthin）治療早幼粒白血病的靶標蛋白開展了深入研究，其利用腺花素分子結(jié)構(gòu)中的活性羥基基團作為把手，通過在其上連接長鏈的biotin分子基團進而構(gòu)建了biotin化腺花素探針分子（bio-adenan-thin），并據(jù)此富集到了相應(yīng)的靶標蛋白為過氧化物酶（perox-iredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ，圖2a）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，腺花素可以通過靶向作用于peroxiredoxin Ⅰ和peroxiredoxinⅡ進而抑制其氧化活性，提升細胞內(nèi)過氧化氫水平，激活ERK-C/EBPB信號通路并最終促進白血病細胞的分化，實現(xiàn)治療作用。此外，腺花素還可以通過靶向作用于peroxiredoxinⅠ和peroxiredoxinⅡ誘導細胞毒性作用，進而實現(xiàn)抗肝癌的治療作用。雷曉光課題組通過對天然抗炎活性分子ain-sliadimer A的結(jié)構(gòu)進行修飾，在其羥基基礎(chǔ)上引入biotin長鏈分子，構(gòu)建了抗炎活性分子探針bio-ainsliadimer A（圖2b），進而富集到了其抗炎靶標蛋白為IKB激酶（IKKa/β）。Ainsliadimer A能夠選擇性作用于46位半胱氨酸并與其形成共價鍵，進而抑制IKKα/β的活性并下調(diào)NF-κB炎癥信號通路，實現(xiàn)抗炎作用。此外，通過構(gòu)建biotin修飾的ainsliatri-mer A分子探針，該課題組還探索了其具有抗腫瘤作用的靶標蛋白PPARγ。天然產(chǎn)物withaferin A（WFA）具有明顯的抗腫瘤和抗血管增殖活性，Mohan研究組針對WFA的分子結(jié)構(gòu)合成了biotin修飾的抗腫瘤分子探針WFA--B（圖2c）。通過靶標蛋白的富集和鑒定，發(fā)現(xiàn)WFA可以特異性結(jié)合于中間絲狀體蛋白（intermediate filament protein）并共價結(jié)合于其半胱氨酸殘基，進而抑制細胞微管生長，實現(xiàn)抗腫瘤作用。再有，從沙雷氏菌Serratia liquefaciens中提取得到的天然產(chǎn)物FRl77391具有良好的降血脂作用，能夠降低體內(nèi)甘油三酯的水平，但是其作用靶標尚不明確。研究人員通過結(jié)構(gòu)改造，在其分子中引入biotin標簽分子，進而構(gòu)建了分子探針Biotin-FR177391（圖2d），并將其包被在固相樹脂上，然后通過小分子親和色譜技術(shù)，富集并純化到該小分子的靶標為蛋白質(zhì)磷酸酶2A（phosphatase 2A，PP2A）。即FR177391可以通過抑制PP2A的活性進而調(diào)控下游的ERK信號通路，實現(xiàn)降血脂作用。

1.2通過與環(huán)氧基團反應(yīng)構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體環(huán)氧活性基團是一種以環(huán)氧乙烷為基本結(jié)構(gòu)的反應(yīng)基團，其可以在堿性條件下與化合物分子中的羥基進行共價鍵結(jié)合，進而實現(xiàn)對小分子的結(jié)構(gòu)修飾。Epoxy-activated Sepha-rose 6B beads是目前使用較為流行的一種環(huán)氧活性基團修飾的固相載體，其可以與含有羥基結(jié)構(gòu)的化學小分子進行反應(yīng)并將小分子鍵合到固相載體表面，并用于小分子靶標蛋白的富集研究.張衛(wèi)東教授課題組研究了天然倍半萜內(nèi)酯TJ-5的抗炎作用及靶標蛋白，其通過利用TJ-5分子結(jié)構(gòu)中的活性羥基，將其與Epoxy-activated Sepharose 6B beads進行反應(yīng)，形成共價鍵連接，進而將TJ-5分子鍵合到了該固相載體表面。隨后利用TJ-5與靶標蛋白之間的相互作用富集并識別到了相應(yīng)的靶標蛋白為泛素連接酶UbcH5（圖2e）。隨后研究發(fā)現(xiàn)，TJ-5可以通過與UbcH5的半胱氨酸活性位點之間形成共價鍵連接，進而抑制泛素分子與UbcH5的結(jié)合，從而抑制NV+R炎癥信號通路的激活，實現(xiàn)抗炎作用。另外，還有學者將姜黃素（curcumin）與Epoxy-activated Sepharose 6Bheads進行反應(yīng)進而得到姜黃素包被的固相載體，然后富集和純化相應(yīng)的靶標蛋白。經(jīng)二維凝膠分離和MALDI/TOF/TOF質(zhì)譜鑒定后發(fā)現(xiàn)了若干種結(jié)合蛋白，包括結(jié)構(gòu)性蛋白（tubulin，actin），細胞代謝相關(guān)酶（烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶，果糖-1，6-二磷酸醛縮酶），以及細胞凋亡相關(guān)酶（熱休克蛋白71，過氧化物酶2）

但是這些蛋白是否是姜黃素分子的特異性結(jié)合靶標蛋白還有待進一步研究。

1.3通過與其他類型基團反應(yīng)構(gòu)建天然活性小分子免疫親和載體秦皮乙素（esculetin）具有較好的抗結(jié)腸癌作用，但是其作用靶標尚不明確，研究人員利用該化合物的結(jié)構(gòu)中含有酚羥基的特點，使之與溴化氰活化的CNBr-Sepharose 4B發(fā)生反應(yīng)，進而構(gòu)建esculetin修飾的固相親和載體。研究人員利用該載體富集到了相應(yīng)的靶標蛋白為β-耳關(guān)蛋白（β-cate-nin），esculetin可能與蛋白序列中的Lys312，Gly307，Lys345和Ash387等氨基酸基團發(fā)生直接相互作用，抑制β-eatenin-Tcf絡(luò)合物的形成，降低細胞存活率，進而實現(xiàn)抗腫瘤作用。除此之外，還有多種其他類型的親和基質(zhì)可供使用，如AffiGel，Toyopearl，AQUAFIRMUS，SG beads等，對此已有專門的文獻進行了系統(tǒng)的分析和比較。

這里值得一提的是，在應(yīng)用分子親和色譜技術(shù)富集到相應(yīng)的靶標蛋白后，目前主要通過液相質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進行蛋白質(zhì)一級序列的鑒定，也就是將富集到的蛋白樣品經(jīng)過凝膠電泳后進而染色，并將相應(yīng)的蛋白條帶切割下來進行分析。一般來講，凝膠電泳后的蛋白樣品的性質(zhì)相對穩(wěn)定，可在4℃避光條件下保存1個月左右。

2基于活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)識別天然活性小分子靶標蛋白

活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（activity-based protein profiling，AB-pp）主要是利用化學合成的帶有不同功能標簽（熒光疊氮炔基等）的小分子探針與靶標蛋白形成共價鍵，進而能夠在高度復雜的生物樣品中標記檢測分離靶標蛋白的新技術(shù)。一般來講，ARPP中使用的小分子探針包含有一個親電基團，其能夠與靶標蛋白活性口袋附近的親核氨基酸發(fā)生反應(yīng)，進而將該蛋白從復雜的蛋白混合體系中識別并分離出來因此，小分子探針一般在結(jié)構(gòu)上要包含反應(yīng)基團（疊氮，炔基等），作用是使得該分子探針與蛋白結(jié)合后能夠被后續(xù)加入的熒光染料固相基質(zhì)等特異性的識別，進而實現(xiàn)熒光標記和純化分離的目的（圖3）。ARPP是目前最受關(guān)注，應(yīng)用范圍最廣的蛋白靶標識別技術(shù)之一該技術(shù)特別適合于小分子與靶蛋白之間能形成共價鍵結(jié)合的情況，因此需要小分子在結(jié)構(gòu)上含有能夠與靶蛋白發(fā)生反應(yīng)的功能性結(jié)構(gòu)基團，以便于與靶蛋白之間發(fā)生反應(yīng)形成共價鍵其中，典型的親電基團包括：環(huán)氧基，內(nèi)酯，β-內(nèi)酰胺，醌類，Michael受體等。這里的Michael受體是烯鍵或炔鍵與吸電子基團共軛相連形成的官能團，該結(jié)構(gòu)易于與生物活性分子中的強親核基團（半胱氨酸的巰基）發(fā)生加成反應(yīng)，進而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學效應(yīng)。

2.1活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（ABPP）用于活性小分子的靶標蛋白識別案例 從明日草Angelica keiskei中分離出的活性查爾酮小分子4-bydroxyderricin（4-HD）具有廣泛的抗菌作用，能夠明顯抑制金黃色葡球菌的增殖，但是其作用機制和靶標蛋白仍不清楚。因此研究人員在其原有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過化學合成引入炔基結(jié)構(gòu)，進而構(gòu)建了小分子探針（圖3a）。并通過活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)捕捉并鑒定到了4-HD的靶標蛋白為絲氨酰tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，STS）。由于4-HD可以共價結(jié)合于細菌的STS上并對其進行結(jié)構(gòu)修飾，從而抑制了其催化氨?；磻?yīng)的活性，干擾細菌的正常生長和復制過程，實現(xiàn)抗菌作用。研究人員通過在淺藍菌素（cerule-nin）結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入長鏈炔基進而構(gòu)建活性分子探針，用于特異性標記活細胞內(nèi)的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（palmitoyl acvltrans-ferasePATs）。結(jié)果顯示，構(gòu)建的分子探針能夠很好的標記PATs，并用于后續(xù)的質(zhì)譜研究（圖3h）。該研究不僅解釋了天然產(chǎn)物cerulenin的生物靶標，也為后續(xù)關(guān)于PATs的生物功能學研究提供了一種可靠的分子探針。寄端霉素（hy-pothemycin）是一種真菌來源的天然聚酮類化合物，其可以通過抑制體內(nèi)的多種激酶進而實現(xiàn)抗腫瘤抗寄生蟲病的作用研究人員通過在其分子結(jié)構(gòu)中引入炔基進而構(gòu)建分子探針（圖3c），以此富集和捕捉其結(jié)合的靶標蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，該蛋白為含有Cys-Asp-Xaa-Gly序列的錐蟲（trypanosome kinase）系列激酶（CDXG kinases）。特別是其中的T.brucei cdc2-like kinas。1（TbCLK1）激酶，是該活性分子治療非洲錐蟲病的關(guān)鍵作用蛋白靶標。

2.2光親和基團活性蛋白質(zhì)譜技術(shù)（PAL-ABPP）用于分子靶標尋找案例 拉二烯內(nèi)酯（pladienolide）是一種具有天然抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，研究人員通過對其進行結(jié)構(gòu)改造，在其結(jié)構(gòu)中同時引入biotin標簽分子和光親和基團偶氮丙啶，構(gòu)建了一種抗腫瘤光親和分子探針（圖3d）。該研究組通過光交聯(lián)親和純化技術(shù)，讓構(gòu)建的光親和分子探針與細胞內(nèi)的靶標蛋白進行交聯(lián)，并通過hiotin標簽富集到了相應(yīng)的靶標蛋白經(jīng)液相質(zhì)譜鑒定，該靶標蛋白為剪切因子3b（splicing factor 3b，SF3b）中的3型亞基（SAP130）。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，Pladienolide可以直接作用于SAP130，進而抑制SF3b蛋白復合物的功能，降低其在細胞內(nèi)對特定核酸的剪切能力，抑制腫瘤細胞增殖并實現(xiàn)抗腫瘤作用。另外一個比較特殊的案例是天然產(chǎn)物槲皮素（quercetin）的靶標蛋白識別由于槲皮素自身就具有光反應(yīng)活性，因此可以自身結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)構(gòu)建光親和反應(yīng)探針，研究人員在其酚羥基基礎(chǔ)上通過酯化反應(yīng)引入biotin標簽分子，進而構(gòu)建光親和分子探針（圖3e）。由于quercetin與靶標蛋白結(jié)合后，在紫外光照射下可以對蛋白進行光標記，進而捕捉靶標蛋白然后再利用quercetin上的biotin標簽富集和純化靶標蛋白，經(jīng)液相質(zhì)譜鑒定后共分析出多個特異性結(jié)合的靶標蛋白，包括熱休克蛋白HSP70/HSP90、酪蛋白激酶2（CK2）線粒體ATP酶泛素激活酶等。

2.3基于同位素標記STLAC方法的活性小分子尋靶案例細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是目前定量蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域中的重要方法其特別適合于分析復雜生物樣品中的蛋白質(zhì)表達量的變化RTT Ar技術(shù)的原理就是用天然同位素（輕型）及穩(wěn)定同位素（重型）標記的氨基酸取代原有培養(yǎng)基中的氨基酸，細胞經(jīng)6-8次傳代后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質(zhì)中，代替原有氨基酸最后再將具有不同標記的細胞蛋白裂解液等比例混合，經(jīng)凝膠電泳分離后做質(zhì)譜鑒定，從而分析不同處理組細胞中蛋白表達量的變化。基于此技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物雷帕霉素（rapamycin）可以穩(wěn)定5′-terminal oligopyrimidine（TOP）mRNAs編碼的蛋白質(zhì)，包括核糖體蛋白和延伸因子等，進而影響整個細胞的生命過程。此外基于STLAC的研究發(fā)現(xiàn)，（_）-aR，11S-楊梅醇（Myricanol）可以通過特異性誘導細胞內(nèi)自噬通路從而促進tau蛋白的降解，清除細胞內(nèi)的tau。

2.4其他方法

熒光染料轉(zhuǎn)移法：天然產(chǎn)物marinopyr-role A具有較好的抗腫瘤活性，研究人員在其分子結(jié)構(gòu)中引入帶有酰基結(jié)構(gòu)的熒光基團，構(gòu)建了熒光親和分子探針（圖3f）。當該分子探針與靶標蛋白發(fā)生相互作用時，熒光基團中的?；軌蚺c蛋白中的氨基發(fā)生連接，將熒光基團轉(zhuǎn)移并共價連接到蛋白上，進而對該蛋白進行熒光標記，同時釋放小分子由于標記的蛋白具有熒光效應(yīng)，因而可以通過凝膠電泳及熒光顯色方式分離純化該蛋白。經(jīng)過鑒定，marinopy-rrole A的靶標蛋白為細胞骨架蛋白actin。

活細胞在體標記技術(shù)，即通過小分子探針對活細胞內(nèi)的靶標蛋白進行動態(tài)標記和成像的技術(shù)，目前已經(jīng)可以實現(xiàn)其基本原理是，通過在小分子結(jié)構(gòu)中引入疊氮基，使小分子探針首先與靶標蛋白發(fā)生結(jié)合，進而加入具有環(huán)辛炔（cyclooctyne）基團的熒光報告分子，在活細胞內(nèi)，探針上的疊氮基團與熒光報告分子上的環(huán)辛炔發(fā)生偶極環(huán)加成反應(yīng)，成共價鍵連接，進而實現(xiàn)對活細胞內(nèi)靶標蛋白的動態(tài)標記和成像。

1基于活性小分子結(jié)構(gòu)的計算機反向?qū)ぐ屑夹g(shù)

計算機反向?qū)ぐ屑夹g(shù)是一種基于小分子結(jié)構(gòu)特點進行反向靶標蛋白預(yù)測的方法。Pharm Mapper是一個可自由訪問的在線服務(wù)器，其主要通過藥效團匹配法鑒定藥物分子的作用靶標。通過藥效團搜尋策略，Pharm Mapper可以在數(shù)小時內(nèi)完成對潛在藥物靶標的搜尋。在Pharm Mapper的數(shù)據(jù)庫中存儲了超過7000個基于受體的藥效團模型（覆蓋了1 627個藥物靶標信息，包括459人體靶標蛋白）。Chem Mapper是另一種基于計算機的藥物分子靶標識別軟件，其識別靶標的理論基礎(chǔ)是具有相似結(jié)構(gòu)的化合物可能具有相似的靶標作用方式。Chem Mapper整合了大約30萬具有藥理學功能注釋的化合物結(jié)構(gòu)以及超過300萬個結(jié)構(gòu)明確的化合物。Chem Mapper可用于各種化合物的藥理學活性預(yù)測、藥物分子_靶標相關(guān)性探索計算機虛擬篩選研究等領(lǐng)域。目前，我國的多家研究機構(gòu)已經(jīng)開展了大量的此類研究。比如北京計算中心以內(nèi)部開發(fā)的靶標數(shù)據(jù)庫為核心，分子對接方法為基礎(chǔ)，研發(fā)了一套較為完整的計算機反向?qū)ぐ邢到y(tǒng)，能提供在線服務(wù)（http：∥reversedock.vslead.com/）。其靶標數(shù)據(jù)庫包含了600多個靶標的7000多個活性位點信息用戶只需提交小分子結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)即可通過小分子與活性位點的一一對接匹配，給出排名靠前的活性位點，預(yù)測小分子的潛在作用靶標。此平臺的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫的準確性，數(shù)據(jù)庫靶標為疾病靶標，三維結(jié)構(gòu)完整（無殘基缺失），靶標的生物信息全面，包括靶標的PubMed，EC，UniProt，CAS，Drug-Rank等信息，方便用戶進行后續(xù)結(jié)果分析據(jù)報道，有研究人員綜合利用2種反向虛擬靶點篩選系統(tǒng)（idTarget和PharmMapper）對中藥藏紅花的抗腫瘤活性成分開展了計算機反向?qū)ぐ醒芯?通過虛擬對接結(jié)合能計算和打分，進而發(fā)現(xiàn)了苦藏花素（picrocrocin）與熱休克蛋白Hsp90 alpha可發(fā)生特異性結(jié)合，其分子機制可能是苦藏花素與Hsp90-alpha ATPase的催化結(jié)構(gòu)域中的若干個帶電氨基酸基團發(fā)生親核反應(yīng)，從而調(diào)控了該蛋白酶的活性所致。此外，黃芩素（baicalein）具有較好的抗帕金森作用，但是其靶標蛋白不明確，研究人員利用計算機虛擬靶標篩選平臺，通過數(shù)據(jù)庫挖掘分子對接基于結(jié)構(gòu)的藥效團搜索（structure-based pharmacophore searching）以及化學相似性搜索（chemical similarity searching）等技術(shù)，找到了黃芩素的作用靶標蛋白為兒茶酚對甲基轉(zhuǎn)移酶（cate-chol-O-methyltransferase，COMT）和單胺氧化酶（monoamine oxidase B，MAO-B）。研究人員進而還在NMDA誘導的SHSY5Y細胞模型上驗證了黃芩素對細胞的保護作用，以及對一氧化氮和活性氧自由基的調(diào)控作用。

4基于生物物理學方法推測天然活性小分子靶標蛋白

蛋白穩(wěn)定性實驗是生物物理學中比較常見的一種鑒定活性小分子結(jié)合靶標蛋白的方法，其理論依據(jù)是如果活性小分子和大分子蛋白發(fā)生結(jié)合，那么由于蛋白與活性小分子結(jié)合后的絡(luò)合物變得更加牢固，進而增加了蛋白的穩(wěn)定性，與游離的非結(jié)合蛋白相比降解速度更慢。因此可通過測定非藥物處理組與藥物處理組的全蛋白譜變化，然后進行比較，從而甄別出那些藥物處理前后蛋白表達量發(fā)生顯著變化的蛋白，由此可初步判斷其為潛在的小分子結(jié)合靶蛋白，該技術(shù)也被稱為藥物親和靶標穩(wěn)定性分析（drug affinity responsivetarget stability，DARTS）。最近還有一種更新穎的方法報道出來，即基于氧化速率的蛋白穩(wěn)定性分析（stability of pro-teins from rates of oxidation，SPROX）。該方法是通過測定被氧化的蛋氨酸殘基水平進而評估可能與小分子發(fā)生結(jié)合的潛在蛋白，如果活性小分子與某一個蛋白發(fā)生結(jié)合，則將會改變該蛋白的折疊狀態(tài)，進而改變該蛋白序列中蛋氨酸上的特異性氧化反應(yīng)進程，最終通過質(zhì)譜得以鑒定。此類方法的一個問題是，實驗中需要使用高于生理濃度的小分子化合物，有的甚至高達mmol·L^-1級別，因此其分析結(jié)果是否能夠真正反映生理狀態(tài)下的靶蛋白和小分子間相互作用還有待進一步考察

5基于關(guān)鍵疾病信號通路識別天然活性小分子靶標蛋白

很多天然活性產(chǎn)物的作用機制研究是源于對其藥用植物本身的傳統(tǒng)應(yīng)用而開展的，即古代醫(yī)書中對某個植物的藥用功效記載很可能在其提取物中有所體現(xiàn)這樣可以根據(jù)目前已知的針對該類疾病的分子信號通路入手，逐步探索該活性成分可能的作用靶標蛋白

雷公藤的傳統(tǒng)功效包括祛風除濕通絡(luò)止痛消腫止痛等，臨床上用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎等癥。雷公藤內(nèi)酯（triptolide）是一種結(jié)構(gòu)獨特的二萜類天然活性分子，具有抗炎免疫抑制抗腫瘤等活性：但是其具體的作用靶標目前尚不清楚由于上述抗炎生物活性作用一般多與炎癥轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控密切相關(guān)，因此基于此類猜測，約翰·霍普金斯大學的研究人員系統(tǒng)地研究了triptol-ide對細胞轉(zhuǎn)錄的不同階段和參與每個階段的不同功能性蛋白的調(diào)控作用。最終發(fā)現(xiàn)triptolide的抗炎作用分子靶標是轉(zhuǎn)錄因子TFIIH的XPB/ERCC3亞基。從而為triptolide的抗炎分子機制闡明提供了重要的實驗信息。

6其他新方法

葡糖基殺粉蝶菌素A（ducopiericidin A，GPA）是一種由放線菌產(chǎn)生的能夠抑制微生物的絲狀偽足突起（filopodia protrusion）的天然活性成分，日本學者利用代謝組學方法研究了GPA的作用靶標蛋白。通過毛細管電泳_飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-TOF-MS），該研究團隊發(fā)現(xiàn)GPA能夠靶向作用葡萄糖轉(zhuǎn)運體進而抑制糖酵解過程，因此GPA可以作為一種糖酵解的分子探針加以使用。這是一個利用代謝組學分析方法鑒定分子靶標蛋白的優(yōu)秀案例。海洋真菌次級代謝產(chǎn)物Xvloketal B（XKB）具有顯著的抗氧化、神經(jīng)保護、心肌保護作用，但是其作用的蛋白靶標及代謝調(diào)控作用尚不清楚。研究人員將咪達唑侖（midazolam）作為模型分子探針，利用生物信息學軟件平臺DDI-CPI（predicting drug-drug interaction via chemical-protein interactome）預(yù)測XKB的作用靶標蛋白為Cyp3a2，并采用同源建模和分子對接技術(shù)研究了XKB與靶標蛋白Cyp3a2之間的相互作用，進而通過DAVID軟件（database for annotation，visualization and integrated dis-covery）分析了基于該靶標蛋白的XKB信號調(diào)控通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了324個潛在的靶標蛋白以及62條信號通路可能被XKB所調(diào)控，同時還發(fā)現(xiàn)XKB可以顯著下調(diào)P450 3a（Cyp3a）亞家族成員的活性和表達水平。

7總結(jié)

天然活性小分子的靶標蛋白識別是天然藥物學和新藥研發(fā)領(lǐng)域的重要課題?；谔烊换钚孕》肿涌梢蕴剿鞑l(fā)現(xiàn)很多結(jié)構(gòu)和功能獨特的藥物靶標蛋白，從而為后續(xù)基于靶標蛋白結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新藥物設(shè)計提供關(guān)鍵的理論信息指導。由于天然活性小分子的結(jié)構(gòu)十分多樣，因此在進行靶標識別的過程中無法采用固定的一種方法，一般是綜合考慮各種因素，比如：分子結(jié)構(gòu)的新穎性分子的化學可修飾性分子溶解性生物活性大小等多種指標，選取一種最為合適的方法因此本文也對前述的幾種方法的優(yōu)劣進行了綜合比較，見表1。

天然活性小分子的靶標識別可以為后續(xù)深入探索這些小分子與靶標蛋白的相互作用方式作用位點，以及分子機制研究提供關(guān)鍵性的指導信息，避免以往盲目地僅針對少數(shù)經(jīng)典疾病信號通路開展藥理研究的弊病。真正做到對活性小分子量體裁衣、無偏向性的藥理機制研究。同時，由于細胞內(nèi)可與小分子作用的蛋白不止一個，因此也可以通過這些技術(shù)識別與小分子發(fā)生相互作用的多個蛋白，進而評估可能的藥物毒性靶標及副作用，進而全面了解藥物分子的藥理及毒理學機制總之，天然活性小分子的作用靶標識別是一項十分具有挑戰(zhàn)性的工作，相關(guān)研究技術(shù)較難掌握，需要研究者的經(jīng)驗較為豐富，希望今后能夠出現(xiàn)更多更加成熟且易于掌握的方法，從而使得該項研究能夠在更廣的范圍內(nèi)開展，大大推動天然藥物學及新藥研制的前進步伐。