石榴皮多糖硒酸酯制備工藝參數(shù)優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析

王占一，戴 博，張立華，王玉海，鄭丹丹，王 飛

（1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142）

石榴皮多糖硒酸酯制備工藝參數(shù)優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析

王占一1，戴 博2，張立華1，王玉海1，鄭丹丹1，王 飛1

（1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142）

以石榴皮多糖與亞硒酸鈉為原料制備石榴皮多糖硒酸酯，以產(chǎn)物硒含量和收率為指標(biāo)，原料配比、硝酸體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為單因素，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：石榴皮多糖硒酸酯最佳制備工藝條件為原料配比1∶1.0（g/g）、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.61%、反應(yīng)溫度77.0 ℃、反應(yīng)時(shí)間11.3 h，在該工藝條件下，制得石榴皮多糖硒酸酯中硒含量為4.48 mg/g，產(chǎn)物收率為41.87%；紫外光譜、紅外光譜和熱重分析充分證實(shí)石榴皮多糖硒酸酯中含有Se=O鍵、Se—O鍵和Se—C鍵。優(yōu)化后的石榴皮多糖硒酸酯制備工藝條件實(shí)現(xiàn)了石榴皮多糖的硒化，為石榴皮資源的充分開發(fā)利用提供良好條件。

石榴皮多糖；亞硒酸鈉；多糖硒酸酯；紫外光譜；紅外光譜；熱重分析

石榴（Punica granatum L.）又名金罌、天漿，其干燥果皮入藥稱為石榴皮，是一種傳統(tǒng)中藥材，為2010版《中國(guó)藥典》（一部）收載品種[1]。研究[2-4]表明，石榴皮所具有的抗惡性腫瘤、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等功能均與其所含的多糖類和多酚類成分有關(guān)。硒是生命體不可缺少的重要微量元素，適當(dāng)補(bǔ)硒具有提高人體非特異性免疫能力、延緩衰老、抗惡性腫瘤等多種生物學(xué)功能[5]。硒在自然界中通常以無機(jī)硒和有機(jī)硒2 種形式存在，與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒不但毒性小，而且其生物活性及生物利用度更高。有機(jī)硒通常以硒多糖、硒蛋白和硒核酸等形式存在，其中硒多糖，即多糖硒酸酯是元素硒與多糖通過酯鍵結(jié)合的化合物，在人體內(nèi)能發(fā)揮元素硒與多糖雙重生理活性，是理想的補(bǔ)硒產(chǎn)品[6-7]。然而，天然存在的多糖硒酸酯數(shù)量很少，使得該類產(chǎn)品的開發(fā)利用受到限制。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者致力于多糖硒酸酯的制備、理化性質(zhì)及生物活性方面的研究[8-13]。楊晶晶等[14]采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化紅景天多糖硒酸酯的制備工藝，并對(duì)產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行了研究，紅外光譜顯示，紅景天多糖與硒元素通過酯鍵結(jié)合，產(chǎn)物穩(wěn)定性高；葛明明等[15]對(duì)蒲公英多糖硒酸酯的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)硒含量進(jìn)行了測(cè)定，紅外光譜及差示掃描量熱分析顯示，蒲公英多糖硒酸酯產(chǎn)物中含有Se=O鍵和Se—C鍵，實(shí)現(xiàn)了蒲公英多糖的硒化，硒含量較高。但是，有關(guān)石榴皮多糖硒酸酯的制備及其結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域的研究，國(guó)內(nèi)還鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以石榴皮多糖和亞硒酸鈉為原料，硝酸為催化劑，制備了石榴皮多糖硒酸酯，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了合成工藝條件，并對(duì)合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，為石榴皮多糖硒酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴皮多糖（多次純化所得均一多糖） 棗莊學(xué)院生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心；硒粉標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.99%） 河南華宇化工原料有限公司；硝酸、亞硒酸鈉、無水乙醇、鹽酸、甲苯、高氯酸、硫酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；抗壞血酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二胺鹽酸鹽 天津市福晨化學(xué)試劑廠；以上試劑純度均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IRPrestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀、UV-2450型紫外光譜儀 日本島津公司；DE26300型綜合熱分析儀 美國(guó)鉑金埃爾默公司；TF-SFD-5型真空冷凍干燥機(jī) 上海拓紛制冷設(shè)備有限公司；JA5003B型電子分析天平 上海精科儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司；8000 dol透析袋 北京陽光斯德生物技術(shù)發(fā)展公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴皮多糖硒酸酯的制備工藝

以石榴皮多糖結(jié)構(gòu)中的單糖葡萄糖為例，在反應(yīng)過程中，由于6-位羥基較活潑，而且空間位阻較小，因此可與亞硒酸根脫水縮合成酯[16]。

精密稱取1.0 g石榴皮多糖置于三口燒瓶中，加入規(guī)定質(zhì)量的硝酸溶液100 mL，使硝酸濃度達(dá)到設(shè)定值，加熱攪拌使固形物全部溶解，得到10 mg/mL的石榴皮多糖溶液。按照設(shè)定質(zhì)量比例加入亞硒酸鈉，調(diào)節(jié)水浴溫度至設(shè)定值，恒溫反應(yīng)至設(shè)定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液冷卻至室溫，抽濾，離心除去沉淀，所得溶液經(jīng)對(duì)流水透析，以除去酸根及未反應(yīng)的鹽類，取透析液少量加入抗壞血酸檢測(cè)，直至無血紅色現(xiàn)象時(shí)停止透析。減壓濃縮至稠膏狀，由于多糖硒酸酯類成分易溶于極性較大的水中，而在高濃度乙醇中會(huì)沉淀，因此，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%，置于4 ℃條件下過夜，離心得到固形物，用無水乙醇洗滌3 次，真空干燥，得石榴皮多糖硒酸酯[14,16]。

1.3.2 石榴皮多糖硒酸酯中硒含量測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的硒粉50 mg置于50 mL燒杯中，加硝酸消化至溶液澄清后，以重蒸餾水定容至50 mL，備用。精密量取備用液1 mL，置于250 mL容量瓶中，以重蒸餾水定容，得硒對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度4 μg/mL）。精確量取硒對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，加重蒸餾水25 mL，以體積分?jǐn)?shù)0.5%稀鹽酸調(diào)pH 2，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鄰苯二胺鹽酸鹽試液2 mL，分別置于100 mL分液漏斗中，充分振搖，靜置2 h，加入甲苯9.5 mL，萃取，靜置，分取甲苯層，定容至10 mL。利用紫外-可見光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)334 nm處測(cè)定吸光度（A），以系列質(zhì)量濃度（C）作為橫坐標(biāo)，A作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14,17]，求得回歸方程為：A=0.183 2C+0.051 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，硒在0～4.8 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度A之間線性關(guān)系良好。

1.3.2.2 樣品硒含量的測(cè)定

精密稱取石榴皮多糖和石榴皮多糖硒酸酯各20 mg，分別置于50 mL錐形瓶中，加入混酸（高氯酸-硫酸-硝酸（1∶1∶4，V/V），以濃酸為基準(zhǔn)）3 mL消化至溶液澄清后，將錐形瓶置于95 ℃水浴鍋中靜置2 h，冷卻至室溫，加重蒸餾水25 mL，按照1.3.2.1節(jié)方法測(cè)定吸光度A，計(jì)算產(chǎn)物硒含量并按下式計(jì)算收率[15]。

式中：m1為石榴皮多糖硒酸酯的質(zhì)量/mg；m2為石榴皮多糖的質(zhì)量/mg。

1.3.3 石榴皮多糖硒酸酯制備工藝參數(shù)優(yōu)化

單因素試驗(yàn)中，考察原料配比（1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4，g/g）、硝酸體積分?jǐn)?shù)（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、反應(yīng)溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）和反應(yīng)時(shí)間（4、6、8、10、12、14 h）對(duì)石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量和產(chǎn)物收率的影響，每組分別作3 個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果采用±s表示。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以原料配比、硝酸體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為自變量，并依次編碼為X1、X2、X3、X4，以3 個(gè)平行試驗(yàn)中產(chǎn)物硒含量（Y1）和產(chǎn)物收率（Y2）的平均值作為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行制備工藝條件的優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Actual and coded levels for the factors tested in response surface dessiiggnn

1.3.4 石榴皮多糖硒酸酯結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 紫外光譜分析

稱取石榴皮多糖硒酸酯和石榴皮多糖各20 mg，分別置于50 mL小燒杯中，加入混酸3 mL消化至無色，置于95 ℃水浴鍋中保溫2 h，取出后冷卻至室溫，加重蒸餾水25 mL，按照1.3.2.1節(jié)方法處理后，應(yīng)用UV-2450型紫外光譜儀，在波長(zhǎng)300～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，分析產(chǎn)物的特征基團(tuán)[18-19]。

1.3.4.2 紅外光譜分析

稱取石榴皮多糖硒酸酯和石榴皮多糖各10 mg，加入預(yù)先處理好的干燥溴化鉀，攪拌均勻，在瑪瑙研缽中研磨壓片，應(yīng)用IRPrestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，分析產(chǎn)物的特征基團(tuán)[16,19]。

1.3.4.3 差熱分析

稱取石榴皮多糖硒酸酯和石榴皮多糖各10 mg，適當(dāng)處理后，應(yīng)用DE26300型綜合熱分析儀進(jìn)行熱重掃描，比較二者結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。升溫范圍為25～700 ℃，控制升溫速率10 ℃/min，氣氛為靜態(tài)氮?dú)?，參比物為AlO[18-19]。23

1.4 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，圖形制作采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮多糖硒酸酯制備工藝參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 原料配比對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響

固定硝酸體積分?jǐn)?shù)0.6%、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間10 h，考察在不同原料配比條件下，石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率，結(jié)果見圖1。

圖1 原料配比對(duì)硒含量及收率的影響Fig. 1 Effects of ratio between two substrates on the Se contents and yields of polysaccharide selenate

由圖1可知，石榴皮多糖和亞硒酸鈉的質(zhì)量比從1∶0.4到1∶1.0過程中，產(chǎn)物硒含量及收率隨亞硒酸鈉量的增加而呈增大趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1∶1.0時(shí)，硒含量及收率達(dá)到最高；而后，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量的增加，產(chǎn)物硒含量及收率反而降低。因此選擇原料配比為1∶1.0。

2.1.1.2 硝酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響

固定原料配比1∶1.0、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間10 h，考察不同的硝酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 硝酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)硒含量及收率的影響Fig. 2 Effects of fi nal HNO3concentration on the Se content and yield of polysaccharide selenate

由圖2可知，硝酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響較大，隨著硝酸體積分?jǐn)?shù)的增加，產(chǎn)物硒含量及收率隨之增加，硝酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.6%時(shí)，硒含量及收率達(dá)到最大值；但是，當(dāng)硝酸體積分?jǐn)?shù)超過0.6%后，硒含量及收率呈下降趨勢(shì)，這可能與在較大體積分?jǐn)?shù)硝酸存在下，多糖的羥基被氧化或者糖鏈斷裂等因素有關(guān)。因此選擇硝酸體積分?jǐn)?shù)為0.6%。

2.1.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響

固定原料配比1∶1.0、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.6%、反應(yīng)時(shí)間10 h，考察不同的反應(yīng)溫度對(duì)石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)硒含量及收率的影響Fig. 3 Effects of reaction temperature on the Se content and yield of polysaccharide selenate

由圖3可知，反應(yīng)溫度在60～80 ℃之間時(shí)，石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率均居于較高水平，溫度較低時(shí)，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物硒含量及收率較低；溫度較高，在硝酸的氧化條件下，多糖的羥基會(huì)被加速氧化變質(zhì)，同時(shí)會(huì)影響有機(jī)硒的穩(wěn)定性，產(chǎn)物硒含量及收率下降，因此，反應(yīng)溫度應(yīng)該控制在70 ℃左右。

2.1.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響

固定原料配比1∶1.0、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.6%、反應(yīng)溫度70 ℃，考察不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)硒含量及收率的影響Fig. 4 Effects of reaction time on the Se content and yield of polysaccharide selenate

由圖4可知，石榴皮多糖硒酸酯的硒含量及收率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10 h時(shí)，產(chǎn)物硒含量及收率達(dá)到最大值，而后硒含量及收率呈下降趨勢(shì)，可能是反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)多糖降解，導(dǎo)致產(chǎn)物硒含量及收率降低。因此，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該控制在10 h左右。

2.1.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及顯著性分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以原料配比、硝酸體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為響應(yīng)變量，并依次編碼為X1、X2、X3、X4，以3 次平行試驗(yàn)中石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量（Y1）和產(chǎn)物收率（Y2）的平均值作為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行制備工藝條件的優(yōu)化[20-22]。試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental desiiggnn

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到石榴皮多糖硒酸酯中硒含量（Y1）和產(chǎn)物收率（Y2）對(duì)響應(yīng)變量X1、X2、X3、X4的回歸方程為：

式（1）回歸模型的決定系數(shù)R2=0.945 2，P＜0.0001，說明模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.140 9，影響不顯著，說明該方程擬合良好；式（2）回歸模型的決定系數(shù)R2=0.949 0，P＜0.000 1，說明模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.158 7，影響不顯著，說明該方程擬合良好[22-23]。因此，可以應(yīng)用式（1）和式（2）兩個(gè)方程描述各響應(yīng)變量與兩個(gè)響應(yīng)值之間的關(guān)系，以評(píng)價(jià)各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性。

表3 二次回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可以看出，響應(yīng)值為硒含量的模型，各響應(yīng)因素影響程度依次為：X3＞X1＞X4＞X2，反應(yīng)溫度對(duì)于產(chǎn)物硒含量的影響最大；響應(yīng)值為產(chǎn)物收率的模型，各響應(yīng)因素影響程度依次為：X4＞X2＞X3＞X1，反應(yīng)時(shí)間對(duì)于產(chǎn)物收率的影響最大。

2.1.3 各因素交互效應(yīng)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制兩兩因素之間交互影響的響應(yīng)面圖[23-24]，見圖5。響應(yīng)面為平滑的曲面，且開口向下，說明在響應(yīng)曲面上存在最大響應(yīng)值，且最佳工藝條件就在所設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi)，在此重點(diǎn)考察對(duì)響應(yīng)值影響顯著的交互效應(yīng)。響應(yīng)值為硒含量的模型，影響因素之間，X1與X4交互作用極其顯著（P＜0.01），表現(xiàn)為馬鞍形，曲線比較陡峭；X2與X4、X3與X4之間交互作用較顯著（P＜0.05）。響應(yīng)值為產(chǎn)物收率的模型，影響因素之間，X1與X3交互作用極其顯著（P＜0.01），響應(yīng)曲線比較陡峭；X2與X3、X3與X4之間交互作用較顯著（P＜0.05）。

圖5 兩因素交互影響響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and corresponding contour plots showing the interactive effects of two factors

2.1.4 最佳制備工藝條件的確定及驗(yàn)證

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行工藝參數(shù)最優(yōu)化搜索[20,23]，得到石榴皮多糖硒酸酯的最佳制備工藝條件為原料配比1∶1.022、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.612%、反應(yīng)溫度77.1 ℃、反應(yīng)時(shí)間11.32 h，石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量的模型預(yù)測(cè)值為4.496 mg/g，產(chǎn)物收率的模型預(yù)測(cè)值為42.093%。為了檢驗(yàn)工藝參數(shù)的準(zhǔn)確性，根據(jù)上述試驗(yàn)條件進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此過程充分考慮實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)實(shí)操作情況，將工藝參數(shù)修正為原料配比1∶1.0、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.61%、反應(yīng)溫度77.0 ℃、反應(yīng)時(shí)間11.3 h，測(cè)得石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量為4.48 mg/g，產(chǎn)物收率為41.87%，偏差均小于1%，硒酸化后石榴皮多糖樣品中的結(jié)合硒含量明顯提高，說明應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳工藝參數(shù)具有可靠性。

2.2 石榴皮多糖硒酸酯的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 紫外光譜分析

圖6 石榴皮多糖和石榴皮多糖硒酸酯的紫外光譜Fig. 6 UV spectra of pomegranate rind polysaccharide and pomegranate rind polysaccharide selenate

由圖6可知，石榴皮多糖在波長(zhǎng)300～400 nm范圍內(nèi)，沒有明顯的吸收峰；而石榴皮多糖硒酸酯在波長(zhǎng)334 nm處具有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，與文獻(xiàn)[25]報(bào)道硒在波長(zhǎng)334 nm處所引起的吸收峰峰位吻合，表明硒酸化的石榴皮多糖中含有硒元素。

2.2.2 紅外光譜分析

圖7 石榴皮多糖和石榴皮多糖硒酸酯的紅外光譜Fig. 7 IR spectra of pomegranate rind polysaccharide and pomegranate rind polysaccharide selenate

圖7 中1為石榴皮多糖的特征吸收峰，在3 416.42 cm-1處出現(xiàn)明顯寬峰，為O—H的伸縮振動(dòng)峰；在1 615.69 cm-1處出現(xiàn)多糖C=O伸縮振動(dòng)峰；在1 139.04～1 025.33 cm-1處出現(xiàn)多糖2 種C—O伸縮振動(dòng)峰。2為石榴皮多糖硒酸酯的特征吸收峰，吸收峰的波形、吸收強(qiáng)度和峰寬等指標(biāo)與未修飾的石榴皮多糖基本相同，說明修飾產(chǎn)物本身的結(jié)構(gòu)沒有遭到破壞，保持了石榴皮多糖原有的性質(zhì)。不同的是，石榴皮多糖硒酸酯紅外光譜在948.23、894.65 cm-1及762.30 cm-1處顯示了3 個(gè)明顯的特征吸收峰，948.23 cm-1處的吸收峰歸屬為Se=O伸縮振動(dòng)峰；894.65 cm-1處的吸收峰歸屬為C－Se伸縮振動(dòng)峰；762.30 cm-1處的吸收峰歸屬為Se－O伸縮振動(dòng)峰，證明了亞硒酸鈉已經(jīng)與石榴皮多糖結(jié)合成酯[16,19]。

2.2.3 差熱分析

圖8 石榴皮多糖和石榴皮多糖硒酸酯的熱分析圖譜Fig. 8 TGA of pomegranate rind polysaccharide and pomegranate rind polysaccharide selenate

圖8為石榴皮多糖及其硒酸酯在氮?dú)鈼l件下的熱分析結(jié)果，由圖8a可知，2 種物質(zhì)的形態(tài)大致相同，第一階段質(zhì)量損失峰均為失去吸附水，石榴皮多糖28.8～225.4 ℃內(nèi)質(zhì)量損失率為13.7%，石榴皮多糖硒酸酯30.6～238.5 ℃內(nèi)質(zhì)量損失率為14.1%；隨著溫度的上升，石榴皮多糖及其硒酸酯在240～420 ℃內(nèi)出現(xiàn)快速質(zhì)量損失現(xiàn)象，石榴皮多糖硒酸酯的質(zhì)量損失峰形更加陡峭，石榴皮多糖在溫度225.4～327.9 ℃內(nèi)質(zhì)量損失率為46.5%，在400～600 ℃內(nèi)質(zhì)量損失率為14.8%；而石榴皮多糖硒酸酯238.5～420.3 ℃內(nèi)質(zhì)量損失率為67.9%，在600 ℃前已經(jīng)基本分解完全，產(chǎn)物的穩(wěn)定性低于未修飾前，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致。原因可能是，石榴皮多糖硒酸酯分子中引入亞硝酸基，改變了石榴皮多糖固有的分子結(jié)構(gòu)，亞硝酸基的存在，使得產(chǎn)物在較高溫度條件下更容易脫水裂解，從而使得產(chǎn)物穩(wěn)定性降低。由圖8b可知，在氮?dú)猸h(huán)境中，石榴皮多糖及其硒酸酯的質(zhì)量損失過程均為放熱反應(yīng)，沒有明顯的氧化過程，均為熱裂解反應(yīng)[18-19]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以石榴皮多糖與亞硒酸鈉為原料制備石榴皮多糖硒酸酯，以制備后的產(chǎn)物硒含量和產(chǎn)物收率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化了制備過程中的原料配比、硝酸體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間4 個(gè)試驗(yàn)因素。結(jié)果顯示，影響產(chǎn)物硒含量的各因素主次順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度＞原料配比＞反應(yīng)時(shí)間＞硝酸體積分?jǐn)?shù)，反應(yīng)溫度對(duì)于產(chǎn)物硒含量的影響最大；影響產(chǎn)物收率的各因素主次順序?yàn)椋悍磻?yīng)時(shí)間＞硝酸體積分?jǐn)?shù)＞反應(yīng)溫度＞原料配比，反應(yīng)時(shí)間對(duì)于產(chǎn)物收率的影響最大。最佳制備工藝條件為原料配比1∶1.0、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.61%、反應(yīng)溫度77.0 ℃、反應(yīng)時(shí)間11.3 h，該工藝條件下，制得的石榴皮多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量為4.48 mg/g，產(chǎn)物收率為41.87%。

紫外光譜分析顯示，產(chǎn)物在波長(zhǎng)334 nm處具有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，該吸收峰由于硒酸化的石榴皮多糖中含有硒元素引起；紅外光譜分析顯示，制備后的石榴皮多糖硒酸酯在948.23、894.65 cm-1及762.30 cm-1處具有3 個(gè)明顯的特征吸收峰，證明了產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有Se=O鍵、Se—O鍵和Se—C鍵，亞硒酸鈉已經(jīng)與石榴皮多糖結(jié)合成酯；熱分析顯示，由于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中亞硝酸基的存在，使產(chǎn)物在較高溫度條件下更容易脫水裂解，穩(wěn)定性降低。

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Optimized Preparation and Structural Analysis of Polysaccharide Selenate from Pomegranate Rind

WANG Zhanyi1, DAI Bo2, ZHANG Lihua1, WANG Yuhai1, ZHENG Dandan1, WANG Fei1(1. College of Life Sciences, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China; 2. Department of Pharmacology, General Hospital of Air Force, People’s Liberation Army of China, Beijing 100142, China)

In this paper, polysaccharide selenate was prepared via the reaction between pomegranate rind polysaccharide and sodium selenite. Four reaction conditions including ratio between the substrates, final HNO3concentration, reaction temperature and time were optimized based on the selenium (Se) content and yield of product using single factor experiments and Box-Behnken experimental design. At the same time, the structure of the obtained product was analyzed. Results showed that the optimum reaction conditions for preparing polysaccharide selenate were established as follows: ratio between pomegranate rind polysaccharide and sodium selenite, 1:1.0 (g/g); fi nal HNO3concentration, 0.61%; temperature, 77.0 ℃; and time, 11.3 h. Under these conditions, the Se content and yield of polysaccharide ester selenate were 4.48 mg/g and 41.87%, respectively. Ultraviolet spectroscopic (UV), infrared spectroscopic (IR) and thermogravimetric analyses (TGA) fully confi rmed that the polysaccharide ester selenate contained Se=O, Se－O and Se－C. The selenization of pomegranate rind polysaccharide under the optimized reaction conditions can create a good condition for the full development and utilization of pomegranate rind resources.

pomegranate rind polysaccharide; sodium selenite; polysaccharide selenate; ultraviolet spectroscopy; infrared spectroscopy; thermogravimetric analysis

10.7506/spkx1002-6630-201610008

284.2

A

1002-6630（2016）10-0040-07

王占一, 戴博, 張立華, 等. 石榴皮多糖硒酸酯制備工藝參數(shù)優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 40-46. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610008. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhanyi, DAI Bo, ZHANG Lihua, et al. Optimized preparation and structural analysis of polysaccharide selenate from pomegranate rind[J]. Food Science, 2016, 37(10): 40-46. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610008. http://www.spkx.net.cn

2015-09-27

2012年度國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2012GA740049）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013BL018）

王占一（1980―），男，講師，碩士，主要從事天然藥物活性成分提取與分離研究。E-mail：zhyiwang@126.com