采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控及其保鮮作用

張 承，李 明*，龍友華,2，吳小毛,2

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550025）

采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控及其保鮮作用

張 承1，李 明2,*，龍友華1,2，吳小毛1,2

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550025）

以‘貴長’獼猴桃為試材，通過病原菌分離、致病性測定和DNA測序鑒定了修文縣獼猴桃軟腐病病原菌，并選用殼聚糖、鈣鹽和糊精分別與茶多酚、甘氨酸、檸檬酸、抗菌肽混合制備和篩選了復(fù)合膜劑，研究了采前幼果期和壯果末期果面噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控及其保鮮作用。結(jié)果表明，修文縣獼猴桃軟腐病病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）；采前噴施不同殼聚糖復(fù)合膜對其軟腐病的防效均達(dá)60%以上（添加茶多酚防效86.54%、甘氨酸防效61.54%、檸檬酸防效71.15%、抗菌肽防效69.23%），顯著降低丙二醛（MDA）積累，提高果實的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性，誘導(dǎo)增強果實的抗病性。同時，該復(fù)合膜能有效地增加果實單果質(zhì)量和體積，顯著提高果實VC、可溶性固形物、可溶性總糖、可滴定酸、葉綠素和蛋白質(zhì)的含量，促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)量的增加和品質(zhì)的改善。此外，施用該復(fù)合膜還能有效提高和維持果實硬度、降低果實呼吸強度以及果實質(zhì)量損失率和營養(yǎng)物質(zhì)的損失，明顯抑制果實可溶性固形物和可溶性總糖含量的上升速率和延緩組織的衰老軟化，從而提高了獼猴桃耐貯性。研究結(jié)果為獼猴桃優(yōu)質(zhì)栽培、病害有機防控和果實綠色保鮮提供了科學(xué)依據(jù)和新途徑。

獼猴桃；殼聚糖；鈣；軟腐??；貯藏；品質(zhì)

獼猴桃（Actinidia）作為新興的經(jīng)濟林樹種之一，21世紀(jì)以來我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展，產(chǎn)量和種植面積均已位居世界第一?！F長’獼猴桃（Actinidia deliciosa cv. Guichang）系美味獼猴桃中的優(yōu)良品種，貴州修文縣于1989年開始引種，現(xiàn)已發(fā)展成貴州省特色精品水果之一和當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)[1]。近年來，由病原真菌侵染造成的果實采后腐爛逐漸加重，如軟腐病、蒂腐病等；加之我國果蔬保鮮技術(shù)的相對落后，使得潛伏或者后期感染的病原真菌極易造成果實在貯藏過程中大規(guī)模的病害發(fā)生[2]。據(jù)統(tǒng)計，2014年貴州修文縣獼猴桃采后病害嚴(yán)重發(fā)生，損失率達(dá)40%以上，給當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)和果農(nóng)造成重大的經(jīng)濟損失。

大多數(shù)學(xué)者均贊同獼猴桃軟腐病是由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）混合侵染，而現(xiàn)有的防治手段主要為化學(xué)防治[3-6]。當(dāng)前，獼猴桃貯藏保鮮技術(shù)主要集中在農(nóng)藝栽培[7]、生物[8]、物理[9]、化學(xué)[10-11]等貯藏技術(shù)上。殼聚糖因其良好的成膜性、抑菌性和保鮮特性，在果蔬貯藏保鮮領(lǐng)域應(yīng)用廣闊，且其高效的抑制病原微生物繁殖和生長、誘導(dǎo)果實抗病性亦成為國內(nèi)外研究的熱點問題之一[12]。作為植物所必需的大量元素，Ca2+在提高果實抗病性、貯藏性等方面發(fā)揮著積極的作用[13-14]。殼聚糖涂膜和鈣營養(yǎng)采前處理應(yīng)用于獼猴桃貯藏保鮮已有報道[15-16]，但就殼聚糖和鈣營養(yǎng)配合抗菌物質(zhì)和成膜劑（糊精）采前處理獼猴桃鮮見報道。本研究于獼猴桃采前軟腐病病原菌侵染前期（幼果期，花后2 周內(nèi)）和壯果末期在果實表面噴施天然的殼聚糖復(fù)合膜，旨在探索建立獼猴桃的病害防控和保鮮的新方法，實現(xiàn)既防病又改善品質(zhì)、保鮮的目的，以期為獼猴桃優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)、病害防控和貯藏保鮮提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

試驗地位于貴州修文縣谷堡鄉(xiāng)紅星村貴州頂好果業(yè)有限公司獼猴桃園（26°49′02.2″N，106°28′23.6″E），平均海拔為1 276 m，亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，年平均氣溫為16 ℃，年降雨量達(dá)1 293 mm，水熱同期。供試果園土壤類型為黃棕壤，實驗前在果園內(nèi)隨機、多點混合采集深0～60 cm的土樣測試?yán)砘再|(zhì)，其結(jié)果為：pH 5.86、全氮含量1.44 g/kg、有機質(zhì)含量29.56 g/kg、堿解氮含量98.76 mg/kg、有效磷含量4.43 mg/kg、有效鉀含量3.47 mg/kg、有效鐵含量49.31 mg/kg。

獼猴桃品種‘貴長’，樹齡20 a，每畝種植74 株，其中雌株68 株，樹勢整齊一致，管理水平按獼猴桃無公害栽培技術(shù)進(jìn)行；2014年果實軟腐病發(fā)生為偏重。

供試病果：2014—2015分別取自貴州省修文縣谷堡鄉(xiāng)、龍場鎮(zhèn)、扎佐鎮(zhèn)、久長鎮(zhèn)等獼猴桃產(chǎn)區(qū)。

1.2 試劑與儀器

水溶性殼聚糖（脫乙酰度≥95%） 河南華瑞生物工程有限公司；糊精 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝酸鈣 成都金山化學(xué)試劑有限公司；茶多酚合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；甘氨酸 北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸 江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；抗菌肽 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

HJ-6多頭磁力加熱攪拌器 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；GY-4數(shù)顯式果實硬度計 樂清市艾德堡儀器有限公司；PAL-1型折光儀 北京陽光億事達(dá)貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 修文縣獼猴桃軟腐病病原菌分離鑒定

病原菌分離：采用組織分離法分離病原菌，將果

實病斑及四周表面用75%酒精擦拭并在酒精燈上來回火焰消毒刀片和鑷子，用消毒好的刀片削去病斑果皮及外層組織，再用消毒過的鑷子挑取病斑組織用75%酒精浸泡5 s，然后用無菌水清洗3 次，置于無菌的濾紙上晾干。再移入含硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后作菌落純化培養(yǎng)。純化后的菌株用斜面保存待用。

病原菌致病性測定：按照柯赫氏法則將得到的病菌進(jìn)行回接驗證。取健康果實，先用清水洗凈，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡30 min后晾干，在果實赤道部位標(biāo)記接種點，備用；再將病原菌純培后第1代培養(yǎng)5 d的PDA平板菌落用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，分刺傷（用消毒火燒過的注射器針頭于接種點刺破10 個孔，孔眼集中在一起使直徑約5 mm）和不刺傷2 種方式進(jìn)行接種，將菌餅的菌絲面緊貼于接種點上。接種完后置于溫度28 ℃、相對濕度約為75%條件下進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察發(fā)病情況，顯癥后再次分離鑒定，完成柯赫氏法則驗證。

病原菌的rDNA-ITS序列分析：將病原菌純培后第1代培養(yǎng)5 d的PDA平板直接送上海生物工程有限公司進(jìn)行鑒定測序，測序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行分析及同源性比對。

1.3.2 殼聚糖復(fù)合膜的配制

取蒸餾水于燒杯中，再向燒杯中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%糊精置于多頭磁力加熱攪拌器上加熱磁力攪拌10 min，后停止加熱；再向糊精溶液中依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%殼聚糖、1.5%硝酸鈣、1.0%抑菌物質(zhì)（茶多酚組編號MJ1、甘氨酸組編號MJ2、檸檬酸組編號MJ3、抗菌肽組編號MJ4），磁力攪拌12 h后裝于滅菌后的瓶中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 田間試驗設(shè)計

試驗采取隨機區(qū)組設(shè)計，并采用在獼猴桃生育期采用噴施殼聚糖復(fù)合膜于果實表面的方式。設(shè)果實表面各噴施30 倍液的MJ1、MJ2、MJ3和MJ4 4 個膜劑處理，以果實表面噴施清水為對照（CK），共5 個處理，每處理5 棵樹，重復(fù)4 次，共20 個小區(qū)，周圍設(shè)保護(hù)行。試驗采用靜電噴霧器噴施膜劑，第1次噴施時間為2015 年5月20日（幼果期，5月8日授粉結(jié)束），每棵樹用液1 000 mL；第2次噴施時間為8月7日（壯果末期，淀粉迅速積累），每棵樹用液1 500 mL；采收時間為10月1日。試驗期間天氣均以晴為主，間或多云，噴施后3～4 d內(nèi)無降雨過程。

1.3.4 指標(biāo)測定

獼猴桃采收后，根據(jù)1.3.3節(jié)4 個處理組和對照共5 組，每組4 次重復(fù)，每個重復(fù)再設(shè)置2 組，每組50 個果，置于常溫（25±1）℃條件下貯藏。第1組用于測定果實品質(zhì)、抗性相關(guān)物質(zhì)、呼吸強度及硬度等；第2組用于質(zhì)量損失率和果實軟腐病發(fā)病情況調(diào)查。

1.3.4.1 軟腐病防控指標(biāo)測定

果實軟腐病發(fā)病情況調(diào)查：于果實開始軟化每2 d調(diào)查果實發(fā)病情況，按公式（1）～（3）統(tǒng)計累計發(fā)病率、病情指數(shù)及防效。

病害嚴(yán)重性分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級：未發(fā)??；1級：病斑累計直徑小于1 cm；2級：病斑累計直徑在l～2 cm；3級：病斑累計直徑在2～3 cm；4級：病斑累計直徑在3～4 cm；5級：病斑累計直徑在4～5 cm；6級：病斑累計直徑大于5 cm。

1.3.4.2 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和抗氧化酶活性測定

MDA含量：采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性：采用氮藍(lán)四唑光還原法測定；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性：采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性：采用紫外吸收法測定[17]。

1.3.4.3 果實品質(zhì)指標(biāo)測定

果實單果質(zhì)量、橫徑、縱徑、側(cè)徑：每個重復(fù)隨機測定20 個果后取平均值，計算果形指數(shù)，并利用旋轉(zhuǎn)橢球體積公式計算獼猴桃近似體積。

果品品質(zhì)測定方法[18]：可溶性總糖含量：采用硫酸-蒽酮比色法測定；VC含量：采用2,6-二氯靛酚法測定；可滴定酸含量：采用酸堿滴定法測定；可溶性固形物含量：采用PAL-1型折光儀測定；葉綠素含量：采用乙醇提取紫外分光光度計法測定；蛋白質(zhì)含量：采用紫外吸收法測定。1.3.5 貯藏保鮮指標(biāo)測定

呼吸強度：采用堿吸收法測定；硬度：采用GY-4數(shù)顯式果實硬度計測定；質(zhì)量損失率：采用稱重法測定，見式（4）：

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)（均為4 次重復(fù)）采用Excel 2003和SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃果實抗病性的影響

2.1.1 修文縣獼猴桃軟腐病的病原菌鑒定

對修文縣獼猴桃主產(chǎn)區(qū)軟腐病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，軟腐病主要發(fā)生在收獲和貯運期，病斑初期呈淺褐色，微微凹陷，表皮不破裂，易于果肉分離；病部果肉呈淡黃色，病斑邊緣暗綠色暈環(huán)帶，數(shù)天內(nèi)可擴展至整個果實腐爛，且后期病部會產(chǎn)生白色菌絲體（圖1A）。從果實病部組織中共分得6 株菌株，編號為RF-1～RF-6；對6 株菌株采用刺傷和不刺傷進(jìn)行致病性檢測，發(fā)現(xiàn)RF-1和RF-2具有較強致病力。RF-1：菌落初期白色，后從中央開始轉(zhuǎn)為墨綠色，再轉(zhuǎn)為黑色，邊緣不整齊，經(jīng)72 h生長菌落直徑達(dá)90 mm（圖1B）。RF-2：菌落白色，絮狀生長，背面中央淺黃色，邊緣較整齊菌落，經(jīng)72 h生長菌落直徑達(dá) 72 mm（圖1C）。用刺傷法將純化的RF-1和RF-2菌株回接到健康獼猴桃果實上，接種6 d后開始發(fā)病，癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同（圖1D～G），且RF-1（病斑直徑較大）致病力高于RF-2。從發(fā)病果實上再分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，表明所分離到的病原菌是獼猴桃軟腐病的病原菌。

圖1 獼猴桃軟腐病病原菌的發(fā)病癥狀、菌落形態(tài)和致病性Fig.1 Soft rot symptoms, colony morphology and pathogenicity of the pathogens in kiwifruit

用真菌通用引物 ITS1/ITS4對致病性最強的菌株RF-1 和RF-2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增其rDNA-ITS序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，目的片段長度分別為523 bp和555 bp，將測序結(jié)果在NCBI上用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對，菌株RF-1與葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp. JQ260829.1、HQ730969.1）同源性達(dá)100%；菌株RF-2與擬莖點霉菌（Phomopsis sp. DQ145731.1、JQ809673.1）同源性達(dá)99%。根據(jù)同源性比對結(jié)果，將RF-1和RF-2分別鑒定為Botryosphaeria dothidea和Phomopsis sp.。

2.1.2 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控效果

表1 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對防控獼猴桃軟腐病的效果Table1 Effects of pre-harvest application of chitosan composite coatings on controlling soft rot of kiwifrui

由表1可知，不同殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病均具有良好的防控效果，貯藏22 d后對照果實平均發(fā)病率達(dá)44.44%，而各殼聚糖復(fù)合膜處理果實發(fā)病率均在20.22%以下。防控效果較好的為MJ1，防效達(dá)86.54%；其次為MJ3和MJ4，防控效果分別為71.15%和69.23%。

2.1.3 采取噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃采后果實MDA和抗氧化酶活性的影響

圖2 獼猴桃MDA含量（A）和SOD活性（B）變化Fig.2 Changes in MAD content and SOD activity of kiwifruit during storage

MDA含量累積能夠反映果實受到病原菌侵染后發(fā)生膜脂過氧化程度和膜結(jié)構(gòu)受損程度。圖2A表明，隨著貯藏期延長果實MDA含量呈上升趨勢，各貯藏期對照MDA積累量明顯高于不同殼聚糖復(fù)合膜處理；貯藏20 d后，對照MDA含量達(dá)1.49 nmol/g，與各膜劑處理差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可有效降低果實受病原菌侵染的程度和果實MDA積累，各膜劑處理效果相當(dāng)。

圖2B表明，貯藏期果實SOD活性變化呈先上升后下降的趨勢，各貯藏期對照SOD活性明顯低于不同殼聚糖復(fù)合膜處理；貯藏17 d后果實SOD活性達(dá)到峰值，各膜劑處理與對照之間差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可顯著增加獼猴桃果實SOD活性，提高獼猴桃抗病性，效果較好的為MJ3和MJ4。

圖3 獼猴桃CAT（A）和POD（B）活性變化Fig.3 Changes in CAT and POD activities of kiwifruit

圖3表明，貯藏期果實CAT和POD活性變化亦呈先上升后下降的趨勢。貯藏17 d后果實2種酶活性達(dá)到峰值，MJ2、MJ3和MJ4的果實CAT活性高于對照，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；各膜劑處理POD活性均高于對照，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜一定程度上可提高獼猴桃果實CAT和POD活性，增強獼猴桃抗病性，效果較好的為MJ3和MJ4。

2.2 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃品質(zhì)的影響

2.2.1 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃果實生長的影響生育期噴施殼聚糖復(fù)合膜處理對獼猴桃果實縱徑、橫徑、側(cè)徑和果形指數(shù)沒有顯著的影響，但可提高獼猴桃平均單果質(zhì)量和單果體積，效果較好的為MJ3和MJ4，與清水對照的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），見表2。表明殼聚糖復(fù)合膜在促進(jìn)獼猴桃產(chǎn)量形成和改善果實外觀品質(zhì)上具有良好的作用。

表2 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃果實生長的影響Table2 Effects of pre-harvest application of chitosan composite films on development of kiwifruit

2.2.2 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃內(nèi)在品質(zhì)的影響

表3 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table3 Effects of pre-harvest application of chitosan composite films on quality of kiwifruit

表3顯示，不同殼聚糖復(fù)合保護(hù)膜均能提高獼猴桃果實VC、可溶性固形物、可溶性總糖、可滴定酸、葉綠素和可溶性蛋白的含量。表明生育期果面噴施殼聚糖復(fù)合保護(hù)膜可較好地改善獼猴桃果實的食用品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，提高獼猴桃的商品價值。

2.2.3 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對采后果實品質(zhì)的影響

圖4表明，隨著貯藏期的延長，對照可溶性固形物和可溶性總糖含量不斷增加至19 d后到達(dá)峰值（13.00%和11.12%），隨后開始下降；殼聚糖復(fù)合膜處理果實可溶性固形物和可溶性總糖含量呈不斷上升趨勢，于貯藏22 d達(dá)到最大值，同比對照可溶性固形物和可溶性總糖含量有所提高，差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可提高果實可溶性固形物和可溶性總糖含量和抑制獼猴桃果實貯藏期可溶性固形物和可溶性總糖含量上升速率，間接地延長了獼猴桃貯藏期。

圖4 獼猴桃可溶性固形物（A）和可溶性總糖（B）含量變化Fig.4 Changes in soluble solid and total soluble sugar contents of kiwifruit

圖5 獼猴桃VC（A）和可滴定酸（B）含量變化Fig.5 Changes in vitamin Cand titratable acid contents of kiwifruit

圖5表明，貯藏期各處理獼猴桃VC和可滴定酸含量總體呈不斷下降的趨勢。不同殼聚糖復(fù)合膜處理各貯藏期的VC含量均比對照高，且VC含量損失均低于對照。貯藏期對照可滴定酸含量的下降趨勢明顯高于不同殼聚糖復(fù)合膜處理，其加速了獼猴桃的軟化進(jìn)程。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可提高果實VC含量和有效降低獼猴桃果實貯藏期VC和可滴定酸含量的損失，使得保持適宜的糖酸比進(jìn)而有利于獼猴桃的貯藏，效果較好的為MJ1。

圖6A顯示，隨著獼猴桃果實軟化衰老果實中葉綠素含量不斷降低，但不同殼聚糖復(fù)合膜處理各貯藏期的葉綠素含量均比對照高。圖6B表明，貯藏期獼猴桃果實蛋白質(zhì)含量呈波動變化的趨勢，但不同殼聚糖復(fù)合膜處理各貯藏期的可溶性蛋白含量亦均比對照高。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可提高果實葉綠素和可溶性蛋白含量，對獼猴桃貯藏期品質(zhì)維護(hù)具有一定的輔助作用，效果較好的為MJ1和MJ3。

圖6 獼猴桃葉綠素（A）和可溶性蛋白（B）含量變化Fig.6 Changes in chlorophyll and protein contents of kiwifruit

2.3 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對采后獼猴桃貯藏性的影響

2.3.1 對采后獼猴桃果實呼吸強度和硬度的影響

圖7 獼猴桃呼吸強度（A）和硬度（B）變化Fig.7 Changes in respiration rate and firmness of kiwifruit

從圖7A可以看出，隨著貯藏期的延長果實呼吸強度在不斷增強，在貯藏17 d后對照呼吸強度出現(xiàn)呼吸高峰，達(dá)0.116 1 mg CO2/（kg·h），隨后開始下降。不同殼聚糖復(fù)合膜處理果實呼吸強度在貯藏17 d后仍保持不斷上升趨勢，呼吸高峰的出現(xiàn)時間仍未出現(xiàn)。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可有效降低獼猴桃呼吸強度和延緩呼吸高峰的出現(xiàn)時間，提高獼猴桃貯藏性，效果較好的為MJ4。

圖7B表明，整個貯藏期內(nèi)果實硬度變化呈下降趨勢，初始測定和各貯藏期不同殼聚糖復(fù)合膜處理獼猴桃果實的硬度均高于對照；貯藏19 d后，不同殼聚糖復(fù)合膜處理獼猴桃果實硬度最低保持在8.37 kg/cm2，而對照為5.89 kg/cm2。且貯藏期對照果實硬度的下降趨勢明顯高于不同殼聚糖復(fù)合膜處理。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可有效地維持獼猴桃果實硬度，效果較好的為MJ3 和MJ4。

2.3.2 對采后獼猴桃果實質(zhì)量損失率的影響

圖8 獼猴桃質(zhì)量損失率變化Fig.8 Change in weight loss rate of kiwifruit

圖8表明，整個貯藏期內(nèi)果實質(zhì)量損失率變化呈不斷上升趨勢。貯藏12 d后，對照質(zhì)量損失率上升趨勢加劇，明顯高于不同殼聚糖復(fù)合膜處理。貯藏29 d后，對照質(zhì)量損失率達(dá)14.82%，與不同殼聚糖復(fù)合膜處理差異達(dá)極顯著水平。表明采前果面噴施殼聚糖復(fù)合膜可有效抑制果實水分蒸發(fā)和果實內(nèi)含物的降解，降低獼猴桃果實質(zhì)量損失率，各膜劑處理效果相當(dāng)。

3 討 論

大量研究表明，殼聚糖對多種果實采后病害具有防治效果，能夠降低果實的發(fā)病率和病情指數(shù)[19-23]，其主要是通過直接抑制病原菌的生長[12]、提高果實抗病性[20]和延緩果實衰老[12,24]等途徑發(fā)揮作用。而生長期噴鈣處理也能降低果實發(fā)病率和提高果實抗病性[25]，如在楊桃[26]、蘋果[27]、黃金梨[28]和月光李[29]等水果上均具有良好的效果。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃軟腐病是由Botryosphaeria dothidea和Phomopsis sp.混合侵染，其中又以Botryosphaeria dothidea占主導(dǎo)地位[2-5]；王井田等[4]表明軟腐病病原菌在謝花后的3 周左右開始侵染幼果，6 周左右侵染達(dá)到高峰。本研究通過病菌分離、病菌致病性測定和DNA測序鑒定，明確了引起修文縣獼猴桃軟腐病病原菌為Botryosphaeria dothidea和Phomopsis sp.，且Botryosphaeria dothidea的致病力大于Phomopsis sp.，這與前人報道一致。在軟腐病病原菌侵染前期（花后2 周內(nèi)）和壯果末期的果實表面噴施殼聚糖復(fù)合膜不但能顯著降低果實軟腐病的發(fā)病率，而且有效降低了果實MDA積累，提高了果實SOD、CAT和POD活性，這可能是殼聚糖和糊精良好的成膜性會使其在果實表面形成一層天然屏障，當(dāng)病原菌侵入至果實表面時就會遭受這層膜的防御作用從而減少其侵染的機會；同時，膜劑成分被果實吸入體內(nèi)參與了果實生理代謝作用，提高了相關(guān)抗性物質(zhì)的活性，降低了果實的發(fā)病率，從而提高了果實的抗病性。

殼聚糖可以激活、增強植株的生理生化機能，提高植物產(chǎn)量、品質(zhì)和貯藏性能[30-31]。劉金鳳[32]指出施用殼聚糖處理能分別提高櫻桃番茄16.2%～20.0%，且能改善其營養(yǎng)和外觀品質(zhì)；鄒良棟等[33]表明采前果面噴施殼聚糖能使蘋果、桃、葡萄病蟲害發(fā)生率降低，可溶性總糖含量增加，果皮組織結(jié)構(gòu)變化，衰老進(jìn)程受阻，貯藏壽命延長；劉亞平[34]提出采收前果面噴施殼聚糖提高了葡萄的耐壓強度、可溶性固形物和可滴定酸含量，顯著抑制了果粒硬度、咀嚼性和凝聚性的下降，延緩了果實的衰老軟化。鈣作為胞內(nèi)第2信使參與植物生長發(fā)育與衰老、光合作用等生理生化過程，與果實品質(zhì)、產(chǎn)量和貯藏性能的形成密切相關(guān)。王仁才等[16]在獼猴桃幼果期進(jìn)行浸鈣處理發(fā)現(xiàn)，鈣能顯著提高獼猴桃營養(yǎng)品質(zhì)和耐貯性；溫明霞等[35]表明錦橙生長期噴鈣能抑制VC等物質(zhì)的分解，提高可溶性固形物含量和糖酸比。邢尚軍等[36]提出鈣有效抑制了冬棗貯藏期間的褐變和硬度的變化及VC的消耗；類似研究在楊桃[26]、龍眼[37]、溫州蜜柑[38]等水果也有報道。本研究表明，殼聚糖復(fù)合膜劑促進(jìn)了獼猴桃產(chǎn)量形成，較好地改善了獼猴桃果實的營養(yǎng)品質(zhì)，且有效提高了獼猴桃貯藏性能，這些發(fā)現(xiàn)與上述前人的研究結(jié)果相似。這種顯著的保鮮效應(yīng)可能源于殼聚糖復(fù)合膜噴施于果實表面后，由于膜劑良好的成膜性和獼猴桃體表密生的絨毛增大了果實對殼聚糖、鈣營養(yǎng)和抗菌物質(zhì)等成分的吸收，這些成分協(xié)同參與了果實的生理代謝，促進(jìn)了果實產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改善，同時增大了果皮組織致密程度[34]，阻止果實內(nèi)外氣體交換，抑制果實呼吸強度和速率，減緩營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，因而提高了果實的抗衰老能力和貯藏性能。

4 結(jié) 論

為了探索果實的病害防控和保鮮的新方法，實現(xiàn)既防病又改善品質(zhì)、保鮮的目的，選用殼聚糖、鈣鹽和糊精分別與茶多酚、檸檬酸、抗菌肽混合制備了復(fù)合膜劑，研究評價了噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控及其保鮮作用。結(jié)果表明，引起修文縣獼猴桃軟腐病的病原菌為Botryosphaeria dothidea和Phomopsis sp.；采前在獼猴桃幼果期和壯果末期的果面噴施殼聚糖復(fù)合膜劑能顯著降低果實軟腐病的發(fā)病率和誘導(dǎo)果實抗病性增

強，同時該膜劑還能促進(jìn)獼猴桃果實生長和營養(yǎng)品質(zhì)地改善、有效提高獼猴桃貯藏性能。綜合評價效果較好的為殼聚糖、鈣鹽和糊精分別與茶多酚、檸檬酸、抗菌肽復(fù)合制成的膜劑。研究結(jié)果為獼猴桃果實病害的防控和保鮮提供了科學(xué)依據(jù)。

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Control of Soft Rot in Kiwifruit by Pre-Harvest Application of Chitosan Composite Coating and Its Effect on Preserving and Improving Kiwifruit Quality

ZHANG Cheng1, LI Ming2,*, LONG Youhua1,2, WU Xiaomao1,2
(1. College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Institute of Crop Protection, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

This study aimed to examine the effect of pre-harvest chitosan composite coating on controlling soft rot in kiwifruit and on maintaining and improving kiwifruit quality. Soft rot pathogens were isolated from infected ‘Guichang’kiwifruits (Actinidia deliciosa cv. Guichang) from Xiuwen county of Guizhou province, evaluated for pathogenicity and identified by DNA sequencing. Composite coatings were formulated by blending chitosan, calcium nitrate and dextrin with tea polyphenols, glycine, citric acid, antimicrobial peptide, respectively, and they were screened for application on kiwifruits at the young fruit period and the late expanding period. The results indicated that the soft rot pathogens identified were Botryosphaeria dothidea and Phomopsis sp., with Botryosphaeria dothidea being the dominant species, whose pathogenicity was greater than that of Phomopsis sp.. All chitosan composite coatings were effective at controlling kiwifruit soft rot and significantly decreased soft rot incidence. The control efficiencies of chitosan composite coatings with added tea polyphenols, glycine, citric acid and antimicrobial peptide were 86.54%, 61.54%, 71.15%, and 69.23%, respectively. All these coatings could significantly decrease malondialdehyde accumulation in kiwifruit during storage, increase the activities of superoxide dismutase, catalase and peroxidase, and enhance disease resistance. Moreover, the pre-harvest application of these chitosan composite films had no significant impact on longitudinal diameter, transverse diameter, lateral diameter or fruit shape index, but could effectively increase the average weight and volume of single fruits, as well as the contents of

kiwifruit; chitosan; calcium; soft rot; storage; quality

10.7506/spkx1002-6630-201622042

S663.4；S432.44

A

1002-6630（2016）22-0274-08

張承, 李明, 龍友華, 等. 采前噴施殼聚糖復(fù)合膜對獼猴桃軟腐病的防控及其保鮮作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 274-281. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622042. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Cheng, LI Ming, LONG Youhua, et al. Control of soft rot in kiwifruit by pre-harvest application of chitosan composite coating and its effect on preserving and improving kiwifruit quality[J]. Food Science, 2016, 37(22): 274-281. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622042. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203038）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31460480）；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（（2009）3022；（2011）3024）；貴陽市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)計劃項目（（2009）2-007）；三穗縣科技成果應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化項目（201602）

張承（1992—），男，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及有害生物綠色治理研究。E-mail：chengz76@aliyun.com

*通信作者：李明（1959—），男，教授，博士，主要從事植物保護(hù)膜開發(fā)應(yīng)用及植物源農(nóng)藥研究。E-mail：lm21959@163.com

vitamin C, total soluble solids, total soluble sugar, titraTableacid, chlorophyll and protein, and accordingly improved the yield and quality of kiwifruit. In addition, the application of these chitosan composite films could significantly increase and maintain fruit firmness, reduce respiratory intensity, weight loss and losses of vitamin C, total soluble solids, total soluble sugar, titraTableacid, chlorophyll and protein, obviously inhibit the increase in total soluble solids and total soluble sugars, delay fruit senescence and softening, and thus improve the storability of kiwifruit. The present study may provide a scientific basis and a new way for high-quality cultivation, organic control of soft rot and green preservation of kiwifruit.