吳茱萸次堿軟膏對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

劉　斌，李 靜，胡惠清，朱 里

吳茱萸次堿軟膏對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

劉斌，李 靜，胡惠清，朱 里

目的 探討吳茱萸次堿軟膏對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法 用二硝基氯苯(DNCB)反復(fù)刺激新生Nc/Nga小鼠背部皮膚，建立小鼠試驗(yàn)性特應(yīng)性皮炎模型。36只小鼠分為3組：正常對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)組（吳茱萸次堿軟膏治療），每組12只。試驗(yàn)組連續(xù)用藥2周，分別于第8天、15天測(cè)量各組小鼠背部皮損厚度和皮膚質(zhì)量，并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)第8天、15天血清中細(xì)胞因子干擾素γ（IFN-γ），白細(xì)胞介素（IL）-4， IL-5，免疫球蛋白E（IgE）的表達(dá)。結(jié)果 吳茱萸次堿治療第8天、15天，皮損厚度及皮膚質(zhì)量明顯下調(diào)（P＜0.05），血清中細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IgE水平明顯低于模型組，IFN-γ水平明顯高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論 吳茱萸次堿軟膏可能通過(guò)促進(jìn)IFN-γ分泌，下調(diào)炎癥因子IL-4、IL-5水平，以及抑制IgE表達(dá)，從而對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎產(chǎn)生保護(hù)作用。

皮炎，特應(yīng)性；吳茱萸次堿；細(xì)胞因子；小鼠

劉　斌

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是以劇烈瘙癢為主要臨床癥狀的慢性炎癥性皮膚病。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響人們的生活和健康[1]。AD病因目前并不明確，可能包括遺傳易感性、吸入過(guò)敏原刺激、自身抗原、食物過(guò)敏原刺激、感染以及皮膚功能障礙等等[2]。吳茱萸次堿（rutaecarpine）是從中藥吳茱萸中提取出來(lái)的化學(xué)有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿對(duì)皮膚的免疫反應(yīng)及過(guò)敏反應(yīng)具有抑制作用[3]。本試驗(yàn)采用Nc/Nga小鼠作為AD模型，以觀察吳茱萸次堿對(duì)Nc/Nga小鼠AD皮膚以及血漿細(xì)胞因子的影響，旨在為探索吳茱萸次堿對(duì)AD的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物和試劑

6周齡SPF級(jí)Nc/Nga小鼠（華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），雄性，體質(zhì)量25～30 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為清潔級(jí)環(huán)境。1%吳茱萸次堿乳膏（華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院藥劑科配置）；干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）；2，4-二硝基氯苯（DNCB）（Wako，日本）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立和給藥 清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)，室溫23℃，相對(duì)濕度40%，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。暴露小鼠腹部及背部面積約3 cm×3 cm皮膚，并于暴露皮膚處涂100 μl 1%DNFB進(jìn)行誘導(dǎo)。1周后于背部剃毛處外涂50 μl 0.1%DNFB進(jìn)行激發(fā)，每周2次，誘發(fā)皮炎。于用藥后第8天再次給予50 μl 0.5%DNFB激發(fā)1次[4]。小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、結(jié)痂等視為造模成功，造模成功24 h后試驗(yàn)組開(kāi)始給藥，每天涂藥1次，每次100 mg，面積為3 cm×3 cm，共給藥14 d，分別給予1%吳茱萸次堿乳膏，模型組和空白對(duì)照組未予特殊處理。

1.2.2觀察指標(biāo) ①皮膚質(zhì)量測(cè)定：第8天和第15天，用10 mm打孔器選取小鼠背部皮膚3個(gè)非重復(fù)部位打孔，用電子秤測(cè)量質(zhì)量，各組皮膚質(zhì)量取平均值；②皮膚厚度：第8天和第15天，打孔方法同上，小鼠背部皮膚厚度(mm)利用皮膚測(cè)微儀測(cè)量，各組皮膚厚度取平均值；③血漿IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE含量的測(cè)定：第8天和第15天各組小鼠眼眶后靜脈取血，抗凝血在4℃下2 000×g離心30 min，所得凍存于-20℃冰箱待測(cè)，血漿中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE采用ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1吳茱萸次堿對(duì)小鼠皮膚質(zhì)量的影響

造模成功后第8天和第15天，模型組小鼠背部皮損皮膚質(zhì)量分別為（55.61±1.93）mg和（50.71± 2.06）mg，空白對(duì)照組為（30.22±1.89）mg和（29.88 ±2.01）mg，兩組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），用藥后試驗(yàn)組小鼠背部皮損皮膚質(zhì)量分別為（42.51±1.87）mg和（37.68±1.92）mg，較模型組明顯降低（P＜0.05）（圖1）。

2.2吳茱萸次堿對(duì)小鼠皮膚厚度的影響

造模成功后，模型組小鼠背部皮損皮膚厚度為（782.34±39.55） mm和（616.99±29.85）mm，空白對(duì)照組為（393.59±30.61）mm和（389.72± 30.89）mm，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用藥后試驗(yàn)組小鼠背部皮損皮膚厚度為（588.69±32.66）mm和（445.73±30.81）mm，較模型組明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

2.3吳茱萸次堿對(duì)小鼠血漿IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影響

造模后第8天和第15天，血漿細(xì)胞因子IFN-γ含量均隨之下調(diào)，而經(jīng)過(guò)1%吳茱萸次堿軟膏治療后，IFN-γ含量上調(diào)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AD造模后第8天和第15天，細(xì)胞因子IL-4 、IL-5、IgE含量隨之上調(diào)，經(jīng)過(guò)1%吳茱萸次堿軟膏治療后，IL-4 、IL-5、IgE含量均受到抑制，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

3　討論

圖1　吳茱萸次堿對(duì)小鼠皮膚質(zhì)量的影響

圖2　吳茱萸次堿對(duì)小鼠皮膚厚度的影響

表1　造模后第8天、第15天吳茱萸次堿對(duì)小鼠血漿IFN-γ、IL-4　、IL-5、IgE水平的影響

中藥吳茱萸（evodia）在臨床的應(yīng)用已有千年歷史，其藥理學(xué)作用較為廣泛，如舒張血管、抗血栓形成和抗炎等作用[5]。吳茱萸的主要活性成分吳茱萸次堿為一種吲哚喹唑啉類生物堿，具有廣泛的藥理學(xué)意義。

研究證實(shí)，AD患者血漿免疫球蛋白Ig E和T輔助淋巴細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子水平均明顯升高[6]。并且，Th1和Th2細(xì)胞因子之間相互拮抗，IFN-γ是Th1群細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子之一，且IL-4和IL-5是Th2群細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子之一。Th1/Th2之間的平衡狀態(tài)對(duì)保持機(jī)體正常免疫功能具有重要意義。Th1/Th2的平衡失調(diào)可導(dǎo)致一系列疾病，如過(guò)敏性疾病，免疫失調(diào)等[7]。AD主要是Th2誘導(dǎo)的過(guò)敏性疾病，Th2分泌的IL-4及IL-5可促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Ig E，而Th1分泌的IFN-γ則可明顯抑制Ig E的合成和發(fā)展，AD小鼠皮損的嚴(yán)重程度與IgE水平相關(guān)[8]。Sugiura等[9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，AD Nc/Nga小鼠皮損中分泌IL-4和IL-5的細(xì)胞明顯增多，并且隨周齡增長(zhǎng)而增加。研究發(fā)現(xiàn)，IL-12在免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)，抑制IL-4和IL-5，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)朝Th1型方向發(fā)展[10]。IFN-γ可抑制Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-5的分泌，抑制其向Th2分化，促使免疫反應(yīng)向Th1分化，并可阻斷IgE的合成，下調(diào)嗜酸粒細(xì)胞的表達(dá)和浸潤(rùn)，以減輕AD的發(fā)生和發(fā)展。因此，降低AD患者IgE表達(dá)水平，抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2型免疫反應(yīng)，使之朝著Th1方向發(fā)展，有望成為AD治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠首次經(jīng)DNCB刺激后，小鼠背部出現(xiàn)鱗屑、紅斑等現(xiàn)象；第2次刺激后，小鼠背部紅斑、鱗屑加重；第3次刺激后，小鼠背部出現(xiàn)嚴(yán)重紅斑及厚痂形成。1%吳茱萸次堿乳膏組在用藥第8天及第15天均明顯減輕AD皮膚質(zhì)量。1%吳茱萸次堿乳膏組在用藥第8天及第15天，血清IL-4、IL-5以及IgE水平明顯低于模型組，IFN-γ含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示吳茱萸次堿對(duì)AD作用機(jī)制至少是通過(guò)抑制小鼠皮損和血清中Th2類細(xì)胞因子水平，提高Th1類細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1和Th2平衡而起抑制AD的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11]。

本試驗(yàn)通過(guò)研究證實(shí)，吳茱萸次堿對(duì)小鼠AD具有抑制作用，作用的相關(guān)機(jī)制可能是吳茱萸次堿能通過(guò)上調(diào)Th1分泌的IFN-γ水平，抑制Th2分泌的IL-4、IL-5，進(jìn)而抑制IgE合成和表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/ Th2平衡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

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（本文編輯耿建麗）

Effect of rutaecarpine ointment on experimental atopic dermatitis in mice and its possible mechanisms

LIUBin，LIJing，HUHui-qing，etal
DepartmentofDermatology,theNinthHospitalofWuhanCity,Wuhan430080,China

Objective To investigate the effect of rutaecarpine ointment on atopic dermatitis in mice and its possible mechanisms. Methods DNCB was repeatedly applied on the back of NC/Nga mice to establish the animal model of atopic dermatitis. Thirty-six mice were divided into 3 groups: control group, model group and rutaecarpine ointment group, with 12 mice in each group. The treatment of rutaecarpine ointment lasted for 14 days. Levels of several cytokines, including interleukin (IL)-4, IL-5, interferon (IFN)-γ and immunoglobulin E (IgE), from the serum samples were detected by ELISA kit at 8 and 15 days of the experiment. Meanwhile, skin samples underwent the measurement of thickness and weight at 8 and 15 days of the experiment. Results Rutaecarpine ointment could signifi cantly decrease the skin thickness and weight at 8 and 15 days of the experiment. Meanwhile, rutaecarpine ointment markedly decreased the level of IL-4, IL-5 and IgE, and increased the level of IFN-γ from the serum samples at 8 and 15 days of the experiment. Conclusion The therapeutic effect of rutaecarpine on atopic dermatitis-like skin lesions may be taken through inhibiting IgE, IL-4 and IL-5 synthesis and promoting the secretion of IFN-γ.

Dermatitis，atopic；Rutaecarpine；Cytokines；Mice [J Pract Dermatol, 2016, 9(3):165-167]

R758.23

A

1674-1293(2016)03-0165-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160302

430080，武漢市第九醫(yī)院皮膚科（劉斌，李靜，胡惠清）；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科（朱里）

劉斌，副主任醫(yī)師，E-mail:andy_cxlinghappy@126.com

朱里，E-mail:doctorzhuli@hotmail.com

（2016-01-09

2016-03-14）