5-氮雜胞苷對馬氏珠母貝早期發(fā)育的影響

李耀國,孫 彤,張雅劍,鞏建豪

(海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院， 海南 三亞 572022)

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5-氮雜胞苷對馬氏珠母貝早期發(fā)育的影響

李耀國,孫 彤,張雅劍,鞏建豪

(海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院， 海南 三亞 572022)

為了解5-氮雜胞苷對馬氏珠母貝早期發(fā)育的影響,該研究檢測并分析了其對早期發(fā)育階段甲基化水平和礦化基因表達的影響. 結果顯示5-氮雜胞苷處理可引發(fā)基因組甲基化水平顯著降低. 5-氮雜胞苷處理亦使DNMT3的表達量低于海水處理組,而礦化基因nacrein的表達量高于海水處理組.DNMT3和nacrein的表達呈顯著正相關(R2=0.755,P=0.000). 基因組甲基化水平的改變可能是調控生物礦化過程的重要因素.

馬氏珠母貝;去甲基化試劑;早期發(fā)育;甲基化水平;生物礦化

0 引言

生物體的表型變化主要由DNA序列的變異引起,除了常見的A、T、C、G 四個脫氧堿基的變異外,一種表觀遺傳DNA甲基化修飾引起了科研工作者的廣泛關注.這種DNA甲基化修飾表現(xiàn)為甲基化轉移酶將序列中胞嘧啶加上一個甲基基團,使胞嘧啶成為“5-甲基胞嘧啶”[1].5-甲基胞嘧啶主要發(fā)生在“CpG” 二核苷酸或者其它類型位點如“GpC”中的胞嘧啶上[2-3].動物中胞嘧啶甲基化在非編碼DNA區(qū)域(內含子、重復元件和活性轉座子元件)的失活中起到重要作用,并能通過引起染色質結構、DNA構象及DNA與蛋白質相互作用方式的改變來影響基因表達,是大多數(shù)生物生長發(fā)育過程中不可缺少的一部分[4].

甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(MSAP,methylation sensitive amplification polymorphism)是一種可對基因組 “5′-CCGG-3′”位點胞嘧啶甲基化狀態(tài)進行檢測的常用方法. 其原理主要是根據(jù)HpaII和MspI這兩種同裂酶對基因組“5′-CCGG-3′”雙鏈位點中胞嘧啶甲基化狀態(tài)不同而具不同酶切活性,可比較不同酶切反應對應PCR產(chǎn)物的電泳圖譜來分析樣品甲基化狀況.HpaII酶可以酶切“5′-CCGG-3′”單鏈外部胞嘧啶甲基化序列,而MspI酶可以酶切“5′-CCGG-3′”雙鏈內部胞嘧啶甲基化序列[5].MSAP技術已廣泛應用于基因組甲基化水平檢測,DNA甲基化與雜種優(yōu)勢的關聯(lián)分析[6]以及DNA甲基化與生物抗性的關系分析等[7].

多數(shù)非脊椎動物甲基化在基因組中的分布呈一種“鑲嵌模型”,即甲基化修飾的“CpG”位點散布于整個基因組中[8].其中雙殼貝類DNA甲基化主要存在于基因內含子及外顯子上[9],基因的DNA甲基化與其表達調節(jié)相關,其中免疫相關基因常呈現(xiàn)出點綴分布的甲基化狀態(tài)[10].貝類甲基化的研究報道較少,主要集中于太平洋牡蠣和馬氏珠母貝兩個物種中. 太平洋牡蠣甲基化的基因與基因高轉錄豐度及組織間低表達變異存在關聯(lián),同源盒型基因的甲基化可使基因表達水平下降,DNA甲基化與基因組具有一定關聯(lián)性并對早期發(fā)育產(chǎn)生影響[9-12].馬氏珠母貝(Pinctadafucata)是廣泛分布于中國廣東、廣西、海南省及日本沿海的具重要經(jīng)濟價值的珍珠貝. 其組織甲基化水平范圍為11.71至14.71%,免疫相關基因galectin啟動子區(qū)甲基化水平與基因的表達水平呈顯著正相關,而基因組甲基化水平與galectin基因的表達水平呈負相關[13-14].目前對馬氏珠母貝DNA甲基化的研究主要集中于對其基因組及基因甲基化狀態(tài)的檢測及分析,尚未見人工主動改變基因組甲基化水平對其早期胚胎發(fā)育及基因表達影響的研究報道.

該研究利用MSAP技術檢測DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷處理對馬氏珠母貝早期發(fā)育階段基因組甲基化水平的影響,比較處理后甲基化轉移酶基因DNMT3及礦化基因nacrein的表達水平變化,并對基因表達的相關性進行了分析.目的在于獲得人工主動去甲基化對馬氏珠母貝早期發(fā)育影響的直接證據(jù),并為深入探討DNA甲基化在貝類生長發(fā)育、生物礦化中的作用提供科學基礎.

1 材料與方法

1.1 樣品采集和核酸提取

該研究所用2齡馬氏珠母貝個體從中國科學院大亞灣海洋生物綜合實驗站(深圳)采集,作為育種親貝在海水池中暫養(yǎng).通過解剖觀察判斷親本雌、雄性別后,設立3組馬氏珠母貝雌、雄親本單對配對的人工授精實驗. 分別將每組單對配對親本產(chǎn)生的精子和卵細胞進行混合以形成受精卵.每對單對配對親本的受精卵分成兩部分:對照組(采用滅菌海水浸泡處理)及實驗組(采用10-5mol L-15-氮雜胞苷溶液浸泡處理). 分別對所有三組單對配對實驗中受精卵、二細胞期、桑葚期胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲進行顯微觀察及樣品采集(包含殼頂幼蟲). 采集的樣品保存于核酸保護液中.樣品基因組DNA和RNA的提取按照廣州美基公司的核酸提取試劑盒說明書進行操作.提取后的核酸稀釋于超純水中,核酸的完整性和濃度分別通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計OD260/280值進行分析,于-80°C保存待用.

1.2 MSAP技術檢測早期發(fā)育階段甲基化水平

利用MSAP技術對各實驗組和對照組受精卵、二細胞期、桑葚期胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲和殼頂幼蟲樣品的基因組甲基化水平進行檢測. 具體步驟如下:雙酶切反應,利用EcoRI和HpaII,EcoRI和MspI酶組合分別對源自同一樣品的兩份DNA進行37 ℃下酶切6 h.酶切后經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切完全性.引物接頭的生成及連接:等體積的10 pmol/μL EcoRI接頭F引物及10 pmol/μL EcoRI 接頭R引物混合后退火形成EcoRI接頭；等體積的50 pmol/μL HM 接頭F引物及50 pmol/μL HM 接頭R引物混合后退火形成HM 接頭.其中退火程序:65 ℃,15 min；37 ℃,15 min；20 ℃,15 min；最后置于冰水混合物15 min.酶切產(chǎn)物與引物接頭的連接:2 μL雙酶切產(chǎn)物,50 pmol HM 接頭,10 pmol EcoRI接頭,T4 DNA 連接酶(350U/μL)0.2 μL,4 μL 10 × T4 DNA 連接緩沖液,加ddH2O至總體積為20 μL,16℃連接過夜.連接產(chǎn)物稀釋10倍后作為預擴增模板.預擴增反應和選擇擴增反應:預擴增反應體系設置為20 μL:包括10.5 μL Premix Ex Taq(Takara,大連),1 μL稀釋10倍后的連接產(chǎn)物,1μL 的20 pmol/μL引物EcoR+A,1μL 的20 pmol/μL引物HM +T,加ddH2O 6.5 μL.PCR程序為94 ℃ 5 min；20個循環(huán)的94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min,得到預擴增產(chǎn)物. 選擇擴增反應體系包括10.5 μL Premix Ex Taq,1 μL稀釋10倍后的預擴增產(chǎn)物,0.5 μL的20 pmol/μL的選擇擴增引物E+3,2 μL 的20 pmol/μL的選擇擴增引物HM+3(3為堿基數(shù))所用引物組合為(Eco+ATA,HM+TCT；Eco+ATA,HM+TCA；Eco+ATC,HM+TCT；Eco+ATC,HM+TCA),加ddH2O 6 μL. 反應程序分兩步:第一步為13個循環(huán)的94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,每個循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃,直至56 ℃.第二步為27個循環(huán)的94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；最后72℃ 5 min.上述引物序列基于Xiong等[15]研究設計,接頭引物及擴增引物序列見表1,由華大基因廣州分公司合成.

1.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測

將選擇擴增PCR產(chǎn)物與甲酰胺變性上樣緩沖液按體積比3∶1混合, 95 ℃加熱10 min后置冰上迅速冷卻. 每管取3 μL上樣于8% SDS-PAGE凝膠,200 V恒壓電泳至溴酚藍指示帶到達凝膠底部. 將SDS-PAGE凝膠小心取下放入雙蒸水漂洗后進行銀染顯色并拍照記錄.根據(jù)MSAP擴增條帶可分析四種甲基化情況:(1)MspI酶和HpaII酶對應的電泳泳道同一位置存在大小相同的條帶,為“5′-CCGG-3′”雙鏈序列胞嘧啶無甲基化位點(Type I 位點).(2)在HpaII酶對應泳道有一條擴增條帶而在MspI酶泳道相應位置無條帶，為“5'-CCGG-3'”單鏈序列外部胞嘧啶甲基化位點(Type II 位點).(3)在MspI酶對應泳道具有一條擴增條帶而在HpaII酶泳道的相應位置無條帶，為“5'-CCGG-3'”的雙鏈序列內部胞嘧啶甲基化位點(Type III 位點)[16].(4)在MspI對應的電泳泳道及HpaII對應泳道的同一位置均無條帶，而其它樣品在該位置具有條帶，為雙鏈“5'-CCGG-3'”全甲基化位點(Type IV 位點)[17].DNA 甲基化水平的計算: DNA甲基化水平(%)=總甲基化位點數(shù)/(Type I + Type II+ Type III + Type IV 位點數(shù)).其中總甲基化位點數(shù)為Type II、Type III、Type IV 位點數(shù)之和.

表1 MSAP分析及熒光定量所用載體及引物序列引物及載體名稱引物序列(5'-3')EcoRI接頭FCTCGTAGACTGCGTACCEcoRI接頭RAATTGGTACGCAGTCTACHpaII-MspI接頭FGATCATGAGTCCTGCTHpaII-MspI接頭RCGAGCAGGACTCATGAEco+AGACTGCGTACCAATTCAHM+TATCATGAGTCCTGCTCGGTEco+ATAGACTGCGTACCAATTCATAEco+ATCGACTGCGTACCAATTCATCHM+TCTATCATGAGTCCTGCTCGGTCTHM+TCATCATGAGTCCTGCTCGGTCADNMT3FGGACCACCTTCACAGAAACTCDNMT3RTGCGGAAAAACTCAAAAAACAnacreinFACCAGACGTAAGGGATCAGAAnacreinRATCGTTATGACCAGGGAATG18sFACACCGCCCGTCGCTACTAC18sRCGCCCTTCTTCTCGGCACAC

1.4 熒光定量檢測及數(shù)據(jù)分析

利用熒光定量PCR 技術對DNA 甲基化轉移酶基因DNMT3、生物礦化基因nacrein 的表達水平進行檢測.步驟如下: 利用Primer Primier 5.0 軟件設計兩對熒光定量引物(DNMT3F和DNMT3R以及nacrein F 和nacrein R).PCR 反應在Roche LightCycler480 熱循環(huán)儀中進行，體系如下: 5 μL 2 × SYBR Premix ExTaqTM，1 μL模板cDNA,熒光定量引物各0.4 μL(10 μM),加 3.2 μL去離子水至總體積為10 μL. PCR反應程序:95°C 1 min,45 個循環(huán)的95°C 5 s,55°C 15 s,72°C 60 s. 選用的參考基因為18S (Genebank登錄號:AY028625.1),引物對應為18s F和18s R[14].基因的相對表達量通過Ct方法 (2-△△Ct 方法)計算.馬氏珠母貝5-氮雜胞苷實驗中實驗組和對照組的基因相對表達量比較,各發(fā)育時期間的基因組甲基化水平比較、相關性分析均通過SPSS19.0 軟件進行,顯著性水平設置為P<0.05.

2 結果

2.1 早期發(fā)育胚胎觀察

圖1 馬氏珠母貝各早期發(fā)育階段

對馬氏珠母貝各實驗組、對照組早期發(fā)育狀況進行了顯微觀察及拍照,結果如下圖1所示.其中受精卵為精子與卵細胞混合后約15分鐘形成,隨后排出第一和第二極體. 從二細胞期至囊胚期主要體現(xiàn)為細胞數(shù)目的增多.當馬氏珠母貝早期胚胎發(fā)育至D型幼蟲期時,其外型呈較明顯的“D”型. 比較對照組(滅菌海水處理)和實驗組(10-5mol L-15-氮雜胞苷溶液處理)的早期發(fā)育胚胎發(fā)現(xiàn)兩組之間并不存在明顯的形態(tài)差異. 2.2 早期發(fā)育DNA甲基化水平檢測

利用MSAP技術對馬氏珠母貝各單對配對對照組和實驗組的受精卵、二細胞期、桑葚期胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲樣品的DNA甲基化水平進行了檢測. 共計4對選擇性擴增引物被用于DNA甲基化分析(圖2).結果顯示總計檢測到1719個“5′-CCGG-3′”位點中的胞嘧啶甲基化狀態(tài). 選擇性9,平均檢測位點數(shù)為35. 被檢測到的位點中含211個甲基化位點,包括188個全甲基化位點和23個半甲基化位點. 對照組中受精卵、二細胞期胚、桑葚胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲的DNA甲基化水平分別為12.85±1.94%,13.19±2.81%,13.41±1.94%,14.79±1.71%,13.43±1.33% 和13.55±1.45%. 處理組中受精卵、二細胞期胚、桑葚胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲的DNA甲基化水平分別為10.09±1.07%,10.73±0.95%,11.19±1.82%,11.56±1.19%,10.41±1.23%和11.50±1.45%. 處理組與對照組各組內DNA甲基化水平均無顯著差異. 除桑葚胚和殼頂幼蟲期樣品外,處理組DNA甲基化水平顯著低于對照組對應樣品的甲基化水平(P<0.05)(圖3).早期發(fā)育各階段中擔輪幼蟲的DNA甲基化水平最高, 受精卵的DNA甲基化水平最低. 隨著馬氏珠母貝早期發(fā)育的進行,基因組甲基化水平總體呈上升的趨勢.

2.3 早期發(fā)育階段基因表達檢測

利用熒光定量PCR技術對甲基化轉移酶DNMT3及生物礦化基因nacrein在對照組和實驗組的表達水平進行了檢測,結果如圖4所示. 在對照組和處理組中,DNMT3和nacrein基因的表達量均隨發(fā)育進行呈升高的趨勢. 與對照組相比,經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷溶液處理后,生物礦化基因nacrein的表達量升高,但升高未達顯著水平. 與對照組相比,實驗組中甲基化轉移酶DNMT3的表達量降低,但降低未達顯著水平. 整個早期發(fā)育過程中,實驗組及對照組中甲基化轉移酶DNMT3和生物礦化基因nacrein的表達水平呈顯著正相關(R2=0.755,P=0.000).

圖4 早期發(fā)育階段基因表達水平分析橫軸1-6分別代表受精卵、二細胞期胚、桑葚胚、擔輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲，縱軸為相對表達水平值

3 討論與結論

DNA甲基化修飾可從親本遺傳至子代并對許多生物代謝活動起到重要調控作用[18].如正常的基因組甲基化修飾對動物、植物的生殖細胞形成、早期胚胎發(fā)育潛能形成及發(fā)育調控具重要作用[19-20].該研究中,我們利用去甲基化試劑5-氮雜胞苷對馬氏珠母貝受精卵進行浸泡處理并分析其對早期發(fā)育過程、DNA甲基化水平及甲基化轉移酶、礦化基因表達的影響. 從結果可知5-氮雜胞苷處理可使馬氏珠母貝早期發(fā)育受到明顯影響,主要表現(xiàn)在三個方面:一是早期胚胎成活率降低；二是大部分早期發(fā)育階段基因組甲基化水平顯著降低(P<0.05)；三是甲基化轉移酶基因表達量降低和礦化基因的表達量上升. 相似的研究在同屬雙殼貝類的太平洋牡蠣中也開展過,5-氮雜胞苷處理可顯著降低早期發(fā)育過程中的DNA甲基化水平,并引起D型幼蟲等胚胎的形態(tài)異常,最終導致死亡[12].本研究中馬氏珠母貝早期發(fā)育階段經(jīng)去甲基化試劑處理后,雖未發(fā)現(xiàn)胚胎階段出現(xiàn)形態(tài)發(fā)育異常,但也出現(xiàn)了處理組(5-氮雜胞苷處理)存活率低于對照組(海水處理)的現(xiàn)象,說明早期發(fā)育過程中DNA甲基化水平的人工降低對多數(shù)個體是致死的.

動物中DNA甲基化主要發(fā)生在“CpG”二核苷酸位點上,基因組中可高達60%到90%的“CpG”二核苷酸被甲基化修飾[21].DNA甲基化轉移酶基因家族成員主要為DNMT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b以及DNMT3L,這些酶在DNA甲基化修飾形成中發(fā)揮重要作用. 其中DNMT3主要負責配子形成期及胚胎發(fā)育早期DNA甲基化模式的建立.目前貝類DNA甲基化轉移酶基因及DNA甲基化結合蛋白的研究很少. 僅見Wang等[22]鑒定并獲得了太平洋牡蠣中Dnmt1,Dnmt2,Dnmt3和MBD2/3等DNA甲基化酶核心基因.DNMT3甲基化酶表達水平的降低可能引起全基因組甲基化水平的降低[23].本研究中馬氏珠母貝DNMT3甲基化轉移酶基因在經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理后表達水平降低可能預示著全基因組甲基化水平降低,進而大規(guī)模的基因表達水平變化可能會發(fā)生.

馬氏珠母貝隸屬于軟體動物,其外套膜分泌產(chǎn)物是貝殼及珍珠形成的基礎.貝殼由外套膜分泌產(chǎn)物在外殼的內面與外套膜間沉積而成[24].馬氏珠母貝外套膜nacrein蛋白是其外表皮細胞分泌基質蛋白的一種,由碳酸酐酶結構域和Gly-X-Asn結構域構成,其中Gly-X-Asn重復結構域在減弱鈣化過程中起關鍵作用. 重組nacrein蛋白可以在含CaCl2和NaHCO3的飽和碳酸鈣溶液中抑制碳酸鈣的沉淀,起到負向調控貝類殼鈣化過程的作用[25].該研究中5-氮雜胞苷處理可引起nacrein表達水平的升高,可能會對馬氏珠母貝生物礦化過程如殼和珍珠的形成產(chǎn)生影響. 從研究結果還可知DNMT3基因與nacrein基因的表達量呈顯著正相關,因此可以較大膽的推測,nacrein基因表達量的變化可能源于基因組甲基化水平的變化,該基因某些區(qū)域(如啟動子區(qū)域) 甲基化水平的變化可能直接與其表達量變化相關.在今后的研究中,可以嘗試對礦化基因啟動子區(qū)、基因內部編碼區(qū)等部位的甲基化水平進行檢測,并分析其與基因表達的關系,為DNA甲基化在生物礦化過程中的可能作用提供證據(jù).

該研究利用去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理了馬氏珠母貝的受精卵并研究了其對后續(xù)發(fā)育階段的影響. 結果表明5-氮雜胞苷可引起早期發(fā)育階段基因組甲基化水平顯著降低,甲基化轉移酶基因DNMT3和礦化基因nacrein的表達量均發(fā)生變化且兩基因的表達呈顯著正相關.研究表明基因組甲基化修飾對馬氏珠母貝早期發(fā)育過程具有重要意義,通過改變基因組甲基化水平可能是調控礦化過程,影響貝殼及珍珠形成的可行途徑之一.

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(編校：李由明)

Effect of 5-azacytidine on Early Development ofPinctadafucata

LI Yao-guo, SUN Tong, ZHANG Ya-jian, GONG Jian-hao

(College of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022,China)

To investigate the effect of 5-azacytidine on early development process of Pinctada fucata (P.fucata), genome methylation level change and expression level change of biomineralization gene were analyzed. The results showed that the treatment of 5-azacytidine resulted in a significantly decrease of the genome methylation levels of early embryos. The expression levels ofDNMT3 in the group after treatment of 5-azacytidine were lower than those in the group treated with seawater, whilst the expressions ofnacreingene were higher than those in the seawater treatment group. A significant positive correlation was observed between the expressions ofDNMT3 and nacrein genes (R2=0.755,P=0.000). The change of genome methylation level may be a key factor involved in the regulation of biomineralization process.

Pinctadafucata; demethylation agent; early development; methylation level; biomineralization

2016-10-05

海南自然科學基金面上項目(20164166)；海南熱帶海洋學院學科帶頭人和博士科研啟動基金項目(RHDXB201620)

李耀國(1986-),男,湖南湘鄉(xiāng)人,海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院講師,博士,研究方向為水產(chǎn)動物分子育種與資源保護.

S91

A

1008-6722(2016) 05-0005-06

10.13307/j.issn.1008-6722.2016.05.02