含卟啉基葡聚糖大分子磁共振成像造影劑的研究

柯希駿，劉凡，徐瓊楠，鄢國平，韓林，涂圓圓，蔣燦，鄭華明，彭永利，楊雋

武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北　武漢　430074

含卟啉基葡聚糖大分子磁共振成像造影劑的研究

柯希駿，劉凡，徐瓊楠，鄢國平*，韓林，涂圓圓，蔣燦，鄭華明，彭永利，楊雋

武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430074

將腫瘤靶向基團5-（4-氨基苯基）-10，15，20-三（4-磺酸苯基）卟啉鈉（APTSPP）與二乙三胺五乙酸（DTPA）分別鍵接在葡聚糖側(cè)鏈上，再與釓Gd（III）離子配合，從而研制出一種新型含卟啉基葡聚糖大分子磁共振成像造影劑（APTSPP-Dextran-DTPA-Gd）.對所合成的配體及釓配合物分別進行了核磁共振氫譜、紫外可見光譜、傅里葉變換紅外光譜等結(jié)構(gòu)表征，分析了釓配合物在水溶液中的粒徑分布和Zeta電位，測試了釓配合物的體外弛豫率與新西蘭大白兔體內(nèi)腫瘤磁共振成像性能.與Gd-DTPA相比，所得釓配合物具有較高的弛豫率，對VX2腫瘤有良好的磁共振成像性能與靶向性，能對磁共振成像的對比度與清晰度有較好的提高.

磁共振成像；造影劑；二乙三胺五乙酸釓；腫瘤靶向；卟啉；葡聚糖

1　引言

磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging， MRI）是根據(jù)核磁共振原理，采用傅立葉圖像重建及空間定位等技術(shù)而形成的一種新型的無創(chuàng)傷的醫(yī)用影像診斷技術(shù)［1-2］.與超聲波成像、CT等其它臨床影像技術(shù)相比，磁共振成像具有以下優(yōu)點：①多核與多參數(shù)成像；②無電離輻射，無創(chuàng)傷；③可實現(xiàn)任意方位層面的掃描，無須改變體位；④軟組織對比度及空間分辨率均較高；⑤能獲取組織水質(zhì)子周圍環(huán)境的生理化信息.自從Lauterbur［3］于1973年首次實現(xiàn)了磁共振成像以來，隨著納米、超導(dǎo)、低溫、電子和計算機等相關(guān)技術(shù)的進步，MRI技術(shù)得到了飛速發(fā)展，目前已廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域.

磁共振成像可檢測組織壞死、各種惡性病變，其信號強弱取決于組織或器官內(nèi)水的含量和水分子中質(zhì)子的弛豫時間［4］.為了確保磁共振成像在臨床診斷的準(zhǔn)確性，30%以上的診斷都須使用磁共振成像造影劑（MRI contrast agent）來縮短體內(nèi)局部組織中水質(zhì)子的弛豫時間，從而達到提高成像的靈敏度和清晰度的目的［5-6］.

一種先進的造影劑必須具有低毒、穩(wěn)定、高弛豫率、良好的靶向性以及在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)耐Ａ魰r間又易于排除等特點［7-8］.臨床上廣泛使用的小分子釓造影劑Gd-DTPA［9-10］，雖能縮短成像T1弛豫時間，提高成像對比度和清晰度，但在體內(nèi)停留時間短，且對組織或器官不具有靶向性.若將小分子Gd-DTPA與生物相容性好的大分子載體鍵連在一起，再在配體上連接具有組織或器官靶向性的基團，則可制備出靶向性大分子造影劑.

本文將腫瘤靶向性小分子5-（4-氨基苯基）-10，15，20-三（4-磺酸苯基）卟啉鈉（APTSPP）、二乙三胺五乙酸（DTPA）分別鍵接在葡聚糖大分子載體側(cè)鏈上，合成大分子配體，再與Gd（III）離子進行配合，從而制備一種新型的含卟啉基葡聚糖大分子造影劑（APTSPP-Dextran-DTPA-Gd）.對所合成的配體及釓配合物分別進行了核磁共振氫譜（nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H NMR）、紫外可見光譜（ultraviolet spectroscopy，UV）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infra?red spectroscopy，F(xiàn)T-IR）等結(jié)構(gòu)表征及粒徑和Zeta電位分析，測試了釓配合物的體外弛豫率與新西蘭大白兔體內(nèi)腫瘤磁共振成像性能.其合成路線見圖1.

圖1　APTSPP-Dextran-DTPA-Gd的合成路線Fig.1Synthetic route of APTSPP-Dextran-DTPA-Gd

2　實驗部分

2.1測試儀器及試劑

葡聚糖（Dextran，分子量為4萬）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、N-羥基琥珀酰亞胺（SuOH）、二環(huán)己基碳亞胺（DCC）均為生化試劑；4-硝基苯甲醛、氧化釓（Gd2O3）、二氯二腈基苯醌、乙酸酐、三氟化硼乙醚絡(luò)合物、三氯甲烷、無水乙醇、無水乙醚、濃鹽酸、濃硝酸、濃硫酸均為分析純試劑.乙三胺五乙酸單N-羥基琥珀酰亞胺活性酯（DTPA-OSu）和5-（4-氨基基）-10，15，20-三（4-磺酸苯基）卟啉（APTSPP）的合成與結(jié)構(gòu)表征均按照文獻報告［11］的實驗方法進行實施.

Nicolet Impact 420型傅立葉紅外分析儀（KBr壓片法）；PSS NICOMP380型粒徑儀；Varina Mercury Vx-300NMR（300 MHz）型核磁共振儀測定自旋-晶格弛豫時間（T1）；Varina Mercury Vx-300型核磁共振波譜儀；UNIC-2802H UV/Vis Spectrophotometer紫外光譜儀；3.0T磁共振成像儀（德國Trio Tim，協(xié)和醫(yī)院）.VX2瘤株與右側(cè)大腿肌肉種植VX2腫瘤轉(zhuǎn)移模型的新西蘭大白兔（體重為2.0 kg～3.0 kg，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供）.

2.2實驗方法

2.2.1葡聚糖大分子配體Dextran-DTPA的合成取2.06 g葡聚糖（12.7 mmol）溶于150 mL DMSO中于60℃攪拌溶解，過濾，冷卻至室溫，在磁力攪拌條件下加入上述制備好的二乙三胺五乙酸單N-羥基琥珀酰亞胺活性酯（DTPA-OSu）的DMF溶液，反應(yīng)2 h.將溫度升至60℃繼續(xù)反應(yīng)7 d.反應(yīng)結(jié)束后，濃縮反應(yīng)液，隨后將反應(yīng)液緩慢倒入V（無水乙醇）∶V（無水乙醚）＝1∶2的混合溶劑中進行沉淀，抽濾，得白色固體.再用DMF-無水乙醇進行重沉淀，真空干燥后，將固體溶于蒸餾水中，用蒸餾水透析.然后將透析液過濾，減壓蒸干，真空干燥，得淺黃色固體Dextran-DTPA 2.2 g，產(chǎn)率32%.

2.2.2配體APTSPP-Dextran-DTPA的合成取2.0 g大分子配體（12.35 mmol）溶于20 mL二甲亞砜中，室溫攪拌下，加入0.43 mL溴乙酰溴（4.94 mmol，占葡聚糖單元摩爾數(shù)的40%）和0.977 g吡啶（12.35 mmol），攪拌反應(yīng)3 d.反應(yīng)液用無水乙醇沉淀，抽濾得淡黃色固體，再將產(chǎn)物溶于少量蒸餾水中，用二次蒸餾水透析，除去未反應(yīng)的小分子.將透析液減壓蒸干，真空干燥至恒重得黃色固體2.126 g，產(chǎn)率85.42%.

將1.0 g溴代產(chǎn)物（6.17 mmol）溶于20 mL二甲亞砜中，加入2.31 g 5-（4-氨基苯基）-10，15，20-三（4-磺酸苯基）卟啉鈉（2.47 mmol），以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%四丁基氫氧化銨為催化劑，室溫攪拌反應(yīng)2 d.反應(yīng)液用無水乙醇沉淀，抽濾，干燥，所得固體用二次蒸餾水透析完畢后，減壓蒸干至恒重，稱得1.832 g黃色晶體，產(chǎn)率88.6%.

2.2.3釓配合物APTSPP-Dextran-DTPA-Gd的合成

近年來，中國多個城市陷入“霧霾危機”。汽柴油燃燒產(chǎn)生的尾氣已成為城市占比最高的污染源，尤其是貨運業(yè)的原油消費量驚人，發(fā)展新能源貨運勢在必行。在“2016年全國貨運行業(yè)年會”上，眾多專家討論了物流電動化的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢。隨著環(huán)境污染加劇和電商快遞業(yè)務(wù)轉(zhuǎn)型升級，新能源物流車(electric logistics vehicle，ELV)逐漸成為物流公司的首選[1-2]?？茖W(xué)合理的充電站選址對于ELV能否滿足客戶個性化配送服務(wù)來說至關(guān)重要，對物流企業(yè)降低運輸成本、提高規(guī)模效益具有現(xiàn)實意義。

取2.0 g大分子配體APTSPP-Dextran-DTPA，溶于30 mL去離子水中，加入6.5 g GdCl3·H2O水溶液（24.69 mmol），室溫反應(yīng)12 h.抽濾，得棕色溶液，將溶液透析，每隔1 h換水，直到透析外液檢測不到Gd3+.將透析液減壓蒸干，真空干燥得到黃色釓配合物APTSPP-Dextran-DTPA-Gd 2.3 g，產(chǎn)率為38.7%.

2.3大分子釓配合物中Gd3+含量的測定

Gd3+標(biāo)樣溶液的配制：用25 mL容量瓶配制濃度為100 mg/L的標(biāo)樣溶液.稱取2.9 mg純度為99.9%的Gd2O3，用3 mL王水對Gd2O3進行酸化，然后用二次蒸餾水進行定容，配制成25 mL Gd3+標(biāo)樣溶液.

釓配合物溶液的制備：制備方法同上，先計算出配制相同質(zhì)量濃度（100 mg/L）的溶液所需釓配合物APTSPP-Dextran-DTPA-Gd的理論上所需質(zhì)量.然后用王水對大分子釓配合物進行降解，再定容.以標(biāo)樣溶液為參照，用ICP Atomscan-2000原子發(fā)射光譜儀測定釓配合物溶液中釓離子的濃度.

2.4釓配合物弛豫時間的測定

配制一組釓離子濃度分別為0.15 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L的APTSPP-Dextran-DTPA-Gd水溶液和釓離子濃度為0.15 mmo/L的Gd-DTPA水溶液，在Varian Mercury Vx-300 NMR（300 MHz）磁共振儀上使用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法對溶液中質(zhì)子的自旋-晶格弛豫時間T1進行測定，并計算得出弛豫率R1.

2.5配體及釓配合物在水溶液中的粒徑和Zeta電位的測定

將配體APTSPP-Dextran-DTPA和釓配合物APTSPP-Dextran-DTPA-Gd配成0.001mg/L、0.000 1 mg/L及0.000 01 mg/L三種不同質(zhì)量濃度的水溶液.然后在PSS NICOMP380型粒徑儀上測定其粒徑分布和Zeta電位.

采用3.0T磁共振成像儀對右側(cè)大腿肌肉種植VX2腫瘤轉(zhuǎn)移模型的新西蘭大白兔（體重為2.0 kg～3.0 kg）進行磁共振成像測試.其測量參數(shù)為：表面線圈內(nèi)徑為12.7 cm；視野（FOV）為14 cm×14 cm；激勵次數(shù)為2～4；層厚為5 mm；掃描矩陣為332×332；測量信號強度感興趣區(qū)（ROI）設(shè)為20 mm2.成像序列：自旋回波（SE）脈沖序列為T1WI，重復(fù)時間（TR）為400.0 ms，回波時間（TE）為17.9 ms，反轉(zhuǎn)角為90°.

3　結(jié)果與討論

3.1大分子配體及釓配合物的結(jié)構(gòu)表征

Dextran-DTPA與APTSPP-Dextran-DTPA的FT-IR圖譜對比見圖2.在1 730 cm-1處的峰消失，變成1 640 cm-1處的一個寬峰，葡聚糖配體上的羰基峰向低波數(shù)方向移動.釓配合物APTSPPDextran-DTPA-Gd在紫外可見光區(qū)有一個很強的吸收帶（Soret帶）以及4個較弱的吸收帶（Q帶）. Soret帶吸收峰位于416 nm處；Q帶歸吸收峰值分別為519 nm、560 nm、590 nm、648 nm.APTSPPDextran-DTPA-Gd的紫外圖譜見圖3，與純APTSPP的紫外圖譜對比，APTSPP-Dextran-DTPA-Gd的紫外吸收峰紅移.

圖2?。╝）Dextran-DTPA與（b）APTSPP-Dextran-DTPA的FT-IR圖譜Fig.2FT-IR spectra of（a）Dextran-DTPA and（b）APTSPP-Dextran-DTPA

取適量配體APTSPP-Dextran-DTPA，以氘代DMSO作溶劑，在Varina Mercury VX-300型核磁共振儀上測得配體的核磁圖譜，其核磁共振氫譜見圖4.其核磁共振吸收峰數(shù)據(jù)及其歸屬為：1H NMR（DMSO-d6，δ，ppm）：8.93（br，2H，b-pyrrole），8.83（br，6H，b-pyrrole），8.17（m，6H，orthotriphyenyl），8.06（m，6H，metatriphyenyl），7.94（br，2H，4-amionphenyl），7.05（br，2H， 4-amionphenyl），4.69（1H，C6H4-NH），4.51（2H，-NH-CH2），2.39（2H，CH2-N），1.23（2H，CH2-CH2O），-2.88（s，2H，pyrrole）.由此可進一步證明，APTSPP已成功鍵接接枝到了葡聚糖大分子上.根據(jù)葡聚糖單元結(jié)構(gòu)上H吸收峰的積分面積與5-（4-氨基苯基）-10，15，20-三（4-磺酸苯基）卟啉鈉上氫吸收峰的積分面積之比，可計算得到APTSPP的單元摩爾接枝率為8.14%.

圖3　APTSPP-Dextran-DTPA-Gd的UV-Vis譜圖Fig.3UV-Vis spectrum of APTSPP-Dextran-DTPA-Gd

圖4　APTSPP-Dextran-DTPA的1H NMR譜圖Fig.41H NMR spectrum of APTSPP-Dextran-DTPA

3.2釓配合物中Gd3+含量的測定及DTPA接枝率的計算

首先按照理論上配制質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的大分子釓配合物溶液，然后用等離子體發(fā)射光譜測定溶液中Gd3+的含量（0.68 mmol·g-1），再根據(jù)Gd3+與DTPA以摩爾比1∶1進行配合作用的關(guān)系計算出DTPA在Dextran側(cè)鏈中的單元摩爾接枝率為14.68%.

3.3釓配合物弛豫率的測定

釓配合物弛豫率的測定如圖5所示，X軸為水溶液中配合物的摩爾濃度，Y軸為弛豫時間T1的倒數(shù)，即弛豫速率，單位為s-1.隨著配合物摩爾濃度C的變化，弛豫速率A（即溶劑水分子中質(zhì)子的弛豫速率）變化顯著.經(jīng)公式計算得到，APTSPPDextran-DTPA-Gd的弛豫率為8.01 mmol-1·L·s-1，該計算值高于同等條件下測得的Gd-DTPA的弛豫率（3.63 mmol-1·L·s-1）.

圖5　APTSPP-Dextran-DTPA-Gd溶液中水分子氫核的弛豫性能Fig.5Relaxation properties of water molecules in APTSPP-Dextran-DTPA-Gd aqueous solution

圖6　APTSPP-Dextran-DTPA-Gd在水溶液中的（a，b，c）粒徑分布和（d）Zeta電位圖Fig.6（a，b and c）Particle size distribution and（d）Zeta potential of APTSPP-Dextran-DTPA-Gd in aqueous solution

3.4釓配合物在水溶液中的粒徑和Zeta電位分析

釓配合物在水溶液中的粒徑和Zeta電位分析見圖6.APTSPP-Dextran-DTPA-Gd質(zhì)量濃度為0.001 g/mL時，平均粒徑為138 nm，如圖6（a）所示；質(zhì)量濃度為0.000 1 g/mL時，其平均粒徑為223 nm，如圖6（b）所示；質(zhì)量濃度為0.000 01 g/mL時，其平均粒徑為280 nm，如圖6（c）所示；釓配合物APTSPP-Dextran-DTPA-Gd電位呈電中性如圖6（d）所示.

3.5APTSPP-dextran-DTPA-Gd的MRI成像

新西蘭大白兔注射造影劑APTSPP-Dextran-DTPA-Gd溶液（Gd注射劑量為0.004 mmol/kg）之前和注射30 min之后的后大腿腫瘤的磁共振成像如圖7所示，APTSPP-Dextran-DTPA-Gd能提高VX2腫瘤組織的成像對比度與清晰度.APTSPP-Dextran-DTPA-Gd能在卟啉APTSPP基團對腫瘤組織的特異親和性的作用下，主動進入腫瘤組織內(nèi)部，因此APTSPP-Dextran-DTPA-Gd對腫瘤的成像性能增強較明顯.

圖7　新西蘭大白兔（a）注射造影劑APTSPP-Dextran-DTPA-Gd溶液之前和（b）注射30 min之后的后大腿腫瘤的磁共振成像（Gd注射劑量為0.004 mmol/kg）Fig.7MR images of VX2 tumors in the thigh muscles of rabbit（a）before and（b）after 30 min receiving APTSPP-Dextran-DTPA-Gd injection at Gd dosage of 0.004 mmol/kg

4　結(jié)語

水溶性卟啉化合物對腫瘤細胞具有較好的親和性，可被腫瘤組織選擇性攝取.本文以卟啉化合物作為腫瘤靶向基團，以葡聚糖作為大分子載體，成功合成了腫瘤靶向性大分子磁共振成像造影劑APTSSP-Dextran-DTPA-Gd，并進行了結(jié)構(gòu)表征及體內(nèi)外性能研究.研究結(jié)果表明，這種造影劑具有較高的弛豫率，對VX2腫瘤有良好的磁共振成像性能，能提高磁共振成像的對比度與清晰度，有望用于臨床腫瘤的MRI靶向檢測與診斷.

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本文編輯：張瑞

Dextran Gadolinium Complex Containing Porphyrin Groups for Using as Potential Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent

KE Xijun,LIU Fan,XU Qiongnan,YAN Guoping*,HAN Lin,TU Yuanyuan,JIANG Can,
ZHENG Huaming,PENG Yongli,YANG Jun School of Materials Science and Engineering,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China

The macromolecular ligand containing porphyrin groups（APTSPP-Dextran-DTPA）were synthesized by the incorporation of water-soluble 5-（4′-aminophenyl）-10,15,20-tris（4′-sulfonatophenyl）porphyrin trisodium salt（APTSPP）and diethylenetriamine-pentaacetic acid（DTPA）to dextran.Dextran gadolinium complex APTSPP-Dextran-DTPA-Gd was further prepared by the reaction of APTSPP-Dextran-DTPA.The ligand and gadolinium complex was characterized by Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy,and Ultraviolet spectroscopy.The relaxivity,magnetic resonance imaging,average particle sizes and Zeta potential were evaluated in vitro and in vivo.Compared with Gd-DTPA,the dextran gadolinium complex APTSPP-Dextran-DTPA-Gd shows high relaxation effectiveness and good imaging performance,which improves the contrast and resolution of magnetic resonance imaging.

magnetic resonance imaging；contrast agent；gadolinium diethylenetriamine-pentaacetic acid；tumor-targeting；porphyrin；dextran

R445.2

A

10.3969/j.issn.1674?2869.2016.05.005

1674-2869（2016）05-0436-06

2016-05-15

國家自然科學(xué)基金（51373128，51173140）；武漢市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃項目（2015070504020217）；武漢市科技計劃項目（2013010501010131）；武漢工程大學(xué)研究生教育創(chuàng)新基金項目（CX2015007，CX2014058）；武漢工程大學(xué)第十期大學(xué)生校長基金項目（2015004）

柯希駿，碩士研究生.E-mail：kxj258@qq.com

鄢國平，博士，教授.E-mail：guopyan2006@163.com