不同環(huán)境來源的洋蔥伯克氏菌對人體健康的風(fēng)險(xiǎn)評估*

方 媛， 李 璇， 黃旭倩

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

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不同環(huán)境來源的洋蔥伯克氏菌對人體健康的風(fēng)險(xiǎn)評估*

方 媛， 李 璇， 黃旭倩

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

對來源于不同環(huán)境的41株洋蔥伯克氏菌進(jìn)行了毒力基因檢測及致病性研究.4個(gè)毒力基因(BCESM，cblA，cepR和cepI)被從數(shù)量不等的菌株中擴(kuò)增到，從而認(rèn)定了10個(gè)風(fēng)險(xiǎn)性較高的菌株；通過苜蓿和生菜模型致病性測定，發(fā)現(xiàn)不同來源的很多菌株表現(xiàn)出對苜蓿和生菜不同程度的致病力.所研究的洋蔥伯克氏菌株大部分被認(rèn)定對人體健康存在風(fēng)險(xiǎn).

洋蔥伯克氏菌；人體條件致病菌；毒力；致病性；風(fēng)險(xiǎn)分析

洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacepacia)是引起洋蔥酸皮病的病原細(xì)菌，但后來發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌具有不尋常的多樣性，至今已發(fā)現(xiàn)17個(gè)不同的基因型,并建立了不同的新種，又稱之為洋蔥伯克氏菌群(Burkholderiacepaciacomplex)，簡稱Bcc[1].

洋蔥伯克氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于水體、植物根圍土壤、醫(yī)院等環(huán)境中，在環(huán)境中發(fā)揮了重要的作用，不僅能降解土壤中的殘留農(nóng)藥、凈化污水，還可以促進(jìn)植物生長，抑制植物病原微生物生長.作為植物根圍促生細(xì)菌，能顯著促進(jìn)玉米、小麥和水稻等農(nóng)作物生長并提高其產(chǎn)量.但同時(shí)，洋蔥伯克氏菌又是一類人體條件致病菌、植物冰核細(xì)菌、植物致病菌，存在極大的變異潛能[2].洋蔥伯克氏菌在醫(yī)院環(huán)境中常污染自來水、體溫表、噴霧器、血管、導(dǎo)尿管和靜脈輸液劑等，可引起多種感染病，如敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎和傷口感染[3]；更為嚴(yán)重的是，還可使感染囊性肺纖維化(cystic fibrosis，CF)患者引起“洋蔥伯克氏綜合癥”，死亡率增加10%左右，甚至致死[4].洋蔥伯克氏菌于20世紀(jì)90年代曾在英國、加拿大等囊性肺纖維化病人中傳播并大面積流行，導(dǎo)致多人死亡.在我國也有洋蔥伯克氏菌引起醫(yī)院病人感染的相關(guān)報(bào)道，且近年來呈上升趨勢[5-9].隨著各基因型被從病人體內(nèi)和自然環(huán)境中分離得到，很多研究者認(rèn)為，自然環(huán)境對醫(yī)學(xué)致病菌發(fā)揮著“天然儲存庫”的功能[2].洋蔥伯克氏菌一些毒力因子及致病基因不斷被發(fā)掘出來，目前已發(fā)現(xiàn)4個(gè)與致病性相關(guān)的基因，即BCESM，cblA，cepR和cepI基因[10-13].關(guān)于洋蔥伯克氏菌不同種的感染性和致病性的研究在各種致病模型上廣泛展開，其中小鼠、線蟲、蠟蛾幼蟲及生菜葉梗、擬南芥、苜蓿都是研究洋蔥伯克氏菌致病性的主要致病模型[14-18]，但在一定程度上存在差異性.

洋蔥伯克氏菌作為有益菌在農(nóng)業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景，但作為植物致病菌和人體條件致病菌，應(yīng)用不當(dāng)會給農(nóng)作物生產(chǎn)和人體健康帶來極大的影響.因此，本文根據(jù)對洋蔥伯克氏菌致病基因的分子生物學(xué)檢測，并結(jié)合該菌群在苜蓿和生菜葉梗模型上的毒力測定，從而評估了這些菌株是否對人體健康存在潛在的威脅.這對于洋蔥伯克氏菌株的安全應(yīng)用具有重大意義.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用的菌株為實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的41株洋蔥伯克氏菌，分別來源于醫(yī)院、植物根圍土壤、水體及植物病原菌，具體見表1.

1.2.1 PCR擴(kuò)增

對所有供試菌株分別進(jìn)行了4個(gè)毒力基因(即:BCESM，cblA，cepI和cepR)的檢測.

表1 供試洋蔥伯克氏菌代表性菌株

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括1×PCR緩沖液(含2 mmol/L MgCl2)，2 U Taq DNA聚合酶，200 μmol/L dNTP，8 pmol引物，2 μL DNA提取液.BCESM和cblA擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)[10-11].cepI和cepR擴(kuò)增引物自己設(shè)計(jì)，cepI-F：5′-TCACGAGGAAGGGCGGTTGC-3′，cepI-R：5′-CGAACGTCACGCCGATCAACT-3′，長度為418 bp；cepR-F：5′-GTACCGCTGCCCGTTTCGA-3′，cepR-R：5′-CGACCGCCTGGACCTTGTT-3′，長度為540 bp.所有基因的特異性引物由上海英俊生物公司合成.

PCR擴(kuò)增在BIO-RAD C1000擴(kuò)增儀上進(jìn)行.反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min后94 ℃ 1 min，63 ℃(BCESM)/60 ℃(cblA)/61 ℃(cepI)/62 ℃(cepR)退火1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.2 基因克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接和轉(zhuǎn)化，通過篩選得到重組質(zhì)粒(試劑及步驟由Axygen試劑盒提供).將所獲得的重組質(zhì)粒送上海英俊生物公司測序，獲得的基因序列通過BLAST搜索和比對，以驗(yàn)證毒力基因的正確性.

1.3 洋蔥伯克氏菌在苜蓿模型上的毒力研究

基于以上種種現(xiàn)實(shí)窘境，現(xiàn)在的我對交朋友這種事情已經(jīng)越來越?jīng)]有興趣，就像朱文的小說《我們的牙，我們的愛情》里寫的那樣：“我還是決定今后不再結(jié)交新朋友了。我要把現(xiàn)在的朋友都變成老朋友，把現(xiàn)在的老朋友都變成更為醇厚的陳年老釀，供我在歲月的角落里時(shí)不時(shí)地獨(dú)自抿上一小口，這樣就夠了?！?/p>

將過夜培養(yǎng)洋蔥伯克氏菌懸液用針刺方式對苜蓿幼苗進(jìn)行接種，具體步驟見文獻(xiàn)[17].

1.4 洋蔥伯克氏菌在生菜模型上的毒力研究

取新鮮且消毒的生菜葉片，將過夜培養(yǎng)洋蔥伯克氏菌懸液接種于生菜葉梗經(jīng)針刺而產(chǎn)生傷口的部位，具體步驟見文獻(xiàn)[18].

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)毒力基因的檢測

2.1.1 毒力基因BCESM的檢測和驗(yàn)證

對41株待測洋蔥伯克氏菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，A8，Y5，279，292，227和317這6個(gè)菌株在1 418 bp處有清晰條帶，如圖1所示.其中，Y5和A8的測序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因片段均與B.cenocepacia流行性菌株標(biāo)記(BCESM)表現(xiàn)出98%的相似性，充分驗(yàn)證了這6個(gè)菌株中存在毒力基因BCESM.

有研究表明，BCESM基因與洋蔥伯克氏菌的流行性密切相關(guān)[10]，暗示了這6個(gè)菌株的風(fēng)險(xiǎn)性較高.本研究在來源于醫(yī)院、水和土壤的洋蔥伯克氏菌株中均檢測到了BCESM毒力基因，這一發(fā)現(xiàn)與前人的研究結(jié)果[10]一致，進(jìn)一步支持了“自然環(huán)境是醫(yī)院致病菌的天然儲存庫”的觀點(diǎn).

M：DL2000 marker;1-21：Y3，Y4，A8，PE27，Y5，301，J5，Y7，Y20，LMG1222，Y10，279，Y16，292，227，317，Y17，Y2，Y12，Y14圖1 洋蔥伯克氏菌致病基因BCESM的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.1.2 毒力基因cblA的檢測和驗(yàn)證

對41株待測洋蔥伯克氏菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明所有菌株在555 bp處均未產(chǎn)生清晰條帶，說明這些菌株不存在毒力基因cblA.cblA基因在基因組中發(fā)揮著編碼洋蔥伯克氏菌鞭毛蛋白亞基的功能，由它編碼的鞭毛被稱為“天線鞭毛”，可使菌體黏附于呼吸器官[11].無cblA基因的菌株被認(rèn)為難以黏附人體，從而缺乏致病力.因此，本研究未發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)黏附能力的菌株.

2.1.3 毒力基因cepI和cepR的檢測和驗(yàn)證

對41株待測洋蔥伯克氏菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，有35個(gè)菌株(LMG1222，Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y14，Y17，Y20，J5，292，297，301，318，317，A8，CK-5，R456，TG68，PG11，Bca0902，S9，PW26，PW99，PG56，Bca0901，TG40和PW61)在418 bp處有清晰條帶(見圖2).Y1，Y20和J5的測序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對，與數(shù)據(jù)庫中洋蔥伯克氏菌的cepI基因相似性都在97%以上，說明這35個(gè)菌株含有毒力基因cepI.

M：DL5000 marker;1-20：PW99，318，Y6，M8，PG56，Y8，Bca0901，TG40，PW61，Y1，CK-5，Y9，R456，TG68，PG11，Bca0902，Y11，S9，Y10，PW26圖2 洋蔥伯克氏菌致病基因cepI的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

對41株洋蔥伯克氏菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，318，M8，PG11，PW61和TG68這5個(gè)菌株在540 bp處有清晰條帶(見圖3).318和PG11的測序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對，與數(shù)據(jù)庫中洋蔥伯克氏菌的cepR基因的相似性在87%以上，說明這5個(gè)菌株含有毒力基因cepR.

cepI基因和cepR基因被認(rèn)為與細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)有關(guān).群體感應(yīng)系統(tǒng)由一個(gè)AHL合成酶和一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子組成，cepI編碼AHL合成酶，cepR能夠編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子[12].具有群體感應(yīng)功能的細(xì)菌能大量富集從而產(chǎn)生眾多胞外毒素，因此，群體感應(yīng)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)是很多革蘭氏陰性細(xì)菌的毒力因子，如Pseudomonasaeruginosa[12].有研究表明，洋蔥伯克氏菌株的cepR突變體在BHI培養(yǎng)基上不具備產(chǎn)蛋白酶的活性，并且酯酶的活性也降低了45%[12]，例如cepI突變體菌株對洋蔥的致病性大大降低[13]，充分說明這2個(gè)基因和洋蔥伯克氏菌的致病性相關(guān).本研究從35個(gè)供試菌株中檢測出cepI基因；從5株供試菌株中檢測出cepR基因；從318，PG11，PW61和TG68菌株中同時(shí)檢出cepI和cepR基因，因此，這4個(gè)洋蔥伯克氏菌株具備產(chǎn)生毒性和致病性的能力，為高風(fēng)險(xiǎn)性菌株.

M：DL5000 marker;1-20：CK-5，Y8，M8，PW99，PG11，PW61，PW26，PG56，TG68，TG40，Y1，Y6，Y11，Bca0901，Bca0902，318，Y9，R456，S9，J100圖3 洋蔥伯克氏菌致病基因cepR的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 洋蔥伯克氏菌對苜蓿幼苗的毒力表現(xiàn)

苜蓿幼苗接種細(xì)菌7 d后，發(fā)病的幼苗表現(xiàn)出接種點(diǎn)周圍黃化、長斑和萎蔫的癥狀，而對照和不發(fā)病的幼苗則表現(xiàn)出良好的健康狀態(tài).通過對不同來源的菌株在苜蓿幼苗上的毒力觀察，大部分菌株，包括來源于醫(yī)院的Y8，Y10，Y5，Y17，Y12，Y14，Y11，Y2和Y16菌株，來源于土壤的292，318，301，317，297和227菌株，來源于水中的A8，J5，PW26，PW56，S9，PG11，PW99，M8和PW61菌株，以及來源于植物病原菌中的LMG1222和Bca0902菌株，都表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性，使苜蓿幼苗萎蔫、子葉蜷縮，接種針刺周圍枯黃(見圖4中b)，甚至出現(xiàn)病斑(見圖4中c).僅來源于醫(yī)院的Y4菌株、來源于水中的CK-5菌株和來源于植物病原菌的Bca0901菌株對苜蓿幼苗的致病性較弱，或者沒有致病性(見圖4中d).

a：接種生理鹽水的陰性對照；b：接種301的幼苗；c：接種Y11的幼苗；d：接種Y4的幼苗圖4 洋蔥伯克氏菌株在苜蓿幼苗上的致病癥狀

當(dāng)前，植物侵染模型被認(rèn)為是一種有效的研究動(dòng)物致病細(xì)菌的分子致病機(jī)制的手段，采用植物模型和動(dòng)物致病細(xì)菌的突變體可以較容易地篩選病菌的毒力因子[19].近年來有研究通過比較相同洋蔥伯克氏菌致病菌在苜蓿模型和瓊脂珠大鼠模型的毒力，表明苜?？梢宰鳛樵u估洋蔥伯克氏菌毒力因子侵染的模型[17].由此推斷，本研究中能引起苜蓿發(fā)病的菌株均能產(chǎn)生導(dǎo)致人類致病的相關(guān)毒力因子，為風(fēng)險(xiǎn)性菌株.

2.3 洋蔥伯克氏菌對生菜葉片的毒力表現(xiàn)

本實(shí)驗(yàn)對37個(gè)洋蔥伯克氏菌株進(jìn)行了生菜葉片的毒力測定，其中：15株來源于醫(yī)院，8株來源于土壤根圍，11株來源于水體，3株為植物病原菌.

生菜接種洋蔥伯克氏菌4 d后，葉片接種區(qū)域大部分出現(xiàn)不同程度的褐色水漬狀病斑.以接種生理鹽水作為陰性對照，根據(jù)生菜葉梗的潰爛斑，可將洋蔥伯克氏菌對生菜的致病性分為嚴(yán)重致病、中等致病、輕微致病及不致病4個(gè)等級.嚴(yán)重致病是指細(xì)菌接種于生菜4 d后形成面積較大的褐色斑塊(見圖5中d)；中等致病的菌株接種于生菜4 d后，接種部位變褐且褐斑輕微擴(kuò)散(見圖5中c)；輕微致病的菌株可使接種部位變褐，但褐斑不擴(kuò)展(見圖5中b)；不致病菌株接種后接種部位不變色(見圖5中a).

a：接種生理鹽水的陰性對照；b：輕微致病癥狀；c：中等致病癥狀；d：嚴(yán)重致病癥狀圖5 洋蔥伯克氏菌株在生菜葉片上的致病癥狀

醫(yī)院來源的15個(gè)洋蔥伯克氏菌株中：Y9，Y1，Y5，Y14，Y4，Y12，Y2和Y20表現(xiàn)出強(qiáng)致病毒力，生菜接種部位在接種后形成面積較大的褐色水漬狀斑；Y10和Y3在生菜上表現(xiàn)為中等毒力，即接種于生菜4 d后，接種部位變褐且水漬狀褐斑有輕微擴(kuò)散現(xiàn)象；Y11株對生菜輕微致病，可使接種部位變褐，但褐斑不擴(kuò)展；Y17，Y16，Y8和Y6對生菜不致病.

根圍土壤來源的8個(gè)洋蔥伯克氏菌株中：279對生菜表現(xiàn)強(qiáng)致病性，在接種于生菜葉片4 d后形成面積較大的褐色水漬狀斑；301，318和227在生菜上表現(xiàn)為中等致病性，接種部位出現(xiàn)水漬狀褐斑且輕微擴(kuò)散；317，R456，297和292對生菜有輕微致病性，接種部位雖變褐，但褐斑不擴(kuò)展.

水體來源的11個(gè)洋蔥伯克氏菌株中：PG11，PG56，PW61和J100對生菜致病毒力強(qiáng)；M8和A8在生菜葉片上的毒力表現(xiàn)為中等；其余洋蔥伯克氏菌株J5，PW99，S9，PW26和CK-5對生菜無致病毒力.

作為植物病原菌的3個(gè)洋蔥伯克氏菌株中：LMG1222表現(xiàn)為對生菜的強(qiáng)致病毒力菌株，生菜接種后產(chǎn)生較大褐色水漬狀斑；Bca0901表現(xiàn)為對生菜的中等毒力菌株；僅Bca0902在接種于生菜4 d后，葉片上無褐色病斑出現(xiàn)，即表現(xiàn)為對生菜不具有致病性.

Ibrahim等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，采用生菜葉梗模型及擬南芥模型與大鼠模型的結(jié)果高度一致，并且生菜葉梗模型操作方便，適用于大規(guī)模洋蔥伯克氏菌株致病力的評估.因此，生菜葉梗模型可取代苜蓿作為新的植物侵染模型.本研究結(jié)果表明，任何來源的洋蔥伯克氏菌株都有對人體致病的風(fēng)險(xiǎn).所有檢測菌株中，73%的菌株表現(xiàn)出對生菜不同程度的致病毒力.其中：來源于醫(yī)院、土壤根圍的菌株具有嚴(yán)重致病性的比例較大，分別為53.3%和50.0%；相比較其他3種來源的菌株，從水體中分離得到的洋蔥伯克氏菌株具有嚴(yán)重致病性的菌株比例較低；3株植物病原菌中也有2株在生菜模型上顯示出毒力，說明植物病原菌也對人類健康存在風(fēng)險(xiǎn)，這一發(fā)現(xiàn)也支持了文獻(xiàn)[20]的研究結(jié)果，該研究中發(fā)現(xiàn)醫(yī)學(xué)強(qiáng)致病菌B.cenocepacia能引起香蕉尖腐病.不過，由于本實(shí)驗(yàn)中樣本數(shù)量有限，也無法具體說明哪種來源的洋蔥伯克氏菌對人體健康的風(fēng)險(xiǎn)相對較高或者較低.

3 結(jié) 論

1)在所研究的41株洋蔥伯克氏菌中，有6個(gè)菌株(A8，Y5，279，292，227和317)檢出毒力基因BCESM，4個(gè)菌株(318，PG11，PW61和TG68)同時(shí)檢出毒力基因cepI和cepR，但是它們之間并不重合，即共有10個(gè)菌株為高風(fēng)險(xiǎn)性的洋蔥伯克氏菌.

2)在洋蔥伯克氏菌對苜蓿幼苗的毒力表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)來源于醫(yī)院的Y8，Y10，Y5，Y17，Y12，Y14，Y11，Y2和Y16，源于土壤的292，318，301，317，297和227，來源于水中的A8，J5，PW26，PW56，S9，PG11，PW99，M8和PW61，以及來源于植物病原菌的LMG1222和Bca0902，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性，促使苜蓿幼苗萎蔫、子葉蜷縮，接種針刺周圍枯黃，甚至長斑.這些菌株均對致病模型有致病性，說明都具有一定的風(fēng)險(xiǎn).

3)在洋蔥伯克氏菌對生菜葉片的毒力測定實(shí)驗(yàn)中，不同來源的菌株皆表現(xiàn)出對生菜有不同程度的致病力，其中來源于醫(yī)院的Y9，Y1，Y5，Y14，Y4，Y12，Y2和Y20，來源于土壤根圍的279，來源于水中的PG11，PG56，PW61和J100，以及洋蔥病原菌LMG1222，均表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性.說明這些洋蔥伯克氏菌對人體健康的風(fēng)險(xiǎn)都比較高.

本研究表明，環(huán)境中分離到的洋蔥伯克氏菌大部分都是風(fēng)險(xiǎn)菌株.因此，從人體健康安全角度出發(fā)，不建議繼續(xù)利用洋蔥伯克氏菌活菌.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

The risk assessment about different environmental sources ofBurkholderiacepaciabacteria on human health

FANG Yuan, LI Xuan, HUANG Xuqian

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

The risks of forty-oneBurkholderiacepacia(Bcc) strains isolated from different environmental sources had been assessed through detection of virulence genes and research on pathogenic model. There were four virulence genes (BCESM,cblA,cepR andcepI) been detected from a variable number of strains, 10 of them were identified as high-risk strains. In addition, most of strains of different sources showed different degrees of virulence on alfalfa and lettuce. Therefore, most Bcc strains were considered as risky strains to human health.

Burkholderiacepacia; opportunistic human pathogen; virulence; pathogenicity; risk analysis

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.04.012

2016-03-07；

2016-03-15

浙江省重中之重學(xué)科“生物學(xué)”開放基金資助項(xiàng)目(ZC323015001)

方 媛(1983-)，女,湖北宜昌人,博士.研究方向:植物病理學(xué).

Q945.8

A

1001-5051(2016)04-0430-06