RP—HPLC同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地太白貝母中9種核苷類成分的含量

羅靜 張華 張德全 楊絲絲 周濃

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地太白貝母中9種核苷類成分（尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2'-脫氧腺苷）含量的方法，并比較不同產(chǎn)地太白貝母中核苷類成分含量。方法 采用Venusil MP C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為甲醇和水，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果 尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、2'-脫氧腺苷的線性范圍分別為0.269 5～16.17 ?g/mL、0.132 1～7.927 5 ?g/mL、0.095 5～5.73 ?g/mL、1.16～69.6 ?g/mL、0.48～28.8 ?g/mL、0.571 5～57.15 ?g/mL、0.526～52.6 ?g/mL、3.307 5～198.45 ?g/mL、0.530 5～31.83 ?g/mL，r≥0.999 5；加樣回收率為96.49%～101.65%（RSD≤2.92%）。結(jié)論 不同產(chǎn)地太白貝母中9種核苷類成分含量存在差異，栽培品和多年生野生品均以重慶市城口縣咸宜鄉(xiāng)樣品含量最高。本研究建立的方法可為太白貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：太白貝母；反相高效液相色譜法；水溶性成分；核苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.025

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）09-0106-04

Simultaneous Determination of Nine Nucleosides in Fritillaria taipaiensis P. Y. Li from Different Producing Areas by RP-HPLC LUO Jing1， ZHANG Hua2， ZHANG De-quan3， YANG Si-si2， ZHOU Nong2，3 （1. Chongqing Institute for Food and Drug Control， Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control， Chongqing 401121， China； 2. College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404000， China； 3. College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali 671000， China）

Abstract： Objective To develop a sensitive and reliable RP-HPLC method for the simultaneous determination of nine nucleosides including uracil， cytidine， guanine， uridine， adenine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine from Fritillaria taipaiensis P. Y. Li that had been cultivated in different producing areas； To compare the contents of these nucleosides from different producing areas. Methods The analysis was performed on a Venusil MP C18 （2） column （4.6 mm×250 mm， 5 ?m） with a gradient of methanol-water at a flow rate of 1.0 mL/min； the detective wavelength was set at 260 nm； the column temperature was set at 35 ℃. Results Uracil， cytidine， guanine， uridine， adenine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine were obtained in the good linear range of 0.269 5–16.17 ?g/mL， 0.132 1–7.927 5 ?g/mL， 0.095 5–5.73 ?g/mL， 1.16–69.6 ?g/mL， 0.48–28.8 ?g/mL， 0.571 5–57.15 ?g/mL， 0.526–52.6 ?g/mL， 3.307 5–198.45 ?g/mL， 0.530 5–31.83 ?g/mL， respectively （r≥0.999 5）； the recovery was in the range of 96.49%–101.65% （RSD≤2.92%）. Conclusion The contents of the nine nucleosides from different producing areas have differences. Fritillaria taipaiensis P. Y. Li from Xianyi Village， Chengkou County， Chongqing City， whether the cultivated ones or wild ones， contain the highest level of nucleosides. The established method can provide references for the perfection of quality standard for Fritillaria taipaiensis P. Y. Li.

Key words： Fritillaria taipaiensis P. Y. Li； RP-HPLC； water-soluble components； nucleosides

太白貝母為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》川貝母項(xiàng)下品種之一，為百合科貝母屬太白貝母Fritillaria taipaiensis P. Y. Li的干燥鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳、散結(jié)消癰的功效[1]。據(jù)文獻(xiàn)記載，太白貝母在民間作為川貝母使用有著悠久的藥用歷史，并被四川、甘肅、寧夏等多地中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載作川貝母使用[2]。

太白貝母的主要活性成分為生物堿、皂苷、水溶性成分等[3]，貝母的水溶性成分具有抗炎、抑制血小板凝聚、降壓、松弛平滑肌等作用[4-5]。貝母的水溶性活性成分主要為核苷類[6-7]，現(xiàn)有研究多針對(duì)核苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定[6-9]。本研究對(duì)太白貝母主產(chǎn)區(qū)（重慶市巫溪縣、城口縣和陜西太白縣[10]）采集的14批不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行9種核苷類成分的含量比較分析，考察不同產(chǎn)地間太白貝母核苷類成分的含量差異，以全面掌握太白貝母的資源狀況，為貝母藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)，同時(shí)為篩選優(yōu)勢(shì)種質(zhì)資源提高人工栽培質(zhì)量以實(shí)現(xiàn)太白貝母野生藥材保護(hù)和資源可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters 2695 HPLC儀，包括真空在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器和Empower工作站（美國(guó)Waters）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SARTORIUS BP221S型電子天平（德國(guó)賽多利斯），METTLER TOLEDO Ax205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

14批不同生長(zhǎng)年限太白貝母樣品于2013年6月間分別采自重慶市、陜西省的不同地區(qū)，經(jīng)重慶三峽學(xué)院周濃副教授鑒定為百合科植物太白貝母Fritillaria taipaiensis P. Y. Li的干燥鱗莖。尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100469-200401、140631- 201205、110887-200202、886-200001、101215-201401、110879-200202），胞苷、鳥(niǎo)苷、2'-脫氧腺苷對(duì)照品（南京都萊生物技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算純度>98%）。甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取上述9種核苷類對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含尿嘧啶107.8 ?g、胞苷52.85 ?g、鳥(niǎo)嘌呤38.2 ?g、尿苷464.0 ?g、腺嘌呤96.0 ?g、鳥(niǎo)苷228.6 ?g、胸苷105.2 ?g、腺苷1323.0 ?g、2'-脫氧腺苷106.1 ?g的對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，混勻，室溫超聲提取60 min（功率300 W，頻率40 kHz），放至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用0. 45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，各相鄰色譜峰之間分離度均>1.5，理論塔板數(shù)均不低于5 000，對(duì)照品及供試品中9種核苷類成分基線分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液適量，用水稀釋成7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一濃度的混合對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷RSD分別為0.64%、0.67%、1.95%、0.76%、0.97%、1.57%、0.82%、1.53%、1.12%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地樣品（S9），按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定9個(gè)核苷類成分含量，結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷RSD分別為1.98%、1.54%、2.96%、1.65%、2.50%、1.82%、2.75%、1.86%、2.32%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S9），分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷峰面積RSD分別為1.72%、1.16%、2.86%、2.10%、2.43%、1.51%、1.38%、2.66%、2.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的太白貝母樣品（S9）共6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取14批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算各產(chǎn)地樣品中9種核苷類成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

供試品溶液的制備比較了回流和超聲2種方法，結(jié)果超聲提取法提取率顯著高于回流提取法；由于核苷類物質(zhì)極性大，且尿嘧啶、尿苷等在有機(jī)溶劑中溶解性差，分別以純水及不同濃度甲醇（5%、10%、20%、30%、50%）為提取溶劑，考察不同的提取時(shí)間（30、60、90、120 min）及提取溶劑用量（10、20、30倍），結(jié)果以10倍純水為溶劑、超聲60 min提取率最高；另外，試驗(yàn)比較了甲醇和乙腈洗脫，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水梯度洗脫所得到色譜分離效果最佳。

本試驗(yàn)測(cè)定的14批太白貝母樣品均含有尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷和2'-脫氧腺苷，其中以尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷含量相對(duì)較高，與黃氏等[6]對(duì)太白貝母水溶性成分研究結(jié)果一致，建議可增加尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷含量測(cè)定項(xiàng)以完善川貝母（太白貝母）質(zhì)量控制。14批樣品中，栽培品核苷類成分總含量水平整體上隨生長(zhǎng)年限增加而呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，野生品總含量水平呈現(xiàn)隨生長(zhǎng)年限增加而減小的趨勢(shì)，這與PENG等[8]研究結(jié)果一致，但栽培品中腺苷、鳥(niǎo)苷含量呈現(xiàn)隨生長(zhǎng)年限增加而增加的趨勢(shì)，說(shuō)明太白貝母不同生長(zhǎng)年限對(duì)其不同種類核苷類成分的含量影響不同，有待進(jìn)一步深入研究。太白貝母野生品中核苷類成分總含量水平高于栽培品，表明目前太白貝母的人工種植雖然已形成一定種植規(guī)模且有比較成熟的種植技術(shù)，但人工栽培技術(shù)還有待提高，還應(yīng)加大種質(zhì)資源庫(kù)與人工撫育區(qū)建設(shè)。

總之，通過(guò)對(duì)14批不同產(chǎn)地太白貝母核苷類成分含量比較表明，重慶市城口縣咸宜鄉(xiāng)無(wú)論栽培品還是多年生野生品，其核苷類成分總含量皆為最高，提示可在該地種植太白貝母優(yōu)良品種，建立太白貝母GAP生產(chǎn)基地，以滿足臨床用藥和中成藥生產(chǎn)需求。

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