高效液相色譜法測定混合核苷片中四種核苷的含量

王發(fā)，張秉華，王嫦鶴，李繼

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安　710061)

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◇藥物分析◇

高效液相色譜法測定混合核苷片中四種核苷的含量

王發(fā)，張秉華，王嫦鶴，李繼

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安710061)

目的建立高效液相法同時測定混合核苷片中腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷含量的方法。方法采用C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：以0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：260 nm。用保留時間定性，以峰面積按外標(biāo)法定量。結(jié)果四種核苷分離良好，線性關(guān)系良好(r=0.999 6)，平均加樣回收率在98.4%～101.9%， RSD%≤2.7%。結(jié)論本方法簡便、準(zhǔn)確，可用于混合核苷片中四種核苷的定性和定量分析。

色譜法,高壓液相;嘌呤核苷類/分析;嘧啶核苷類/分析

混合核苷片是由腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷組成的復(fù)方制劑，臨床用于急慢性肝炎、肝損傷及肝硬化的輔助治療。也可用于因輻射及放療或化療引起的白細(xì)胞減少癥和非特異性血小板減少癥或白細(xì)胞減少癥[1]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[2]采用紫外分光光度法對制劑中核苷混合物的總量進(jìn)行了控制，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-12]，建立了混合核苷片中腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷的含量測定的高效液相色譜法，實驗結(jié)果表明，本方法簡便、準(zhǔn)確，可用于該品種的質(zhì)量控制。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀：Waters Alliance HT，waters 2478紫外檢測器；賽多利斯BBS-224S型電子分析天平；SCQ-200型超聲波清洗器。

鳥嘌呤核苷(批號：BCBL1474V)購自SIGMA公司，腺嘌呤核苷(批號：122388)、尿嘧啶核苷(批號：1134349)、胞嘧啶核苷(批號：1138698)均購自Aladdin公司，以上對照品純度均≥99.0%，為方便計算，均按100%計算；混合核苷片(A公司，批號：110604，110605，110606)；試劑：磷酸二氫鉀(西安試劑廠)、分析純，甲醇(美國天地公司)、色譜純，高純水。

2　方法

2.1色譜條件色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液為流動相A；甲醇為流動相B，梯度洗脫：0～22 min，99%～99% A，22～25 min，99%～95% A，25～40 min，95%～90% A，40～50 min，90%～90% A，55～55 min，90%～99% A，55～60 min，99%～99% A；檢測波長：260 μm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液

精密稱取胞嘧啶核苷23.34 mg，置于100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為胞嘧啶核苷對照品儲備液。精密稱取鳥嘌呤核苷11.67 mg，腺嘌呤核苷11.37 mg、尿嘧啶核苷11.53 mg，同置于100 mL量瓶中，再精密加入胞嘧啶核苷對照品貯備液10 mL，加水適量溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。

2.2.2供試品溶液

取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.2 g，置100 mL容量瓶中，加入純化水適量，超聲(功率200 W，頻率50 kHz)溶解10 min冷卻至室溫，用水稀釋到刻度，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液

按處方比例制備不含混合核苷的陰性樣品，按供試品溶液項下方法制備相應(yīng)的陰性樣品溶液。

注：1.胞嘧啶核苷;2．尿嘧啶核苷;3．鳥嘌呤核苷;4．腺嘌呤核苷。

3　結(jié)果

3.1方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1線性關(guān)系試驗

精密量取對照品儲備液適量，用水逐步稀釋，得到如下系列濃度對照品混合溶液，鳥嘌呤核苷：116.70、58.35、29.18、11.67、5.84 mg·L-1，腺嘌呤核苷：113.70、56.85、28.42、11.37、5.68 mg·L-1、尿嘧啶核苷：115.30、57.65、28.82、11.53、5.76 mg·L-1、胞嘧啶核苷：23.34、11.67、5.84、2.33、1.17 mg·L-1。精密量取上述溶液各10μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定，以各組分峰面積Y對相應(yīng)濃度X進(jìn)行線性回歸，鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷線性方程分別為Y=52 307.37X-37173.14，r=0.9996；Y=59 490.20X-43724.37，r=0.9996；Y=42 507.77X-34130.45，r=0.9996；Y=26 918.15X-4374.42，r=0.9996。線性范圍分別為：5.84～116.70、5.68～113.70、5.76～115.30、1.17～23.34 mg·L-1。

3.1.2精密度試驗

取鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷濃度分別為29.18、28.42、28.82、5.84 mg·L-1的對照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷峰面積的RSD分別為0.4%、0.3%、0.3%和0.6%。

3.1.3重復(fù)性試驗

取批號為110604的供試品，按供試品溶液制備方法處理6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果鳥嘌呤核苷含量均值為1.64 mg·片-1，RSD為1.1%，腺嘌呤核苷含量均值為2.10 mg·片-1，RSD為1.2%、尿嘧啶核苷含量均值為1.90 mg·片-1，RSD為0.4%、胞嘧啶核苷含量均值為0.71 mg·片-1，RSD為1.4%。

3.1.4穩(wěn)定性試驗

將新配制的供試品溶液，分別于0，1，4，8，10和12 h各進(jìn)樣10 μL，鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷峰面積的RSD分別為0.8%、1.5%、1.2%、1.7%。

3.1.5定量限試驗

取鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷濃度分別為29.18、28.42、28.82、5.84 mg·L-1的對照品混合溶液，逐步稀釋，以按上述色譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，當(dāng)所測組分的信噪比為10∶1時，鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為1.17、1.14、1.15、0.58 mg·L-1。

3.1.6回收率試驗

取批號為110604的樣品，研細(xì)，精密稱定9份，每份約0.15 g，置100 mL容量瓶中，分別加入對照品儲備液各1.0,2.0,3.0 mL，按3.2制備方法制備供試品溶液，測定含量，計算回收率。結(jié)果鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷的回收率分別為99.2%、100.6%、101.9%、98.4%，RSD分別為2.2%、2.7%、2.4%和2.2%。

3.2樣品含量測定取樣品，按供試品溶液制備方法制備樣品，測定含量，結(jié)果見表1。

表1　樣品中4種核苷的含量/mg·片-1

4　討論

4.1提取時間的選擇取同一樣品，分別超聲提取5、10、15 min，測定含量，結(jié)果見表2。由表2可知，10 min后的提取率基本相同，因此提取時間確定為10 min。

表2　同一樣品不同提取時間4種成分含量/mg·片-1

4.2提取溶劑的選擇混合核苷片中鳥嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷四種組分均易溶于水，采用水作提取溶劑，具有干擾小，不污染環(huán)境等優(yōu)點。相比與原標(biāo)準(zhǔn)中使用具有放射性的試劑醋酸氧鈾，更具有保護(hù)檢驗人員健康安全的優(yōu)勢。

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Simultaneous determination of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets by HPLC

WANG Fa1,ZHANG Binghua1,WANG Changhe1,et al

(ShaanxiProvinceInstituteforFoodandDrugControl,Xi’an,Shaanxi710061,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets.MethodsThe separation was performed on C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm),eluted with 0.01 mol·L-1potassium dinydrogen phosphate solution and methanol in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1,and the detection wave length was 260 nm.With the retention time as for qualitative analysis,the peak area was quantified by the external standard method.ResultsFour nucleosides were separated well with good linear relation(r=0.999 6).The average recoveries were between 98.4% and 101.9%,and RSD was lower or equal to 2.7%．ConclusionThe method was simple and accurate,so it can be used for the quantitative and qualitative detection of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets.

Chromatography,high pressure liquid;Purine nucleosides/analysis;Pyrimidine nucleosides/analysis

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.009

2016-02-21，

2016-04-27)