1 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定及所產(chǎn)細(xì)菌素的誘導(dǎo)合成現(xiàn)象

王筱夢(mèng)，江 蕓，孫芝蘭，劉 芳，王道營(yíng)，諸永志，耿志明，徐為民,3

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系，江蘇 南京 210097；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

1 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定及所產(chǎn)細(xì)菌素的誘導(dǎo)合成現(xiàn)象

王筱夢(mèng)1,2，江 蕓1,*，孫芝蘭2，劉 芳2，王道營(yíng)2，諸永志2，耿志明2，徐為民2,3

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系，江蘇 南京 210097；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

從發(fā)酵大蒜中篩選到一株具有抑菌作用的菌株Br26，通過(guò)用不同蛋白酶處理判斷該菌株是否為細(xì)菌素產(chǎn)生菌。隨后，通過(guò)分析自身發(fā)酵上清液與其他乳酸菌對(duì)細(xì)菌素合成的影響，探討該細(xì)菌素的誘導(dǎo)合成現(xiàn)象。結(jié)果表明：菌株Br26的發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后抑菌活性降低，確定該菌為細(xì)菌素產(chǎn)生菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為Weissella sp. Br26。Weissella sp. Br26在42 ℃、1/4 MRS培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌素抑菌活性消失，而當(dāng)添加不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液時(shí)，抑菌活性顯著增加，表明該細(xì)菌素可進(jìn)行自我誘導(dǎo)。另一方面，Weissella sp. Br26與卷曲乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌和腸膜明串珠菌的活菌共同培養(yǎng)后，發(fā)酵液pH值未有明顯變化，但細(xì)菌素抑菌活性顯著增加，表明細(xì)菌素的合成亦可受其他乳酸菌的誘導(dǎo)。綜上，Weissella sp. Br26細(xì)菌素的合成是受自身發(fā)酵液及其他菌誘導(dǎo)調(diào)控的。

魏斯氏菌Br26；細(xì)菌素；群體效應(yīng)

細(xì)菌素（bacteriocin）是由某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的對(duì)特定的菌株有抑菌活性的蛋白質(zhì)和多肽。它可被蛋白酶消化，所以在食品中添加與使用被認(rèn)為是安全的[1]。產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌包括乳桿菌屬[2,4]、芽孢桿菌屬[5]、葡萄球菌屬[6]和腸球菌[7-8]等。近年來(lái)，由魏斯氏菌產(chǎn)生的細(xì)菌素如魏斯菌素110[9]、魏斯菌素A[10]、魏斯菌素Y[11]、魏斯菌素L[12]也陸續(xù)見(jiàn)諸報(bào)道，但卻鮮有真正投入應(yīng)用，部分原因是細(xì)菌素合成量不足導(dǎo)致的。因此，新型細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)及細(xì)菌素合成量的增加尤為必要。

據(jù)報(bào)道，細(xì)菌素的合成受群體感應(yīng)效應(yīng)[13-14]的影響。群體感應(yīng)效應(yīng)[15]是指微生物細(xì)胞內(nèi)通過(guò)相應(yīng)的感應(yīng)系統(tǒng)感應(yīng)細(xì)胞外的小分子誘導(dǎo)劑的濃度，從而感知菌群密度的大小，當(dāng)菌群密度達(dá)到一定的閾值時(shí)激活一系列目的基因的表達(dá)，并表現(xiàn)相應(yīng)的群體行為。這種小分子誘導(dǎo)劑可由自身合成，也可由其他特定細(xì)菌合成。有研究顯示，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）自身合成的信號(hào)分子都可誘導(dǎo)其細(xì)菌素的合成[16-17]。而植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與特定革蘭氏陽(yáng)性菌共培養(yǎng)可導(dǎo)致細(xì)菌素合成量的增加[18]。

本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵大蒜中篩選出具有抑菌活性的菌株Br26，在排除有機(jī)酸、H2O2對(duì)菌株抑菌活性的干擾后，通過(guò)酶處理實(shí)驗(yàn)確定其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。通過(guò)16S rDNA鑒定結(jié)合序列同源性分析，將菌株命名為Weissella sp. Br26。為進(jìn)一步提高細(xì)菌素的合成量，本實(shí)驗(yàn)探究自身群體感應(yīng)現(xiàn)象及其他乳酸菌的誘導(dǎo)效應(yīng)對(duì)Weissella sp. Br26細(xì)菌素合成的影響，為細(xì)菌素的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

119 株供試菌株分離自醬腌的大蒜頭。指示菌：溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus P6.16）；共培養(yǎng)菌株：腸膜明串珠菌（Leuoconostoc mesenteroied）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所畜產(chǎn)組保存。

MRS（man rogosa sharpe）肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；Taq DNA polymerase、1 kb DNA ladder TakaRa公司；過(guò)氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、乳酸、鹽酸、冰乙酸 上海生工生物工程有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司；pHS-25B型數(shù)字酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；UV-6100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

119 株供試菌株與共培養(yǎng)菌株于-80 ℃冰箱冷凍保存，使用前將凍存菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)12 h，活化傳代2 次。溶酪大球菌P6.16活化2 代后，以體積分?jǐn)?shù)l%接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h備用。

1.3.2 抑菌活性的測(cè)定

供試菌株活化2 代后，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)36 h后，8 000 r/min離心3 min，收集發(fā)酵液，利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定供試菌株發(fā)酵液的抑菌活性[19]。

1.3.3 目標(biāo)菌株的分子鑒定

利用基因組提取試劑盒提取目標(biāo)菌株染色體DNA，并以此為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rDNA序列[20]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。利用BLAST軟件在線比對(duì)（http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/blast/Blast. cgi）進(jìn)行測(cè)序結(jié)果序列同源性分析。隨后利用軟件MEGA3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 Weissella sp. Br26產(chǎn)細(xì)菌素的確定

乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中常產(chǎn)生一些具有抑菌活性的物質(zhì)，如乳酸、苯乳酸[21]等，因此，在確定細(xì)菌素產(chǎn)生的同時(shí)要排除這類(lèi)物質(zhì)的干擾。

酸排除實(shí)驗(yàn)：用乳酸、鹽酸、乙酸調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基pH值至與Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液的相同，將其作為對(duì)照，分別檢測(cè)Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液與對(duì)照的抑菌活性[22]。

H2O2排除實(shí)驗(yàn)[23]：將Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液pH值調(diào)到7，加入過(guò)氧化氫酶至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃放置2 h，后將pH值調(diào)回發(fā)酵液原pH值，測(cè)其抑菌活性。以未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液做對(duì)照。

對(duì)蛋白酶的敏感性：用1 mol/L的HCl或NaOH將Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液pH值調(diào)至胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K的最適pH值，分別為3.0、8.2、7.0、8.0，分別加入酶母液至終質(zhì)量濃度為 1 g/L，37 ℃放置2 h后再將pH值調(diào)回到初始發(fā)酵上清液的pH值，檢測(cè)其抑菌活性，以未經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，檢測(cè)各種蛋白酶對(duì)乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響[24]。

1.3.5 Weissella sp. Br26生長(zhǎng)及產(chǎn)細(xì)菌素動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的研究

將Weissella sp. Br26菌株活化2 代，按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)。每隔4 h取樣測(cè)其OD600nm值、pH值和發(fā)酵上清液抑菌活性[25]。

1.3.6 不同時(shí)期的發(fā)酵上清液對(duì)細(xì)菌素生成的影響

表1 不同培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions for obtaining different cell densities

細(xì)菌素產(chǎn)生的最低菌群密度實(shí)驗(yàn)：通過(guò)改變培養(yǎng)基的濃度和培養(yǎng)溫度，設(shè)置9 種不同培養(yǎng)條件來(lái)改變細(xì)胞密度，按表1所述條件培養(yǎng)48 h，生長(zhǎng)結(jié)束后測(cè)發(fā)酵上清液抑菌活性[17]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出不產(chǎn)生細(xì)菌素的條件，以此為細(xì)菌素產(chǎn)生的低密度培養(yǎng)條件，即閾值。在閾值的基礎(chǔ)上測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液對(duì)菌株抑菌活性的影響。

按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將Weissella sp. Br26接種于40 mL MRS培養(yǎng)基中。因菌株在不同時(shí)間菌體密度不同，發(fā)酵上清液的質(zhì)量濃度也不同，所以將菌株培養(yǎng)到106、107、108CFU/mL時(shí)的發(fā)酵上清液視為不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清溶液。隨后，在閾值條件下，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將Weissella sp. Br26接種于40 mL的低密度培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（6 h），分別在發(fā)酵液中加入不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液（10倍濃縮）1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，研究不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液對(duì)菌株抑菌活性的影響[15]。以低密度培養(yǎng)條件不加發(fā)酵上清液與加入未發(fā)酵的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.3.7 其他乳酸菌對(duì)細(xì)菌素合成的誘導(dǎo)作用

活化后的Weissella sp. Br26與16 株菌株按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，使活菌數(shù)分別達(dá)到109、108CFU/mL，后按體積分?jǐn)?shù)2%和1%接種量轉(zhuǎn)接至20 mL的錐形瓶中。在37 ℃共培養(yǎng)36 h，10 000 r/min離心5 min，制備共培養(yǎng)無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，測(cè)定其抑菌圈直徑。同時(shí)設(shè)定對(duì)照：純培養(yǎng)的Weissella sp. Br26無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液、純培養(yǎng)的共培養(yǎng)菌株的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液、按體積比1∶1配制的2 種上清液的混合液。如果共培養(yǎng)發(fā)酵液的抑菌圈大于設(shè)定的對(duì)照組的抑菌圈，則將其作為誘導(dǎo)菌株，否則為非誘導(dǎo)菌株。

1.3.7.1 培養(yǎng)液中活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)純培養(yǎng)的Weissella sp. Br26、純培養(yǎng)的共培菌及Br26與共培菌共培養(yǎng)后的活菌數(shù)。將菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)菌體濃度后涂布于固體MRS平板。每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)，平板上菌落總數(shù)在30～300 CFU間計(jì)數(shù)，菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)即為菌落總數(shù)。

1.3.7.2 誘導(dǎo)菌的發(fā)酵上清液和死菌懸浮液對(duì)抑菌活性和活菌數(shù)的影響

制備誘導(dǎo)菌的發(fā)酵上清液（生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的誘導(dǎo)菌，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾）和死菌懸浮液（上述離心菌體用同等體積的磷酸緩沖液清洗2 次后加同等體積磷酸緩沖液于121 ℃滅菌15 min）。Weissella sp. Br26和無(wú)細(xì)胞上清液或死菌懸浮液按2%和1%的接種量接種于20 mL的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)36 h，測(cè)定其抑菌活性和活菌數(shù)。以純培養(yǎng)的Weissella sp. Br26作為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

圖1 菌株Br26基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of strain Br26 based on 16S rDNA gene sequences

從發(fā)酵大蒜中共篩選出119 株乳酸菌，以溶酪大球菌P6.16為指示菌，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選出一株具有明顯抑菌作用的菌株Br26。利用細(xì)菌通用引物8F/1541R擴(kuò)增該菌株的16S rDNA序列，并測(cè)序。利用MEGA 3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。由圖1可知，菌株Br26與Weissella cibaria qz-107同源性高達(dá)99%，結(jié)合16S rDNA基因序列分析，該菌為魏斯氏菌，命名為Weissella sp. Br26。

2.2 細(xì)菌素的確定

排除酸和H2O2對(duì)乳酸菌抑菌活性的影響：分別用乳酸、鹽酸、乙酸將MRS培養(yǎng)基pH值調(diào)至與Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液相同，它們對(duì)溶酪大球菌P6.16均無(wú)抑制作用，說(shuō)明發(fā)酵上清液的抑菌效果不是由所產(chǎn)酸引起的。用過(guò)氧化氫酶處理過(guò)的發(fā)酵上清液，對(duì)溶酪大球菌P6.16的抑菌效果也無(wú)明顯影響，亦可排除H2O2的影響。

表2 不同蛋白酶對(duì)Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Table 2 Influence of different protease treatments on the fermentation supernatant activity of Weissella sp. Br26

Weissella sp. Br26發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌圈無(wú)變化，而經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶作用2 h后，抑菌活性部分喪失（表2），說(shuō)明發(fā)酵上清液中主要的抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。

2.3 菌體生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程

圖 2Weissella sp. Br26在37 ℃連續(xù)培養(yǎng)OD600nm、pH值（A）和抑菌活性（B）的變化Fig. 2 Effect of incubation duration at 37 ℃ on the OD600nm, pH (A) and antibacterial activity (B) of Weissella sp. Br26

為了研究Weissella sp. Br26的生長(zhǎng)和所產(chǎn)細(xì)菌素的合成過(guò)程，每隔4 h取無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液測(cè)其pH值、OD600nm和抑菌圈直徑。由圖2可知，在發(fā)酵初期，隨著菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵液pH值開(kāi)始下降，至8 h時(shí)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)后期，發(fā)酵液抑菌活性開(kāi)始顯現(xiàn)，細(xì)菌素開(kāi)始大量合成。至12 h時(shí)，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，pH值也趨于穩(wěn)定，發(fā)酵液抑菌活性繼續(xù)增加，細(xì)菌素持續(xù)合成。24～36 h菌體密度和發(fā)酵液pH值趨于穩(wěn)定，此時(shí)發(fā)酵液抑菌活性也最大。但36 h之后，發(fā)酵液的抑菌活性略微下降，因此，將24～36 h作為細(xì)菌素合成的高峰期。

2.4 不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液對(duì)Weissella sp. Br26產(chǎn)生細(xì)菌素抑菌活性的影響

圖3 不同培養(yǎng)條件下細(xì)菌素的抑菌活性Fig. 3 Antibacterial activity of bacteriocin under different culture conditions

由圖3可知，抑菌圈直徑隨MRS質(zhì)量濃度的降低減小，隨溫度的升高而降低。并且第9組（1/4 MRS 42 ℃）抑菌活性消失。所以將其定為細(xì)菌素產(chǎn)生的低密度培養(yǎng)條件，即閾值。

表3 添加不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)酵上清液對(duì)細(xì)菌素抑菌活性的影響Table 3 Effect of fermentation supernatants at different growth phases on the antibacterial activity of bacteriocin

將含有不同生長(zhǎng)時(shí)期自身發(fā)酵上清液的溶液加到低密度培養(yǎng)條件下的菌株發(fā)酵液中，42 ℃發(fā)酵培養(yǎng)（表3）。添加MRS培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵液抑菌圈直徑為牛津杯直徑，而添加培養(yǎng)Weissella sp.到106CFU/mL時(shí)的自身發(fā)酵上清液后，發(fā)酵液的抑菌活性明顯增大。隨著菌體濃度的增加，收集的發(fā)酵上清液濃度也隨之增加，而添加到低密度培養(yǎng)條件下的菌株發(fā)酵液中時(shí)，抑菌圈直徑也逐步增大，當(dāng)添加菌體濃度為108CFU/mL時(shí)的發(fā)酵上清液時(shí)，抑菌圈直徑最大為15.54 mm，說(shuō)明不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)酵上清液可以刺激菌株產(chǎn)生高濃度的細(xì)菌素。

2.5 其他乳酸菌對(duì)細(xì)菌素合成的誘導(dǎo)作用

2.5.1 共培養(yǎng)后Weissella sp. Br26活菌數(shù)與發(fā)酵液抑菌活性的變化

將Weissella sp. Br26與其他16 株乳酸菌共同培養(yǎng)，確定其細(xì)菌素合成的誘導(dǎo)菌株。Weissella sp. Br26與腸膜明串珠菌、副干酪乳桿菌、瑞氏乳桿菌、卷曲乳桿菌共培養(yǎng)后，發(fā)酵液pH值未有明顯變化，但抑菌圈直徑顯著增大（P＜0.01），所以推測(cè)這4 株菌株可能為Weissella sp. Br26細(xì)菌素合成的誘導(dǎo)菌。而與其他菌株共培養(yǎng)后，發(fā)酵液抑菌圈直徑小于對(duì)照組，因此為非誘導(dǎo)菌（結(jié)果未顯示）。Weissella sp. Br26與4 株誘導(dǎo)菌共培養(yǎng)后，活菌數(shù)（圖4B）顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)的Weissella sp. Br26和單獨(dú)培養(yǎng)的誘導(dǎo)菌（P＜0.01）。并且細(xì)菌素的抑菌活性在圖4A中顯示最大，說(shuō)明細(xì)菌素的合成與自身菌體密度呈正相關(guān)。而這與表1得出的結(jié)論（細(xì)菌素的合成與Br26的菌體密度有密切關(guān)系）相似，符合群體感應(yīng)效應(yīng)。即Weissella sp. Br26受到誘導(dǎo)菌刺激后菌體數(shù)增多達(dá)到閾值條件，啟動(dòng)細(xì)菌素合成的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌素合成量的增加。

2.5.2 誘導(dǎo)菌的死菌懸浮液和上清液對(duì)Weissella sp. Br26細(xì)菌素合成和活菌數(shù)的影響

圖4 Weissella sp. Br26與4株疑似誘導(dǎo)菌共培養(yǎng)后的抑菌圈直徑（A）和活菌數(shù)（B）的變化Fig. 4 Bacteriocin production of Weissella sp. Br26 in co-culture with one of 4 inducing strains: diameter of inhibition zone (A) and cell number (B)

圖5 Weissella sp. Br26與誘導(dǎo)菌的死菌懸浮液和上清液共培養(yǎng)后抑菌活性和活菌數(shù)的變化Fig. 5 Cell number of Weissella sp. Br26 and antimicrobial activity of bacteriocin produced during co-culture with cell-free supernatants and autoclaved cultures of inducing strains

由圖5可知，Weissella sp. Br26與4 株誘導(dǎo)菌的上清液和死菌懸浮液共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)的活菌數(shù)無(wú)顯著變化，共培養(yǎng)后發(fā)酵液的抑菌活性也無(wú)顯著變化。這與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致。此結(jié)果說(shuō)明誘導(dǎo)菌的死菌和代謝產(chǎn)物不能刺激細(xì)菌素的合成，原因可能是與誘導(dǎo)菌的死菌懸浮液和上清液共培養(yǎng)后，菌體密度并未達(dá)到細(xì)菌素合成時(shí)群體感應(yīng)效應(yīng)的條件，從而不能刺激菌體產(chǎn)生更多的細(xì)菌素。由此推斷，誘導(dǎo)菌的活菌數(shù)是誘導(dǎo)細(xì)菌素合成的必要條件。

3 結(jié) 論

從發(fā)酵大蒜中篩選到一株對(duì)溶酪大球菌P6.16具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為魏斯氏菌屬，命名為Weissella sp. Br26。在排除酸、H2O2的干擾后，該菌的發(fā)酵上清液仍有抑菌活性，同時(shí)用最適pH值的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌活性部分消失，表明該菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)為蛋白或多肽。通過(guò)改變培養(yǎng)基濃度與培養(yǎng)條件，初步證實(shí)Weissella sp. Br26細(xì)菌素的產(chǎn)生依賴(lài)于菌體密度。通過(guò)添加不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)酵上清液再發(fā)酵的方法，確定細(xì)菌素其本身可進(jìn)行自我誘導(dǎo)。將Weissella sp. Br26與腸膜明串珠菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌分別共培養(yǎng)后，細(xì)菌素抑菌活性顯著增加，推測(cè)這4 株菌可能為細(xì)菌素產(chǎn)生的誘導(dǎo)菌。誘導(dǎo)菌的死菌懸浮液、發(fā)酵上清液對(duì)Weissella sp. Br26細(xì)菌素的合成無(wú)影響，推斷活的誘導(dǎo)菌是影響細(xì)菌素合成的主要因素。

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Identification of Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria and Induction of Bacteriocin Synthesis

WANG Xiaomeng1,2, JIANG Yun1,*, SUN Zhilan2, LIU Fang2, WANG Daoying2, ZHU Yongzhi2, GENG Zhiming2, XU Weimin2,3

(1. Department of Food Science, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, Nanjing 210095, China)

The strain Br26 with antibacterial activity was screened from fermented garlic. Different proteases were selected to determine whether the strain is bacteriocin-producing bacterium. Subsequently, the induction efficiency of bacteriocin synthesis by the fermentation supernatant of Br26 alone and co-cultures with other lactic acid bacteria was determined. The results showed the inhibitory activity of the fermentation supernatant of Br26 decreased after treatment with pepsin and papain, respectively, suggesting that the antimicrobial substance is bacteriocin. The strain was identified as Weissella sp. Br26 by 16S rDNA gene sequence homology analysis. The inhibitory activity disappeared when Br26 was cultured in 1/4 MRS at 42 ℃; however, it was significantly increased after adding fermentation supernatants at different growth phases, indicating that bacteriocin biosynthesis can be self-induced. On the other hand, although there were no significant changes in the pH values of fermentation supernatants, bacteriocin activity of Br26 was significantly increased after co-culturing with Lactobacillus crispatus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei and Leuconostoc mesenteroides, indicating that the synthesis of bacteriocin can also be induced by other lactic acid bacteria. In summary, bacteriocin synthesis of Weissella sp. Br26 can be induced by itself and other lactic acid bacteria.

Weissella sp. Br26; bacteriocin; quorum sensing

10.7506/spkx1002-6630-201621029

TS201.3

A

1002-6630（2016）21-0170-06

王筱夢(mèng), 江蕓, 孫芝蘭, 等. 1 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定及所產(chǎn)細(xì)菌素的誘導(dǎo)合成現(xiàn)象[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 170-175. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621029. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaomeng, JIANG Yun, SUN Zhilan, et al. Identification of bacteriocin-producing lactic acid bacteria and induction of bacteriocin synthesis[J]. Food Science, 2016, 37(21): 170-175. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621029. http://www.spkx.net.cn

2016-01-15

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（14）2117）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371802）

王筱夢(mèng)（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：625196221@qq.com

*通信作者：江蕓（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：jiangyun@njnu.edu.cn