紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的制備及結(jié)構(gòu)表征

郭 瑩，江 甜，李書藝，祝振洲，何靜仁

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的制備及結(jié)構(gòu)表征

郭 瑩，江 甜，李書藝，祝振洲，何靜仁*

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

采用硫酸銨沉淀法制備紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物，經(jīng)二乙氨基乙基纖維素52和Sephadex G-75葡聚糖凝膠純化得紫薯純蛋白，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定紫薯蛋白及紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的分子質(zhì)量，運用紫外、熒光、紅外和圓二色譜多種光譜方法對紫薯蛋白及紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物進行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明：紫薯蛋白及花色苷-蛋白復(fù)合物的分子質(zhì)量無明顯差異，均存在4 種不同的分子質(zhì)量分布：58、24、18 kD和14 kD。紫薯蛋白紫外最大吸收峰位于200 nm波長處，復(fù)合物的紫外光譜略有紅移且吸收增強。紫薯蛋白熒光光譜的最大發(fā)射波長是340 nm，而復(fù)合物的熒光強度幾乎完全猝滅。紫薯蛋白的紅外光譜圖具有酰胺帶特征吸收，復(fù)合物的紅外光譜峰形和吸收強度發(fā)生明顯變化。圓二色譜圖顯示紫薯蛋白二級結(jié)構(gòu)以β-折疊（43.6%）和無規(guī)卷曲（45.7%）為主，β-轉(zhuǎn)角（10.6%）次之，而復(fù)合物以β-折疊（72.2%）為主，無規(guī)卷曲（27.8%）含量降低，β-轉(zhuǎn)角消失。

紫薯；花色苷-蛋白復(fù)合物；紫薯蛋白；結(jié)構(gòu)表征

紫薯（Ipomoea batatas L.）又名黑薯，是我國常見甘薯品種資源中一種特殊的品種，近年來因其富含花色苷類物質(zhì)而吸引著國內(nèi)外諸多學者研究探討。此外，紫薯塊根中約含有2%～10%的蛋白質(zhì)，其中約80%為可溶性蛋白[1]。紫薯蛋白氨基酸種類齊全，氨基酸組成能較好的滿足人體的需求。因賴氨酸是禾谷類糧食的第一限制氨基酸，而紫薯蛋白中賴氨酸含量相對較高[2]，對其賴氨酸不足進行補充，具有較高的營養(yǎng)價值。

農(nóng)產(chǎn)品在加工、貯藏、食用等過程中，其活性成分與蛋白質(zhì)的相互作用不可避免[3]，以共價鍵[4]或非共價鍵[5-6]的形式結(jié)合形成新的復(fù)合物[7]。煙草中蛋白質(zhì)含量豐富，可與多種多酚類化合物結(jié)合形成多酚蛋白復(fù)合物，具有卓越的抗紫外能力[8]。紫薯富含花色苷與蛋白質(zhì)，而關(guān)于紫薯蛋白及其花色苷復(fù)合物的研究鮮見報道。本實驗采用硫酸銨沉淀法制備紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物，運用紫外、熒光、紅外和圓二色譜等光譜方法對紫薯純蛋白及其花色苷復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進行表征，為紫薯營養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其功效評價提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯品種為美國黑薯，由湖北鄖府薯業(yè)有限公司提供。

硫酸銨、氯化鈉、碳酸鈉、鹽酸、氯化鉀、乙酸、乙酸鈉、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸、過硫氨酸 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl) aminomethane，Tris） 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvingypyrrolidone，PVPP） 上海阿拉丁試劑有限公司；透析袋（壓平寬度10 mm，截留分子質(zhì)量3 500 D）美國Viskase公司；沒食子酸 美國Sigma公司；福林-酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準Marker（15～250 kD） 美國Bio-Rad公司；二乙氨基乙基纖維素（diethyl-aminoethanol，DEAE）-52 上海源葉變換生物科技有限公司；Sephadex G-75葡聚糖凝膠 武漢市蓋云天生物技術(shù)有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PCL-2紫外檢測器 上海金達生化儀器有限公司；Mini-Protean-3電泳儀配電泳槽 美國Bio-Rad公司；Evolution 220紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher公司；F-4600熒光光譜儀 日本日立公司；NEXUS670傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；J-1500圓二色譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的制備[8]

紫薯洗凈后切塊，加入3 倍體積蒸餾水，打漿，40 ℃水浴提取3 h，4 000 r/min離心30 min，取上清液。重復(fù)1 次，合并上清液。上清液中添加硫酸銨至飽和度60%，在4 ℃條件下緩慢攪拌1 h，4 000 r/min、4 ℃離心30 min取沉淀，用適量蒸餾水溶解沉淀后透析，冷凍干燥后即得到紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物。

1.3.2 紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中蛋白質(zhì)的分離純化

取紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物0.1 g溶于20 mL蒸餾水中，加入1g PVPP[9]渦旋后放置1 h，6 000 r/min離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，上DEAE-52陰離子交換層析柱（2.6 cm×23 cm）。用含0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris的HCl 緩沖液（pH 7.5）進行洗脫，流速為1 mL/min，在280 nm波長處用紫外檢測器在線檢測，收集峰組分，透析后凍干，得到粗蛋白粉末。

取10 mg粗蛋白粉溶于1 mL蒸餾水中，配制成10 mg/mL的蛋白液，上樣于Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱（2.6 cm×20 cm）進一步純化，用蒸餾水進行洗脫，流速為1 mL/min，在280 nm波長用處紫外檢測器在線檢測，收集蛋白質(zhì)峰的洗脫液，凍干，得到較純的蛋白粉末樣品。

1.3.3 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物成分的測定

1.3.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》[10]，采用凱氏定氮法測定。

1.3.3.2 總酚含量測定

采用福林-酚法測定紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的總酚含量[11]。準確吸取1 mL樣品于10 mL刻度試管中，加5 mL蒸餾水與0.5 mL福林-酚試劑，搖勻1 min后加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，室溫避光反應(yīng)2 h后在760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸（gallic acid，GA）為標準品繪制標準曲線，總酚含量以沒食子酸當量記，單位為mg GA/g。

1.3.3.3 總花色苷含量測定

采用pH示差法測定紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的總花色苷含量[12]。1 mL樣品分別用pH 1.0、4.5緩沖液稀釋，在最大吸收波長λmax和700 nm波長處測定吸光度?？偦ㄉ蘸堪词杠嚲账?3-葡萄糖苷含量記，計算公式如下：

式中：c為總花色苷含量/（mg/g）；Ab=（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26 900 L/（mol·cm））；L為比色皿寬度（1 c m）；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（4 4 9.2 g/m o l）；D為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）實驗

根據(jù)Laemmli[13]的方法進行SDS-PAGE，分離膠的體積分數(shù)為12%，濃縮膠的體積分數(shù)為5%，紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物樣品用去離子水溶解，按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min以充分變性蛋白，冷卻至室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠點樣孔中，上樣量為10 μL。60 V電泳40 min，然后120 V電泳約2 h。采用0.25%的考馬斯亮藍R-250對分離膠進行染色，然后在7.5%乙酸中脫色。利用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠拍照。

1.3.5 紫外吸收光譜分析

利用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）調(diào)整紫薯蛋白和紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物樣品質(zhì)量濃度到0.1 mg/mL，在190～700 nm進行光譜掃描，波長間隔為1 nm。

1.3.6 熒光光譜分析

紫薯蛋白和紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物樣品溶解在10 mmol/L的PBS（pH 7.0）中，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度到0.1 mg/mL，固定激發(fā)波長為280 nm，測定290～450 nm的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為2.5 nm。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

取紫薯蛋白和紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物凍干樣品各1 mg與100 mg溴化鉀粉末混合，在瑪瑙研缽中磨細后壓成透明薄片，在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，每個樣品掃描16 次，采用Omnic 8.2軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。

1.3.8 圓二色譜分析

在室溫條件下對紫薯蛋白和紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物樣品進行遠紫外區(qū)圓二色譜分析，配制樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，掃描范圍為190～240 nm，樣品池光程為2 mm。掃描速率為100 nm/mim，光譜帶寬為1 nm，掃描3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物成分含量

紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物凍干后為深紫色粉末，蛋白質(zhì)含量為（5 4.3 5±0.6 2）%，總酚含量為（128.62±4.54） mg/g，總花色苷含量為（47.41±0.73） mg/g。純化后的紫薯蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量為（94.43±1.16）%。

2.2 SDS-PAGE圖譜

紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物與紫薯蛋白的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物相比，經(jīng)純化處理后的蛋白條帶更為清晰。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物與紫薯蛋白的分子質(zhì)量并無明顯差異，均在10 kD以上，有4 個明顯的區(qū)域：58、24、18 kD和14 kD，其中分子質(zhì)量為24 kD的染色帶最粗，推斷為紫薯中可溶性蛋白質(zhì)的主要亞基。有相關(guān)報道表明SDS可破壞蛋白質(zhì)與其他分子之間的非共價作用，而蛋白質(zhì)與多酚反應(yīng)形成的共價復(fù)合物的電泳條帶會向上遷移[14]，因而初步推斷該紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物是紫薯花色苷與紫薯蛋白反應(yīng)形成的非共價復(fù)合物。

圖1 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of PSPP and complexes

2.3 紫外光譜分析

紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物與紫薯蛋白的紫外吸收曲線如圖2所示。紫薯蛋白主要有兩個特征吸收峰，約200 nm波長處的強吸收峰是肽鍵的特征吸收峰，在280 nm波長附近出現(xiàn)的較弱的峰，一般為蛋白中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的吸收峰。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物除具有此兩峰外，還存在另兩個吸收峰，330 nm波長處為花色苷中?；Y(jié)構(gòu)的吸收峰，540 nm為花色苷在可見區(qū)的最大吸收波長。與紫薯蛋白相比，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的紫外吸收增強，并發(fā)生了輕微的紅移，說明花色苷與蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用，芳香族氨基酸微環(huán)境疏水性增強。Zuo Huijun等[15]發(fā)現(xiàn)飛燕草素-3-葡萄糖苷與牛血清白蛋白結(jié)合后其紫外光譜會發(fā)生紅移。

2.4 熒光光譜分析

圖3為紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物與紫薯蛋白的熒光光譜。蛋白質(zhì)具有內(nèi)源性熒光，主要來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，其中色氨酸的熒光強度最強，最大發(fā)射波長為340 nm左右。固定激發(fā)波長為280 nm時，紫薯蛋白的最大發(fā)射波長是340 nm，表現(xiàn)了色氨酸的熒光特性。與紫薯蛋白的熒光光譜相比，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的熒光強度顯著降低，幾乎完全猝滅，且出現(xiàn)了明顯的藍移，說明色氨酸殘基空間位置發(fā)生了變化，周圍微環(huán)境的疏水性增強。Wiese等[16]得到類似的研究結(jié)果：矢車菊素-3-葡萄糖苷與人血清蛋白的相互作用會導(dǎo)致蛋白熒光強度的猝滅。

圖3 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的熒光光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra of PSPP and complexes

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 紫薯蛋白（a）與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物（b）的FTIRFig. 4 FTIR spectra of PSPP and complexes

圖4 為紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物與紫薯蛋白的紅外光譜圖。酰胺A在3 400～3 440 cm－1處有吸收峰，與N—H伸縮振動有關(guān)。紫薯蛋白的酰胺A在3 299.37 cm-1處出現(xiàn)，發(fā)生紅移現(xiàn)象，來源于酰胺A的N—H伸縮振動與氫鍵形成的締合體，其對應(yīng)波數(shù)會向低波數(shù)方向移動，一般在3 300 cm-1左右[17]。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中此峰消失，說明分子內(nèi)與分子間的氫鍵締合消失[18]。紫薯蛋白在2 962.63 cm-1處有弱吸收，是由酰胺B的—CH2不對稱伸縮引起的，而紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中此峰在2 958.27 cm-1處，較之略有紅移。此外，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中有2 個新峰出現(xiàn)，3 452.30 cm-1處可能是羥基伸縮振動吸收峰，2 920.29 cm-1處可能是甲氧基中C—H伸縮振動吸收峰，2 850.96 cm-1處可能是亞甲峰[19]。

紫薯蛋白在1 659.12 cm-1和1 642.22 cm-1處的強吸收峰，來自酰胺Ⅰ帶的C＝O伸縮振動。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中酰胺Ⅰ帶吸收峰強度明顯減弱，且分別紅移至1 658.48、1 640.37 cm-1處。紫薯蛋白和紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物在1 550.70、1 549.68 cm-1處的吸收是酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，反映了蛋白質(zhì)的C—N伸縮振動和N—H彎曲振動。紫薯蛋白在1 465.64 cm-1和1 388.50 cm-1處的弱吸收是由C—H彎曲振動引起的，1 241.93 cm-1處為酰胺Ⅲ帶（由C—N伸縮振動和N—H彎曲振動引起）的特征吸收，1 060.66 cm-1處為C—O伸縮振動。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中這幾處的特征吸收消失，并出現(xiàn)兩個新峰，1 384.66 cm-1處可能是甲氧基中C—H面內(nèi)彎曲振動吸收峰，1 079.33 cm-1處可能是C—O—C伸縮振動吸收峰[20]，綜合見表1。

由圖4b可知，復(fù)合物中有羥基、甲氧基和含氧雜環(huán)等特征基團，這些基團也是花色苷類物質(zhì)的特征基團。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中酰胺帶的峰形發(fā)生明顯變化，可能是花色苷類物質(zhì)與蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]。

表1 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的紅外光譜吸收峰位置Table 1 FTIR spectral peak locations of PSPP and complexes

2.6 圓二色光譜分析

遠紫外圓二色譜常用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，它對蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化極其靈敏，從圓二色光譜的變化可推導(dǎo)出構(gòu)象的變化。由圖5可知，紫薯蛋白在193 nm波長處的正峰和218 nm波長處的負峰為β-折疊[24]的特征峰，而紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中β-折疊的特征峰有所偏移，分別移動至195 nm和214 nm波長處，并且峰強度明顯增強。無規(guī)卷曲構(gòu)象在紫薯蛋白中表現(xiàn)為200 nm波長處的強負峰和212 nm波長處的正峰[24]，而紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物在203 nm和210 nm波長處的特征峰強度顯著減小。利用Yang氏算法計算得到蛋白的二級結(jié)構(gòu)百分含量，結(jié)果如表2所示。紫薯蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和無規(guī)卷曲，此結(jié)果與Sun Minjie等[25]制備的甘薯蛋白的圓二色光譜結(jié)果類似。紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量降低，α-螺旋含量沒有變化。

圖5 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的圓二色光譜Fig. 5 CD spectra of PSPP and complexes

表2 紫薯蛋白與紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of PSPP and complexes %

3 結(jié) 論

采用硫酸銨沉淀法提取紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物，柱層析系統(tǒng)分離純化得紫薯純蛋白。凝膠電泳圖譜顯示兩者分子質(zhì)量無明顯差異，亞基分布在14～58 kD。但二者在結(jié)構(gòu)上有一定的差異，可能是花色苷與蛋白質(zhì)結(jié)合對蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象產(chǎn)生了一定影響。

紫薯蛋白紫外最大吸收峰位于200 nm波長處，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的紫外吸收增強，并略有紅移。紫薯蛋白的最大發(fā)射波長是340 nm，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物復(fù)合物熒光強度顯著降低，幾乎完全猝滅。紫薯蛋白的紅外光譜具有明顯的酰胺帶吸收，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的峰形和吸收強度發(fā)生變化。圓二色光譜圖譜顯示紫薯蛋白二級結(jié)構(gòu)以β-折疊和無規(guī)卷曲為主，紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物中β-折疊含量較高，空間構(gòu)象更為有序。

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Preparation and Structure Identification of Anthocyanins-Protein Complexes from Purple Sweet Potato

GUO Ying, JIANG Tian, LI Shuyi, ZHU Zhenzhou, HE Jingren*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Purple sweet potato anthocyanins-protein complexes were extracted with hot water and precipitated by adding ammonium sulfate to 60% saturation. Purple sweet potato protein (PSPP) was further purified from the complexes by DEAE-52 ion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography. The molecular weights of PSPP and the complexes were determined by SDS-PAGE. A series of spectroscopic methods were used to characterize their structures. Results showed that there was no difference between PSPP and its complexes with anthocyanins in molecular weight. SDS-PAGE analysis exhibited four bands with molecular weights of 58, 24, 18 and 14 kD, respectively. The UV absorption spectra of both PSPP and the complexes showed a peak at 200 nm, but additional peaks and red-shift phenomenon of the complexes were observed when compared to PSPP. The maximum fluorescence emission wavelength of PSPP was 340 nm, and the intensity for the complexes was almost entirely quenched. FTIR spectra of PSPP had characteristic amide bands, and the shape and intensity of the complexes revealed a significant change. Circular dichroism (CD) revealed that PSPP had a secondary structure characterized by β-sheets (43.6%) and random coils (45.7%), β-turns (10.6%), while the complexes had higher content of β-sheets (72.2%) and decreased content of random coils (27.8%), and showed the disappearance of β-turns.

purple sweet potato; anthocyanins-protein complexes; purple sweet potato protein; structure characterization

10.7506/spkx1002-6630-201621019

Q946.1

A

1002-6630（2016）21-0109-05

郭瑩, 江甜, 李書藝, 等. 紫薯花色苷-蛋白復(fù)合物的制備及結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 109-113. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621019. http://www.spkx.net.cn

GUO Ying, JIANG Tian, LI Shuyi, et al. Preparation and structure identification of anthocyanins-protein complexes from purple sweet potato[J]. Food Science, 2016, 37(21): 109-113. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621019. http://www.spkx.net.cn

2015-11-13

湖北省自然科學基金計劃項目（2014CFB891）；湖北省科技支撐計劃項目（2015BHE015）；國家自然科學基金面上項目（31371727）；國際科技合作與交流專項（2014DFG32310）

郭瑩（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工化學與食品營養(yǎng)。E-mail：guoying1254@126.com

*通信作者：何靜仁（1974—），男，教授，博士，研究方向為膳食功效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子營養(yǎng)。E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn