甲狀旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO細胞中的表達

張煥，徐棟生，蔡燕飛，陳蘊，金堅

（江南大學藥學院，江蘇無錫214122）

甲狀旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO細胞中的表達

張煥，徐棟生，蔡燕飛，陳蘊，金堅

（江南大學藥學院，江蘇無錫214122）

人甲狀旁腺激素是由人甲狀腺旁腺主細胞分泌合成的一種單鏈多肽激素，成熟的甲狀旁腺激素含84個氨基酸殘基，其活性區(qū)域為N-末端1-34氨基酸片段，目前已上市的PTH藥物也以34個氨基酸殘基的多肽為主，主要用于治療老年骨質(zhì)疏松以及絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松。但是PTH的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期短，難以形成有治療作用的穩(wěn)態(tài)血藥濃度，從而限制了其臨床應(yīng)用。因此，設(shè)計穩(wěn)定并能保持原有生物活性的PTH藥物分子至關(guān)重要。構(gòu)建含有融合蛋白基因PTH-HSA的pM H3質(zhì)粒，并通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入中國倉鼠卵巢細胞（Chinese ham ster ovary cell，CHO細胞）中，利用pM H3質(zhì)粒所攜帶的N EO基因進行篩選，最終得到能穩(wěn)定表達目的蛋白的重組細胞，并在5L發(fā)酵罐中進行表達，融合蛋白PTH-HSA表達量達到155m g/L。W estern blot檢測顯示，該融合蛋白同時具有HSA和PTH雙重免疫原性。

甲狀旁腺激素-人血清白蛋白；融合蛋白；中國倉鼠卵巢細胞

人甲狀旁腺激素（Human parathyroid hormone，hPTH）是由人甲狀腺旁腺主細胞分泌合成的一種單鏈多肽激素，成熟的PTH含84個氨基酸殘基，其活性區(qū)域為N-末端1-34氨基酸片段，目前已上市的PTH藥物也以34個氨基酸殘基的多肽為主，主要用于治療老年骨質(zhì)疏松以及絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松[1]。但是PTH發(fā)揮的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期短，難以形成有治療作用的穩(wěn)態(tài)血藥濃度，從而限制了其臨床應(yīng)用[2]。因此，設(shè)計穩(wěn)定并能保持原有生物活性的PTH藥物分子至關(guān)重要。

人甲狀旁腺激素是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝和骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。甲狀旁腺激素的分子量僅為9.5KD，作為一種分子藥物使用時，在代謝的過程中容易被腎小球濾過，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期較短，為了達到治療效果需要頻繁給藥或大劑量用藥，從而給患者帶來了極大的不便。因此，增大分子量是長效蛋白藥物開發(fā)的主要方法。人血清白蛋白HSA是一個穩(wěn)定的“惰性”蛋白，同時也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。藥物與其融合后可以減緩自身的生物利用速度，延長在體內(nèi)的半衰期，最長可達19d。陳靜等在畢赤酵母中表達HSA-hPTH(1-34)融合蛋白，檢測到該融合蛋白具有生物活性，表達量可達400mg/L，分子量約為70KD。此項研究雖然成功地表達了具有生物活性的HSA-hPTH(1-34)，但是融合蛋白在畢赤酵母中表達后，其N端的PTH肽中氨基酸會被隨機偶然修飾，影響融合蛋白的質(zhì)量從而影響融合蛋白的實際應(yīng)用[3]。目前中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO細胞）已經(jīng)成為表達重組蛋白藥物最為理想的宿主之一，CHO細胞表達的糖基化藥物最接近天然蛋白，且很少分泌自身內(nèi)源蛋白，產(chǎn)物胞外分泌，利于純化[4]。本研究利用CHO表達系統(tǒng)的優(yōu)勢，在CHO表達系統(tǒng)中對hPTH(1-34)和HSA融合蛋白進行表達，期望獲得高效表達融合蛋白hPTH(1-34)-HSA的CHO細胞系，為HSA融合蛋白藥物提供新的表達思路。

1　材料和方法

1.1材料

質(zhì)粒pPIC9K/hPTH(1-34)-HSA由江南大學藥學院實驗室保存；CHO-S細胞和pMH3質(zhì)粒由AmProtein公司饋贈；大腸桿菌DH5α，T4連接酶，限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI，DNA聚合酶等購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒等購自上海生工生物公司；DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基B001和無血清流加培養(yǎng)基F001購自杭州安瑞普生物制品研究有限公司；G418購自Sigma公司；PTH抗體、HSA(HRP)抗體、HSA抗體均購自Abcam公司；山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗購自碧云天公司；尿微量白蛋白試劑盒購自上海名典生物,其余均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2PCR擴增引物

PTH(1-34)-HSA融合蛋白PCR引物見表1。

表1　PTH(1-34)-HSA融合蛋白PCR引物

其中，p5和p3的波浪線部分為EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點；p5中EcoRⅠ后CCACC為Kozac序列，下劃線部分為Igk信號肽序列，以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3CHO-S細胞的轉(zhuǎn)染

CHO-S細胞在含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞長至匯合度80%左右時，用胰酶消化，離心收集細胞，PBS重懸并調(diào)整濃度為1.5×107cells/mL。取200μL細胞懸液，10μg質(zhì)粒進行電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)條件為：500V，500μs電擊4次，每兩次電擊間隔冰浴1min。電擊后將電極杯中的細胞懸液均分至2個10cm培養(yǎng)皿（DMEM/F12，含10%胎牛血清）中培養(yǎng)24h后，加入終濃度為1.5mg/L G418進行篩選，期間觀察細胞狀態(tài)，待細胞出現(xiàn)大量死亡時（一般2～3d）更換到含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞克隆長出。

1.4穩(wěn)定表達PTH(1-34)-HSA細胞株的篩選

1.4.1孔板篩選

待細胞克隆長至合適大小后將所有單克隆挑至96孔板中。在含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～8d后PBS清洗細胞，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基，48h后取上清液用HSA(HRP)抗體進行Dot-blot檢測，進行快速篩選。得到的PTH-HSA高表達克隆轉(zhuǎn)入24孔板中，培養(yǎng)2～3d后用PBS清洗，每孔加入200μL無血清培養(yǎng)基，48h后取上清液進行Dot-blot檢測，挑選表達量最高的克隆作為一次克隆。用同樣的方法進行二次克隆篩選，以純化克隆并提高產(chǎn)量。

1.4.2搖瓶終篩

通過梯度將血清的方法將96孔板中篩選的克隆進行懸浮馴化，馴化好的細胞能在無血清培養(yǎng)基B001中正常生長，表現(xiàn)為細胞大小均一，無成團現(xiàn)象，密度每天翻倍，活率在98%以上。棄去無法懸浮馴化的細胞克隆。從搖瓶中取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為1.0×106cells/mL。分裝至150mL搖瓶中，每株細胞3瓶，每瓶30mL，并添加每瓶600μL（200g/L）葡萄糖，110rpm，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)7d。待培養(yǎng)結(jié)束后，取樣收集上清，將上清液樣品進行SDS-PAGE和Western blot檢測，此步驟所用抗體為PTH抗體。挑選表達量最高的克隆作為最終篩選成功的細胞克隆。

1.4.3Dot-blot檢測

培養(yǎng)上清按照順序點到NC膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉2h，HSA(HRP)抗體37℃孵育1h，TBST（TBS含0.5% Twen-20）漂洗3次，ECL顯色成像。

1.4.4Western blot檢測

取表達上清樣品進行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉2h，一抗37℃孵育2h，TBST（TBS含0.5%Tween-20）漂洗3次，二抗37℃孵育1h，TBST（TBS含0.5%Tween-20）漂洗3次，ECL顯色成像。

1.5PTH(1-34)-HSA細胞株上罐發(fā)酵

將篩選獲得的高表達細胞株進行上罐發(fā)酵（發(fā)酵罐AP20-5L，購自杭州安普杭州安普生物工程有限公司）。一次性反應(yīng)袋的最大裝液量為為3L。種子液1L，密度約為4×106cells/mL。培養(yǎng)條件為：溫度37℃，pH6.8～7.0，溶氧40%～80%，轉(zhuǎn)速55rpm，種子擴培至密度為8×106cells/mL時，降低培養(yǎng)溫度至34℃，用以推遲細胞進入衰亡期，盡可能提高蛋白產(chǎn)量。每天取樣，通過檢測細胞活率、糖濃度、乳酸濃度等指標來確定流加方案，流加培養(yǎng)基為F001。待細胞活率降至80%時停止發(fā)酵。

2　結(jié)果與討論

2.1表達載體pMH3/PTH(1-34)-HSA的構(gòu)建

圖1為重組質(zhì)粒pMH3/PTH(1-34)-HSA的示意圖，pMH3載體擁有GC-rich高效表達核心技術(shù)（WO2008/091276）、天然高表達元件（Chick beta actin gene intron-1）等，主要用于哺乳動物宿主細胞的高表達穩(wěn)定細胞株構(gòu)建。將目的基因hPTH(1-34)-HAS插在其多克隆位點區(qū)域。

圖2中，PCR結(jié)果顯示目的基因PTH(1-34)-HAS約為2000bp，與其理論值相符。酶切結(jié)果顯示目的基因的分子量大小同樣與理論值相符。測序結(jié)果與設(shè)計的基因序列比對結(jié)果一致，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1　pMH3/PTH(1-34)-HSA重組質(zhì)粒示意圖

圖2　pMH3/PTH(1-34)-HSA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.296孔板篩選

將挑取的克隆在96孔板中分別進行培養(yǎng)，表達并取上清液進行Dot-blot檢測，圖3顯示了部分結(jié)果。結(jié)果顯示，一次克隆中有40%左右的克隆具有HSA免疫原性，二次克隆的陽性率明顯提高，基本高于90%，說明通過二次克隆篩選既提高了蛋白產(chǎn)量，同時克隆的純度和穩(wěn)定性也有了大幅度提高。將挑選出的高表達量菌株擴培，并凍存一份在液氮中。

圖3　孔板篩選結(jié)果

2.3搖瓶終篩

將馴化好的細胞克隆在搖瓶中懸浮培養(yǎng)7d，通過SDS-PAGE和Western blot檢測進一步篩選高表達克隆。結(jié)果如圖4所示，圖中陽性為酵母表達的融合蛋白，由本研究室自行提供。結(jié)果表明，挑選的6個克隆均具有PTH免疫原性，能較好得表達目的蛋白，目的蛋白分子量約為70KD，與實際相符。其中泳道8的克隆表達量最高，是一般克隆的兩三倍。因此，最終選擇該克隆為最終被篩選成功的克隆。

圖4　搖瓶終篩結(jié)果

2.4PTH(1-34)-HSA細胞株上罐發(fā)酵

將搖瓶終篩獲得的克隆進行上罐發(fā)酵，上罐第4天種子擴培至密度為8×106cells/mL，此時將培養(yǎng)溫度降低至34℃，同時進行流加F001，每天取樣，待上罐至12d時，細胞活率降至80%停止發(fā)酵。將樣品進行SDS-PAGE和Western blot檢測，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，篩選的克隆適用于罐上表達，隨著發(fā)酵時間的延長其產(chǎn)量逐漸增高，與PTH單抗雜交后條帶單一。通過尿微量白蛋白試劑盒檢測融合蛋白表達量達為155mg/L。

圖5　重組細胞株的罐上表達情況

3　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了含有融合蛋白基因PTH(1-34)-HSA的pMH3質(zhì)粒，并通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入CHO-S細胞中，通過二次克隆篩選及搖瓶終篩，最終獲得了能穩(wěn)定表達目的蛋白的重組細胞，并在5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵表達，篩選的克隆適用于罐上表達，表達產(chǎn)物相對分子量為70KD與目的融合蛋白理論分子量相符，且具有HSA和PTH雙重免疫原性，融合蛋白表達量達到155mg/L。

本研究室已經(jīng)在畢赤酵母中成功表達了多種白蛋白融合藥物，以延長小分子蛋白藥物的半衰期。PTH(1-34)-HSA融合蛋白也已在酵母中獲得成功表達，然而外源性重組蛋白在酵母中進行糖基化的方式與哺乳動物細胞有所不同，表達蛋白雖然有一定活性，但由于糖基化方式不同，作為藥物在人體內(nèi)易出現(xiàn)糖蛋白免疫原性增強、活性降低、半衰期縮短等問題。CHO表達系統(tǒng)與其他表達系統(tǒng)相比更適于重組蛋白表達[6]：具有準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子；適應(yīng)懸浮培養(yǎng)；重組基因高效擴增表達；產(chǎn)物胞外分泌。目前已篩選出可高效表達hPTH(1-34)-HSA融合蛋白的單克隆細胞株，經(jīng)過懸浮馴化后，可以達到高密度培養(yǎng)，提高融合蛋白表達量，實現(xiàn)融合蛋白的高效表達，為重組蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1] Silva BC,CostaAG,Cusano NE,et al. Catabolic and anabolic actions of parathyroid hormone on the skeleton[J]. Journal of Endocrinological Investigation,2011,34(10):801-810.

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Expression of Parathyroid Hormone - Human Serum Albumin Fusion Protein in CHO Cells

Zhang Huan,Xu Dong-sheng,Cai Yan-fei,Chen Yun,Jin Jian

Human parathyroid hormone is synthesized as a single polypeptide hormone secreted by the thyroid parathyroid chief cells,the mature PTH containing 84 amino acid residues,the active region for N-terminal 1-34 amino acid fragment,the PTH drugs already on the market also to 34 amino acid residues of the polypeptide based,mainly for treatment of the old osteoporosis and postmenopausal women with osteoporosis. But the stability of PTH is poor,which leads to a short half-life in vivo,and it is difficult to form a stable blood drug concentration with therapeutic action,thus limiting its clinical application. Therefore,it is very important to design a PTH drug molecule which is stable and can maintain the original biological activity. PMH3 plasmid containing fusion protein gene PTH-HSA was constructed in this paper. And by electroporation method into Chinese hamster ovary (CHO cell,Chinese hamster ovary cell) cell in,use pMH3 plasmids carrying the neo gene was screened and eventually get stable expression of aim protein of recombinant cells,and its expression in 5L fermentor,the fusion protein PTH-HSA expression reached 155mg/L. Western Blot assay showed that the fusion protein had both HSA and PTH double immunogenicity.

Parathyroid hormone - human serum albumin; Fusion protein; Chinese hamster ovary cell

Q786

A

2096-0387（2016）05-0036-05

國家重大新藥創(chuàng)制項目（2013zx09102033）；國家高技術(shù)863計劃（2014aa021003，2015aa020802）；國家自然科學基金（81273437）。

張煥（1990-），男，安徽安慶人，碩士，研究方向：生物制藥。