2型和11型鴨疫里默氏菌二價滅活苗的研制

程龍飛，林群群，許利娜，施少華，陳翠騰，仇微紅，萬春和，陳紅梅，彭春香，葉賀佳，黃 瑜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

·研究論文·

2型和11型鴨疫里默氏菌二價滅活苗的研制

程龍飛1，林群群1，許利娜2，施少華1，陳翠騰1，仇微紅2，萬春和1，陳紅梅1，彭春香1，葉賀佳2，黃 瑜1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

為研制血清2型和11型鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）二價滅活疫苗，以RA1325株（2型）和RA1229株（11型）為菌種，經(jīng)培養(yǎng)、滅活、濃縮，混合后制成二價滅活油乳劑疫苗。將疫苗皮下接種7日齡番鴨，免疫后7、14、21、56、63、70、77 d進行攻菌試驗，測定疫苗的免疫原性。免疫后每隔7 d用ELISA方法測定血清中的抗體。結(jié)果表明，疫苗免疫后14 d產(chǎn)生良好保護，保護率超過80%，免疫持續(xù)期可達60 d。免疫后14 ～ 63 d抗體效價處于較高水平，說明研制的二價滅活疫苗能對血清2型和11型RA引起的鴨疫里默氏菌病產(chǎn)生良好的預(yù)防效果。

鴨疫里默氏菌；2型；11型；二價滅活疫苗；保護指數(shù)

鴨疫里默氏菌病，又名鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染引起的各品種雛鴨和雛鵝的一種急性或慢性敗血性傳染病，導(dǎo)致發(fā)病禽死亡，耐過禽生長不良，飼料轉(zhuǎn)化率降低，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。生物安全模式飼養(yǎng)、疫苗接種結(jié)合適當(dāng)?shù)乃幬飸?yīng)用是預(yù)防該病最經(jīng)濟有效的方法。國際上公認的RA血清型有21種[2]，我國流行的RA血清型多達15種[3]。不同血清型菌株之間缺乏足夠的交叉保護，只有選擇與流行菌株相同血清型菌株制備的滅活苗才能提供最佳的免疫保護[4]。血清11型RA在我國流行的報道最早見于1999年，程龍飛等[5]發(fā)現(xiàn)2006年以來，11型RA的流行呈逐年上升的趨勢，2012年，血清2型和11型合計已超過流行菌株的80%。為適應(yīng)RA的流行新情況，本研究對血清2型和11型RA二價滅活疫苗實驗室制品進行了研制。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鴨疫里默氏菌RA1325株（2型）和RA1229株（11型），作為滅活疫苗的生產(chǎn)和檢驗用菌種，均保存于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良TSA平板和改良LB[6]。

1.1.3 實驗動物 1日齡番鴨，雌雄不限，體重60 ～70 g，隔離飼養(yǎng)至所需日齡。

1.2 方法

1.2.1 滅活油乳劑疫苗的制備 兩株細菌分別培養(yǎng)、計數(shù)、滅活、滅活檢驗、濃縮，混合制備水相，與油佐劑按常規(guī)方法制成滅活油乳劑疫苗[6]。

1.2.2 疫苗的無菌檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行常規(guī)的無菌檢驗。取3塊改良TSA平板，每個平板接種疫苗300μL，于燭缸中37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h后觀察。

1.2.3 疫苗的安全檢驗 對7日齡番鴨分別進行1次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種（間隔14 d）、超劑量（2倍量）接種試驗，每個試驗用鴨10羽，觀察7 d，察看并記錄試驗鴨的精神狀態(tài)、采食、排糞、眼鼻分泌物等，觀察期結(jié)束后全部鴨處死剖檢，檢查注射部位的疫苗吸收情況。

1.2.4 疫苗的免疫期測定 7日齡番鴨隨機分為2組，實驗組180羽，對照組130羽。免疫組鴨每只皮下注射疫苗0．3 mL，對照組鴨每只皮下注射生理鹽水0．3 mL，同條件隔離飼養(yǎng)。免疫后7、14、21、56、63、70、77 d，取免疫鴨12羽和對照鴨8羽，每羽注射RA1325株0．5 mL；另取免疫鴨12羽和對照鴨8羽，每羽注射RA1229株0．5 mL，觀察10 d。記錄各組死亡數(shù)量，統(tǒng)計各免疫組的保護率。當(dāng)對照組死亡率未達到100%時，以保護指數(shù)[7]來計算。保護指數(shù)＝（對照組死亡率－試驗組死亡率）／對照組死亡率×100%

1.2.5 疫苗免疫后的抗體檢測 7日齡番鴨隨機分為2組，每組20羽。實驗組鴨每只皮下注射疫苗0．3 mL，對照組鴨每只皮下注射生理鹽水0．3 mL，同條件隔離飼養(yǎng)。每隔7 d每組隨機取12羽，頸靜脈采血分離血清。分別以RA1325株和RA1229株的全菌裂解液為包被抗原，測定抗體效價[8]。

2　結(jié)果

2.1 疫苗無菌檢驗 常規(guī)無菌檢驗未發(fā)現(xiàn)細菌生長。3個改良TSA平板亦無菌生長，說明無菌檢驗合格。

2.2 疫苗安全檢驗 觀察期內(nèi)各安全檢驗組實驗鴨精神良好，采食、排糞正常，眼鼻無異常分泌物。觀察期結(jié)束后，實驗鴨處死剖檢，注射局部疫苗吸收良好，無紅腫硬結(jié)出現(xiàn)。

2.3 免疫持續(xù)期 免疫后7 d，免疫組開始產(chǎn)生保護，但保護率不高。免疫后14 d和21 d，免疫組對兩株菌的攻擊均能提供80%以上的保護，最高達91．6%。免疫后56 d即番鴨63日齡開始，提高攻菌數(shù)，仍然無法造成對照組100%的死亡率，故引入保護指數(shù)來表示。免疫后56 d和63 d，免疫指數(shù)仍然超過80%，因此將免疫持續(xù)期確定為免疫后60 d。

2.4 免疫后抗體水平的變化規(guī)律 以免疫后天數(shù)為橫坐標(biāo)，以抗體效價平均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制的免疫后抗體水平的變化趨勢（圖1）。對照組鴨血清中的抗體效價始終為陰性。試驗組免疫后7 d，血清中開始出現(xiàn)特異性抗體，免疫后28 d，抗體的效價最高，然后逐漸回落，63 d后抗體效價迅速下降。免疫后14～63 d，抗體效價始終保持較高水平。抗體水平與攻菌試驗的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。

表1　2型和11型鴨疫里默氏菌攻菌試驗結(jié)果Table 1 The challenge result of Riemerella anatipestifer sevotype 2 and sevotype 11 to ducks

3 討論

圖1　免疫后抗體水平消長規(guī)律Fig.1 The dynamic change of antibody against RA

鴨疫里默氏菌病在我國主要養(yǎng)鴨區(qū)均有流行，鵝感染RA也常見報道。不同學(xué)者在不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)的流行菌株的血清型并不完全一致，近期研制的疫苗有1型[9]、2型[10]、10型[11,12]、1型和2型[6,13,14]、1型2型和3型三價[4,15]、1型2型和4型三價[16]等滅活疫苗，都能適應(yīng)不同地區(qū)不同時期臨床生產(chǎn)的需要。張大丙等[17]確定他們1997年以來收集的菌株中就有血清11型菌株的存在，近幾年血清11型鴨疫里默氏菌的報道越來越多[5,18-21]，已成為較常見的血清型之一。本研究試制的血清2型和11型鴨疫里默氏菌二價滅活疫苗，安全性好，注射部位疫苗吸收良好；攻菌試驗表明，免疫后7 d即能產(chǎn)生部分保護率，免疫后14 d的保護率超過80%，免疫期長達60 d，適合血清2型和11型流行地區(qū)的鴨和鵝使用。

[1] Hess C, Enichlmayr H, Jandreski-Cvetkovic D, et al．Riemerella anatipestifer outbreaks in commercial gooses flocks and identification of isolates by MALDI-TOF mass spectrometry [J]． Avian Pathol, 2013, 42(2): 151-156．

[2] Pathanasophon P, Sawada T,Tanticharoenyos T, et al．New serotypes of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand [J]． Avian Pathol, 1995, 24: 195-199．

[3] 程龍飛, 傅光華, 彭春香, 等． 1型和2型鴨疫里默氏菌的交叉保護[J]． 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2009, 38(5): 521-524．

[4] 謝永平, 陳澤祥, 許力干, 等． 鴨疫里氏桿菌油乳劑三價滅活疫苗的研究[J]． 動物醫(yī)學(xué)進展, 2010, 31(7): 45-47．

[5] 程龍飛, 陳紅梅, 施少華, 等． 鴨疫里默氏菌的血清型及藥物敏感性分析[J]． 中國動物傳染病學(xué)報, 2013, 21(4): 23-28．

[6] 程龍飛, 傅光華, 施少華, 等． 鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗的研制[J]． 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 29(11): 1058-1061．

[7] 劉玉鵬, 賴漢漳, 李延鵬, 等． 馬立克氏疫苗病毒在雞傳代細胞上的培養(yǎng)工藝[J]． 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 34(8): 1244-1248．

[8] 程龍飛, 施少華, 傅光華, 等． 2型鴨疫里氏桿菌抗體間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用[J]． 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 21(2): 131-134．

[9] 王小蘭, 胡青海, 童永亮, 等． 血清1型鴨疫里默氏桿菌滅活油乳劑疫苗的研制[J]． 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2012, 34(4): 313-316．

[10] 王小蘭, 胡青海, 韓先干, 等． 血清2型鴨疫里默氏桿菌制苗用菌株的篩選及滅活油乳劑疫苗的研制[J]． 中國獸醫(yī)雜志, 1999, 25(10): 13-15．

[11] 王小蘭, 劉蕾, 劉海文, 等． 血清10型鴨疫里默氏桿菌滅活油乳劑疫苗的研制[J]． 中國家禽, 2012, 34(15): 29-32．

[12] 楊靈芝, 姜世金, 馬景霞, 等． 鴨疫里默氏桿菌（10型）滅活疫苗的研制[J]． 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2011, 35(4): 2-5．

[13] 林樹乾, 張燕, 何元龍, 等． 鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗株篩選及免疫原性研究[J]． 中國家禽, 2011, 33(1): 25-27．

[14] 程增青, 杜恩中, 宮曉, 等． 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及其二價滅活疫苗的研制[J]． 中國獸藥雜志, 2013, 47(8): 9-13．

[15] 羊建平, 王傳鋒． 蘇中地區(qū)鴨疫里氏桿菌血清學(xué)調(diào)查及多價疫苗的研制[J]． 畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(4): 40-42．

[16] 鄭小奇, 湯承． 鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的免疫保護期研究[J]． 西南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 2013, 39(6): 874-876．

[17] 張大丙, 郭玉璞． 不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的部分特性比較[J]． 中國獸醫(yī)雜志, 1999, 25(10): 13-15．

[18] 楊曉輝, 程龍飛, 陳紅梅, 等． 血清11型鴨疫里默氏菌的分離鑒定[J]． 中國農(nóng)學(xué)通報, 2012, 28(5): 23-27．

[19] 徐榮妹, 劉金彪． 對一株鴨疫里默氏菌的分離與鑒定[J]．中國動物檢疫, 2014, 31(8): 77-79．

[20] 程龍飛, 陳紅梅, 傅光華, 等． 11型鴨疫里默氏菌的生物學(xué)特性[J]． 中國生物制品學(xué)雜志, 2014, 27(2): 185-188．

[21] 王名行, 張大丙． 鴨疫里默氏菌的分離鑒定[C]． 第三屆水禽疫病防控研討會論文集, 2015: 105．

EFFICACY OF THE BIVALENT INACTIVATED RIEMERELLA ANATIPESTIFER VACCINE CONTAINING SEROTYPES 2 AND 11

CHENG Long-fei1, LIN Qun-qun1, XU Li-na2, SHI Shao-hua1, CHEN Cui-teng1, QIU Wei-hong2, WAN Chun-he1, CHEN Hong-mei1, PENG Chun-xiang1, YE He-jia2, HUANG Yu1
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Guangzhou South China Biological Medicine Co. Ltd., Guangzhou 511300, China)

The purpose of the present study was to develop an inactivated bivalent Riemerella anatipestifer vaccine containing serotypes 2 and 11. Riemerella anatipestifer strains RA1325 (serotype 2) and RA1229 (serotype 11) were cultured, inactivated and concentrated separately and mixed before formulation of a bivalent vaccine. To determine the immunogenicity of the vaccine, seven-day-old Muscovy ducks were subcutaneously vaccinated and then challenged with the live vaccine strains at days 7, 14, 21, 56, 63, 70 and 77 post challenge. Antibodies in serum samples were determined in ELISA every 7 days post vaccination. The results showed that the protection rate was over 80% at day 14 post challenge. The immunity duration of the vaccine was 60 days. The titers of antibodies during 14 to 63 days post vaccination were at a high level. The preliminary results indicated that this bivalent vaccine might be used to prevent serotypes 2 and 11 Riemerella anatipestifer infection in ducks.

Riemerella anatipestifer; serotype 2; serotype 11; bivalent inactivated vaccine; protection index

S852.612

A

1674-6422（2016）05-0025-04

2016-02-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-43）；福建省屬公益類項目（2015R1023-2）

程龍飛，男，碩士，研究員，主要從事動物疫病研究

黃瑜，E-mail:huangyu_815@163．com