炭化蘋果枝對蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

曹 輝，李燕歌，周春然，寧留芳，楊洪強(qiáng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

炭化蘋果枝對蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

曹 輝，李燕歌，周春然，寧留芳，楊洪強(qiáng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

【目的】根區(qū)土壤微生物是影響根系環(huán)境的重要因素，炭化蘋果枝是廢棄果樹枝條低氧高溫?zé)峤猱a(chǎn)物，研究施用炭化蘋果枝對蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的影響，為炭化蘋果枝的合理應(yīng)用以及改善果園土壤生物學(xué)性狀提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭诖杭荆瑢㈤L勢一致的2年生‘富士’蘋果幼樹（砧木為平邑甜茶）移栽到含有不同質(zhì)量比（0—4%）炭化蘋果枝的盆栽土壤中，于移栽120 d后采集土樣，提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增建立文庫，利用Miseq平臺Illumina第二代高通量測序技術(shù)并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域的豐富度和多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)。【結(jié)果】從15個(gè)蘋果根區(qū)土壤樣本中獲得16 656個(gè)細(xì)菌分類操作單元（OTU）和435個(gè)真菌OTU，其中，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）是優(yōu)勢細(xì)菌，其相對豐度共占70.68%—72.80%；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygomycota）是優(yōu)勢真菌，其相對豐度共占68.00%—75.14%。群落物種豐富度指數(shù)（Chao指數(shù)和Ace指數(shù)）分析顯示，1%炭化蘋果枝增加了細(xì)菌的群落豐富度，其Chao指數(shù)提高了15.42%，Ace指數(shù)提高3.89%；0.5%炭化蘋果枝增加了真菌的群落豐富度，其Chao指數(shù)提高了2.80%，Ace指數(shù)提高了3.61%。群落多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）分析表明，0.5%—4%炭化蘋果枝降低了土壤細(xì)菌的多樣性，增加了土壤真菌的多樣性；其中，細(xì)菌群落多樣性Shannon指數(shù)在炭化蘋果枝用量為1%時(shí)最低，真菌Shannon指數(shù)在炭化蘋果枝用量為0.5%時(shí)最高。1%、2%和4%的炭化蘋果枝均不同程度地降低了根區(qū)土壤變形菌門、酸桿菌門和擔(dān)子菌門的相對豐度，提高了擬桿菌門和接合菌門的相對豐度；真菌擔(dān)子菌門中的銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）的相對豐度最大（數(shù)值在31.99%—46.74%），施用1%、2%和4%的炭化蘋果枝可使其降低。0.5%—4%的炭化蘋果枝能增加不同處理所獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目，改變細(xì)菌類群組成，其中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目是共有OTU數(shù)目的1—3倍，但對真菌類群組成沒有明顯影響?！窘Y(jié)論】施用0.5%—4%（w/w）炭化蘋果枝明顯改變蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性，增加各用量下所特有的細(xì)菌物種，其中1%的炭化蘋果枝明顯提高根區(qū)土壤細(xì)菌的豐富度。

炭化蘋果枝；根區(qū)土壤；Illumina高通量測序；細(xì)菌；真菌

0 引言

【研究意義】微生物是構(gòu)成土壤肥力的重要因素，但由于氮素化肥的大量施用，導(dǎo)致果園土壤氮素含量偏高，有機(jī)質(zhì)（有機(jī)碳）含量偏低，致使土壤微生物結(jié)構(gòu)惡化，土壤肥力普遍下降，嚴(yán)重威脅果樹生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，因此，迫切需要通過增碳減氮等措施改善微生物群落結(jié)構(gòu)，提高土壤質(zhì)量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有機(jī)物料經(jīng)過高溫炭化后施入土壤，不僅促進(jìn)廢棄物的資源化利用，還具有給土壤增碳和促進(jìn)植物生長的作用。閆麗娟等[1]報(bào)道炭化蘋果枝施入土壤可促進(jìn)平邑甜茶葉片的光合作用、根系發(fā)育和植株生長。有機(jī)物料高溫炭化產(chǎn)物是生物炭，生物炭作為一種土壤改良劑在農(nóng)林和環(huán)境等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，向土壤中添加生物炭，可改善土壤結(jié)構(gòu)[3]，干擾土壤硝酸鹽代謝[4]，提高土壤pH、電導(dǎo)率（EC）、陽離子交換量[5]、養(yǎng)分持留能力、保水能力等[6]，并因此能夠?yàn)橥寥牢⑸飾⑻峁┝己玫摹拔h(huán)境”[7]。土壤微生物不僅是土壤的重要組成部分，更是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要推動者，其在土壤有機(jī)物質(zhì)分解、養(yǎng)分釋放、能量轉(zhuǎn)移等生物地化循環(huán)中起著重要作用[8]。生物炭具有眾多孔隙和巨大比表面積，還有碳、磷和鉬等多種營養(yǎng)元素，這不僅可有效吸附微生物，還能為微生物提供所需營養(yǎng)物質(zhì)和優(yōu)越的棲息地[9]。LEHMANN等[10]認(rèn)為生物炭通過為土壤細(xì)菌提供更多碳源及改善土壤細(xì)菌生存環(huán)境條件而促進(jìn)了細(xì)菌的生長和繁衍。土壤微生物特別是細(xì)菌對自然或人為活動引起的環(huán)境變化十分敏感，曾有人把細(xì)菌群落作為評估土壤環(huán)境變化的指示性標(biāo)志[11]。SOLAIMAN等[12]發(fā)現(xiàn)腐生菌因其豐富的菌絲和高活性胞外酶而便于在生物炭中生長，而生物炭對腐生菌也起保護(hù)作用，它能促進(jìn)真菌與根系共生以及真菌菌根的生長；WARNOCK等[13]研究發(fā)現(xiàn)生物炭和菌根真菌互生能影響微生物菌群，適量菌根真菌和生物炭添加還能改善植物養(yǎng)分吸收及緩解鹽脅迫[14]。物種多樣性是分析土壤微生物狀況的重要參數(shù)，常采用群落豐富度指數(shù)（Chao和Ace）和群落多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）等反映[15]。在土壤微生物多樣性研究中，前人主要采用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)方法、Biolog平板法、磷脂脂肪酸和核酸分析法等來分析微生物，但對不可培養(yǎng)的微生物無能為力，試驗(yàn)中還會受到主觀因素、操作繁瑣、數(shù)據(jù)量小等難題的困擾[8]。而高通量測序可通過檢測土壤微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)（原核微生物16s rDNA/rRNA、真核微生物18s rDNA/rRNA）的堿基序列，經(jīng)過對這些序列的對比分析，可探究并揭示土壤微生物物種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性[16]。【本研究切入點(diǎn)】近年來高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，其無需培養(yǎng)、能夠客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)為深入分析微生物種類及其多樣性提供了可能[17]。此外，盡管生物炭可改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，但是其效果常因生物炭的制備材料等不同而存在很大差異[18-19]；炭化蘋果枝是一種不同于以稻殼、秸稈等為材料制備的生物炭，其對土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響目前還不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以冬季修剪下來的蘋果枝為原料，通過高溫低氧處理后施入土壤，采用高通量測序技術(shù)，探討炭化蘋果枝對蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌、真菌多樣性的影響，揭示根區(qū)土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)在施用炭化蘋果枝后的變化，以期為炭化蘋果枝的合理應(yīng)用以及改善果園土壤生物學(xué)性狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年3—11月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站和山東省高校果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株為長勢一致的2年生盆栽紅富士蘋果幼樹，砧木為平邑甜茶；盆栽土壤由壤土、兔糞、沙按照3∶1∶1（v/v/v）比例均勻混合而成，土壤基本理化指標(biāo)：容重1.45 g·cm-3、pH 7.1、速效磷32.9 mg·kg-1、堿解氮26.6 mg·kg-1、速效鉀102.5 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)12.41 g·kg-1。炭化蘋果枝是將冬季修剪下來的蘋果枝條粉碎后用高溫炭化爐在700℃下低氧活化2 h制得；采用JSM-5610LV型掃描電鏡，先將炭化蘋果枝放入鍍膜機(jī)內(nèi)鍍膜，之后將其放入載物臺并用導(dǎo)電膠將其固定后裝入機(jī)箱進(jìn)行照片采集，其超微結(jié)構(gòu)見圖1、理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014年4月8日將盆栽蘋果盆土倒出，分別與質(zhì)量比（w/w）0（CK）、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%炭化蘋果枝混勻后裝盆、栽樹，使樹根在盆中均勻分布。每個(gè)炭化蘋果枝用量為一個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。處理120 d后開始取樣，每盆采集3點(diǎn)混合土樣，用直徑2 cm不銹鋼土鉆鉆取0—20 cm深度土壤，去除根系、雜草、土壤動物和石塊等雜質(zhì)，混勻后分成2份，一份于-20℃冷凍保存用于土壤微生物分析，一份放進(jìn)4℃冰箱備測。

圖1 炭化蘋果枝橫、縱徑電鏡掃描Fig. 1 SEM figure of carbonized apple branches

表1 炭化蘋果枝的化學(xué)特性Table 1 Chemical characteristics of carbonized apple branches used in this study

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物基因組DNA的提取 采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（OMEGA，美國）的試劑盒方法，稱取0.5 g于-20℃保存的土壤樣品，按試劑盒的試驗(yàn)步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，DNA樣品于-20℃冰箱保存待用。

1.3.2 試驗(yàn)流程 提取樣品總DNA后，根據(jù)設(shè)計(jì)得到細(xì)菌V3+V4（F：5′-ARACTYCTACGGRAGGCW G-3′；R：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′）和真菌ITS1（F：5′-AACCTGCGGAAGGATCATT-3′；R：5′-GARCCAAGAGATCCRTTG-3′）合成的引物，合并引物接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行測序，由北京百邁客生物科技有限公司完成測序。

1.3.3 信息分析流程 對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)量評估，拼接雙端Reads并過濾得到優(yōu)化序列，用于后續(xù)生物信息學(xué)的分析。將優(yōu)化序列進(jìn)行物種注釋并聚類得到OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元），根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類?；贠TU聚類分析結(jié)果，對樣品的多樣性及組間差異性進(jìn)行分析，并結(jié)合物種分類信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析（圖2）。

圖2 微生物多樣性生物信息分析流程圖Fig. 2 Bioinformatics analysis of microbial diversity process

1.4 生物信息分析方法

1.4.1 數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評估 測序得到的原始序列（Sequenced reads）里含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證信息分析質(zhì)量，需要對原始測序序列進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的reads，用于后續(xù)信息分析。數(shù)據(jù)過濾的主要步驟[20]如下：（1）去除帶接頭的reads；（2）若一條reads上N（未能確定出具體的堿基類型）的比例大于5%，則過濾掉該雙端reads；（3）去除低質(zhì)量reads。

1.4.2 序列優(yōu)化 利用Mothur軟件（version 1.34.4，http://www.mothur.org/），進(jìn)行序列優(yōu)化，主要步驟[21]如下：（1）對序列進(jìn)行篩選，去除模糊堿基數(shù)大于0、單堿基高重復(fù)區(qū)大于8、重疊區(qū)錯(cuò)配數(shù)大于0及長度大于97.5%的序列（細(xì)菌）、重疊區(qū)長小于20 bp的序列（真菌）；（2）進(jìn)行去冗余處理。

1.4.3 OTU聚類分析 OTU即操作分類單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系、種、屬、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對應(yīng)于一種不同的序列[22]?？筛鶕?jù)不同的相似度水平，對所有序列進(jìn)行OTU劃分，通常在97%的相似水平下對OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法（Average Neighbor Clustering Algorithm）在0.03（或97%的相似度）水平下進(jìn)行OTU的聚類，并統(tǒng)計(jì)獲得OTU的個(gè)數(shù)。

1.4.4 豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)計(jì)算 選取Chao和Ace指數(shù)反映微生物豐富度，用Simpson和Shannon指數(shù)反映微生物多樣性[23-24]。

Chao指數(shù)：是用Chao1算法估計(jì)樣品中所含的OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)。計(jì)算公式：

式中，Schao1=估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；n1=只含有一條序列OTU數(shù)目；n2=只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

Ace指數(shù)：用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，由Chao提出，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao1的算法不同。計(jì)算公式：

式中，ni=含有i條序列的OTU數(shù)；Srare=低于閾值的OTU數(shù)；Sabund=超過閾值的OTU數(shù)；abund=含有豐富OTU數(shù)的閾值。

Simpson指數(shù)：用來估計(jì)樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的多樣性。Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。

式中，Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；ni=含有i條序列的OTU數(shù)；N=所有的序列數(shù)。

Shannon指數(shù)：用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，它與Simpson多樣性指數(shù)常用于反映alpha多樣性指數(shù)，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。式中，Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；ni=含有i條序列的OTU數(shù)；N=所有的序列數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

隨機(jī)選取相似度在97%條件下的OTU生成稀釋曲線，并利用軟件Mothur計(jì)算豐富度指數(shù)Chao和ACE，多樣性指數(shù)Simpson和Shannon?；赗DP和UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行物種注釋，并用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用Excel和R語言工具對樣品物種組成及相對豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制柱狀圖和Veen圖。

2 結(jié)果

2.1 土壤樣品測序深度評估

Illumina第二代高通量測序結(jié)果顯示，15個(gè)土壤細(xì)菌樣品測序、過濾后共獲得482 Mb數(shù)據(jù)量，雙端reads拼接后共產(chǎn)生892 071條Raw Tags，序列優(yōu)化后共得到78 237條Clean Tags，聚類一共獲得16 656個(gè)OTU；15個(gè)土壤真菌樣品測序、過濾后共獲得1Gb數(shù)據(jù)量，雙端reads拼接后共產(chǎn)生2 049 567條Raw Tags，序列優(yōu)化后共得到1 103 018條Clean Tags，聚類一共獲得435個(gè)OTU。

參照文獻(xiàn)[25]隨機(jī)抽取測序序列，將抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，在97%相似性水平下聚類OTU并制作各樣品的稀釋曲線圖（圖3），由圖可知，細(xì)菌和真菌曲線逐漸趨向平坦，說明測序數(shù)量合理。

2.2 炭化蘋果枝對根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性的影響

Ace和Chao指數(shù)可反映群落物種豐富度，由表2可知，土壤細(xì)菌Ace和Chao指數(shù)在施用1%（w/w）炭化蘋果枝后增加，增加幅度分別為15.42%和3.89%；在施用0.5%、2%和4%后降低，其中，Ace指數(shù)分別降低52.12%、10.87%和44.67%，Chao指數(shù)分別降低48.69%、18.54%和41.55%。真菌的Ace和Chao指數(shù)在施用0.5%炭化蘋果枝后分別增加，增加幅度分別為2.80%和3.61%；在施用1%、2%和4%炭化蘋果枝后降低。其中，Ace指數(shù)分別降低0.36%、0.75%和0.26%，Chao指數(shù)分別降低0.21%、1.80%和1.95%。顯示土壤細(xì)菌和真菌群落物種豐富度的變化因炭化蘋果枝的用量而有較大差異，施用1%（w/w）炭化蘋果枝可增加土壤細(xì)菌群落豐富度、0.5%的炭化蘋果枝則增加土壤真菌群落豐富度，施用2%和4%炭化蘋果枝均降低細(xì)菌和真菌的群落豐富度。

表2數(shù)據(jù)顯示，施用0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝后，土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)均有所下降，下降幅度分別為2.90%、4.01%、0.14%和3.18%，在1%的用量時(shí)細(xì)菌Shannon指數(shù)最低；土壤真菌Shannon指數(shù)在施用0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝后均有所提高，提高幅度分別為14.69%、3.13%、10.31%和7.81%，在0.5%的用量下真菌Shannon指數(shù)最高；Simpson指數(shù)的變化與之相反?？梢?，向土壤中添加0.5%—4%的炭化蘋果枝降低土壤細(xì)菌多樣性而提高真菌多樣性。

圖3 土壤樣品細(xì)菌（A）、真菌（B）多樣品稀釋曲線Fig. 3 Bacterial (A) and fungal (B) rarefaction curves of different soil samples

表2 炭化蘋果枝處理下根區(qū)土壤樣本群落豐富度和多樣性指數(shù)Table 2 OTUs’ abundance and diversity of root-zone soil samples with carbonized apple branches applied

2.3 炭化蘋果枝對根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌相對豐度的影響

圖4為根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌在不同分類水平上的物種柱狀圖。由圖4-A可知，蘋果根區(qū)土壤樣品中的細(xì)菌包含變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等菌群，各處理間細(xì)菌群落組成相似；除了未確定種屬的其他菌類，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門的相對豐度最高，分別為39.59%—44.03%、13.38%—18.50%和11.85%—15.39%，屬于優(yōu)勢細(xì)菌，它們的相對豐度合計(jì)為70.68%—72.80%。

圖4-A還顯示，施用0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝能不同程度的降低根區(qū)土壤變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，提高了擬桿菌門的相對豐度，其中，0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝使變形菌門的相對豐度分別比對照降低10.08%、5.56%、2.43%和5.93%，使擬桿菌門的相對豐度分別比對照提高了21.08%、26.01%、28.03%和38.27%，使酸桿菌門的相對豐度分別比對照降低了3.25%、12.61%、23.00%、20.60%。0.5%和1%炭化蘋果枝使放線菌門相對豐度分別提高17.96%和1.48%；2%和4%炭化蘋果枝則使放線菌門相對豐度分別降低24.55%和19.60%。

圖4 炭化蘋果枝處理下土壤樣品細(xì)菌門水平（A）、真菌門（B）和科（C）水平相對豐度變化Fig. 4 Changes in relative abundance of soil bacterial species at phylum level (A) and fungal species at phylum (B) and family (C) levels with carbonized apple branches applied

圖4-B顯示，蘋果根區(qū)土壤樣品中的真菌包含擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）等，除了未確定種屬的其他菌類，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）相對豐度最高，分別為46.09%—56.15%、8.57%—15.11%和7.03%—12.75%，屬于優(yōu)勢細(xì)菌，它們的相對豐度合計(jì)為68.00%—75.14%。

圖4-B還顯示，施用1%、2%和4%的炭化蘋果枝降低了擔(dān)子菌門的相對豐度（分別比對照降低15.09%、15.62%和3.15%），施用0.5%和2%炭化蘋果枝降低了子囊菌門的相對豐度（比對照降低6.64%和0.22%），而施用1%和4%炭化蘋果枝使子囊菌門的相對豐度分別提高了59.15%和64.60%。0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝增加了接合菌門的相對豐度，分別增加了34.28%、43.39%、81.37%和1.42%。

圖4-C顯示，根區(qū)土壤真菌在科水平上，除了未確定科類外，擔(dān)子菌門中的銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）的相對豐度在各處理中均最大（數(shù)值在31.99%—46.74%）。施入不同用量炭化蘋果枝可引發(fā)土壤真菌在不同分類水平上相對豐度的差異性變化，其中施用0.5%炭化蘋果枝提高了銹革孔菌科相對豐度（比對照提高9.44%），而1%、2%和4%炭化蘋果枝使銹革孔菌科相對豐度比對照分別降低了9.72%、25.10%和19.01%。

可見，變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門是根區(qū)土壤的優(yōu)勢細(xì)菌，擔(dān)子菌門、子囊菌門和接合菌門是根區(qū)土壤的優(yōu)勢真菌，銹革孔菌科是相對豐度最大的土壤擔(dān)子菌；施入1%、2%和4%的炭化蘋果枝均可不同程度地降低根區(qū)土壤變形菌門、酸桿菌門和擔(dān)子菌門以及擔(dān)子菌門中的銹革孔菌科的相對豐度，提高了擬桿菌門和接合菌門的相對豐度。

2.4 炭化蘋果枝處理后根區(qū)土壤細(xì)菌、真菌類群分析

在97%的相似度下，得到了每個(gè)樣品的OTU個(gè)數(shù)，如表3所示，0、0.5%、1%、2%和4%炭化蘋果枝處理后分別獲得6 374、4 093、5 378、10 598和4 476個(gè)細(xì)菌OTU，以及422、421、419、423和426個(gè)真菌OTU。

表3 蘋果根區(qū)土壤樣本測序獲得的細(xì)菌、真菌OTU序列讀數(shù)Table 3 Reads of observed soil bacterial and fungal OTUs

Venn圖能夠反映組間或樣品之間共有和特有OTU數(shù)目，能夠直觀地表現(xiàn)出組間或樣品間OTU的重疊情況[26]。結(jié)合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。從圖5-A中可以看出，不同處理之間共有的細(xì)菌OTU數(shù)目為1 192個(gè)，代表的物種分別屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、酸桿菌綱-Gp6（Acidobacteria_Gp6)、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidetes）等。未施用炭化蘋果枝（CK）的根區(qū)土壤不含有其獨(dú)有的細(xì)菌OTU，而施用不同量的炭化蘋果枝后，各用量下所獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目是共有OTU數(shù)目的1—3倍，說明施用炭化蘋果枝能引起土壤細(xì)菌特異性變化，在根區(qū)土壤能夠增加該處理所特有細(xì)菌物種，但增加的物種，因用量而不同，其中0.5%的用量增加了柔膜菌綱（Mollicutes）、Spartobacteria等特有物種，1%的用量增加了迷蹤菌綱（Elusimicrobia）、裝甲菌綱（Armatimonadia）等特有物種，2%的用量增加了疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、Chthonomonadetes等特有物種，4%的用量增加了Ignavibacteria等特有物種。

從圖5-B中可以看出，各處理之間共有的真菌OTU數(shù)目為391個(gè)，主要共有物種分別屬于傘菌綱（Agaricomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、子囊菌綱（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、壺菌綱（Chytridiomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）、圓盤菌綱（Orbiliomycetes）等。不同處理之間沒有各自獨(dú)有的真菌OTU，說明施用不同用量的炭化蘋果枝對土壤真菌類群組成沒有明顯影響。

圖5 炭化蘋果枝處理后根區(qū)土壤細(xì)菌（A）、真菌（B）Venn圖Fig. 5 Venn diagrams of soil bacterial (A) and fungal (B) community with carbonized apple branches applied

可見，土壤施入0.5%—4%的炭化蘋果枝能增加蘋果根區(qū)土壤中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目，改變細(xì)菌類群組成，但對真菌類群組成沒有明顯影響。

3 討論

生物炭施入土壤通過改變土壤理化性質(zhì)而直接或間接影響土壤微生物。本研究發(fā)現(xiàn)施入1%炭化蘋果枝提高了細(xì)菌豐富度指數(shù)，施入0.5%、2%和4%時(shí)則降低了該指數(shù)（表2），說明不同用量炭化蘋果枝對土壤中細(xì)菌豐富度的影響不同，較低（0.5%）和較高（2%和4%）用量都不利于細(xì)菌物種數(shù)量的增加。生物炭的孔徑、揮發(fā)物及灰分的組成與含量等都會影響細(xì)菌在土壤中的繁衍和生存狀態(tài)[13]，PIETIK?INEN等[27]認(rèn)為細(xì)菌能夠被吸附到生物炭的表面，使它們不易受土壤淋洗的影響，從而增加了土壤中細(xì)菌的數(shù)量；但由于生物炭的來源和熱解條件的不同，它們會因土壤類型和生物炭用量等因素的差異而對微生物種群和數(shù)量產(chǎn)生不同的影響[18-19]。不同用量的生物炭施入土壤，土壤的結(jié)構(gòu)和理化性狀也會發(fā)生不同改變，這種改變并不與用量呈現(xiàn)簡單的線性關(guān)系[6,28]，因此，細(xì)菌物種豐富度也不會因生物炭用量的逐漸增加呈簡單的線性變化。比如，炭化蘋果枝比土壤輕，施入土壤后會使土壤容重下降，這樣土壤氧氣含量會因炭化蘋果枝用量的增加而逐漸提高，土壤細(xì)菌既有厭氧類群，也有好氧類群，它們各自的豐富度會因土壤容重的減小而互有升降；炭化蘋果枝pH為堿性，隨著施用量的增加，土壤微區(qū)pH會隨之增加，這樣對pH要求不同的細(xì)菌的豐富度也會互有升降。因此，施入不同量的炭化蘋果枝后整個(gè)細(xì)菌類群豐富度的變化會很復(fù)雜，要揭示細(xì)菌豐富度與炭化蘋果枝用量之間更細(xì)致的關(guān)系，還有待將土壤細(xì)菌分類由門具體到科、屬、種甚至小種的層面。真菌物種豐富度隨炭化蘋果枝用量的變化也存在類似的問題，不過，有報(bào)道指出在土壤pH較高時(shí)，真菌豐度會降低[29]，高用量的炭化蘋果枝會提高土壤微區(qū)pH，因此當(dāng)用量提高到1%以上時(shí)會降低土壤真菌物種的豐富度。

本研究發(fā)現(xiàn)施用1%炭化蘋果枝增加了細(xì)菌物種豐富度，但降低了細(xì)菌物種多樣性；施用1%、2%和4%炭化蘋果枝降低了真菌物種豐富度，卻增加真菌物種多樣性，這主要是因?yàn)槲⑸锏亩鄻有杂晌锓N豐富度和均勻度共同決定，它與物種豐富度的關(guān)系會因豐富度和均勻度二者所占比重而不同[30]。施用炭化蘋果枝一方面促進(jìn)某些微生物生長，同時(shí)也會抑制某類微生物生長，使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致物種均勻度改變，并進(jìn)而影響微生物多樣性與物種豐富度的關(guān)系。炭化蘋果枝像其他生物炭一樣可吸附微生物，改變微生物生長環(huán)境等[31]，這必然會引起微生物數(shù)量差異或是群落結(jié)構(gòu)的變化，影響群落的物種均勻度和豐富度，并進(jìn)而導(dǎo)致多樣性指數(shù)的變化（表2、圖4）。

基于RDP分類學(xué)數(shù)據(jù)庫和UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫的分析顯示，在蘋果根區(qū)土壤中，變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門等是主要細(xì)菌類群，擔(dān)子菌門、子囊菌門、接合菌門等是主要真菌類群（圖4），這與前人對土壤微生物群落的研究結(jié)果一致[32]。0.5%—4%炭化蘋果枝能不同程度的降低變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，提高擬桿菌門的相對豐度。變形菌門是細(xì)菌中最大的一類，所試樣品中的變形菌主要有α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、δ-變形菌等，多樣性很高，數(shù)量也很大，屬于蘋果根區(qū)土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌。酸桿菌門大多都是嗜酸菌，其豐富度與土壤pH呈顯著的負(fù)相關(guān)，在土壤pH較低的環(huán)境中酸桿菌豐度最高[33]，因此，炭化蘋果枝可通過提高土壤微區(qū)pH而降低酸桿菌門的相對豐度。擬桿菌門的細(xì)菌與DNA、蛋白質(zhì)和脂類等有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換緊密相關(guān)，這些有機(jī)物質(zhì)的吸收和利用是碳循環(huán)的重要組成部分[34]，炭化蘋果枝作為一種碳源，施入土壤有利于提高土壤擬桿菌門的相對豐度。不同用量炭化蘋果枝能引起真菌群落差異性變化（圖4-B），其中，0.5%—4%炭化蘋果枝能不同程度提高接合菌門的相對豐度，這種不一致的變化可能是由于炭化蘋果枝本身有效碳的缺乏抑制了某些真菌的定殖，而表面吸附的溶解性有機(jī)碳可以選擇性地被接合菌門利用[19]。大多數(shù)的病原菌來自于真菌，本研究顯示1%—4%炭化蘋果枝能降低真菌擔(dān)子菌門銹革孔菌科的相對豐度，而銹革孔菌科包含了很多與林木病有關(guān)的真菌[35]，其相對豐度的降低會在一定程度上減少植株受病菌侵害的幾率。

土壤細(xì)菌和真菌相對豐度的變化也可改變土壤微生物類群組成。本研究發(fā)現(xiàn)添加0.5%—4%炭化蘋果枝能增加蘋果根區(qū)土壤中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目，增加細(xì)菌特有物種，進(jìn)而改變了細(xì)菌類群組成，但對真菌類群組成沒有明顯影響（圖5），這主要在于炭化蘋果枝會像其他生物炭一樣能影響土壤理化性質(zhì)和生物學(xué)特性，能夠?yàn)槲⑸飫?chuàng)造特定的微環(huán)境[19]，不同類群的微生物（比如真菌和細(xì)菌）對最適環(huán)境的要求不會完全一樣，炭化蘋果枝對不同菌群生存和繁衍的影響也不可能完全一樣。微生物對外界環(huán)境非常敏感，土壤環(huán)境的微小變動就會引起微生物多樣性的變化[11]，土壤施入不同量炭化蘋果枝會使土壤環(huán)境發(fā)生不同程度的改變，這必然會引起微生物多樣性的差異性變化（表2）。通常認(rèn)為熟化程度高、肥力好的土壤微生物數(shù)量以及細(xì)菌所占的比例均較高，干旱和貧瘠土壤中的真菌和放線菌所占比例較高[36]，本研究發(fā)現(xiàn)，施用0.5%—4%的炭化蘋果枝使各用量下所特有的細(xì)菌物種增多（圖5），2%和4%的炭化蘋果枝降低真菌群落豐富度（表2）以及放線菌門的相對豐度（圖4-A）等，這些變化應(yīng)該有利于土壤肥力狀況的改善，具體有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌中還有很多未分類或是未確定種屬的物種，它們也受到炭化蘋果枝的影響，但其功能和特點(diǎn)尚不清楚，還有待通過深度測序或利用其他先進(jìn)手段對微生物進(jìn)行更細(xì)致地分類研究，并結(jié)合土壤的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行深入探索。

4 結(jié)論

高通量測序技術(shù)在蘋果根區(qū)土壤微生物研究中具有極大優(yōu)勢和可行性，施用0.5%—4%（w/w）炭化蘋果枝明顯改變蘋果根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性，增加各用量下所特有細(xì)菌物種。炭化蘋果枝對土壤微生物的影響因施用劑量而呈現(xiàn)不同的變化趨勢，其中，1%的炭化蘋果枝明顯提高根區(qū)土壤細(xì)菌的豐富度，2%和4%的炭化蘋果枝降低真菌群落豐富度。施用適量炭化蘋果枝可改變微生物群落結(jié)構(gòu)，將有利于改善土壤生物學(xué)性狀。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effect of Carbonized Apple Branches on Bacterial and Fungal Diversities in Apple Root-Zone Soil

CAO Hui, LI Yan-ge, ZHOU Chun-ran, NING Liu-fang, YANG Hong-qiang
(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】The microorganisms in soil of root-zone are important factors affecting root environment, carbonized apple branches are the low oxygen pyrolysis products of the abandoned fruit trees. The purpose of this study was to understand the structure of soil bacteria and fungi in apple root-zone and the response of their diversities to carbonized apple branches, and to provide a theoreticalbasis for the reasonable application of carbonized apple branches and the improvement of soil biological characters in orchard.【Method】 In the spring, the 2-year-old ‘Fuji’ apple trees (rootstock for Malus hupehensis Rehd) in similar growth were transplanted to the potting soil, the soil was mixed with different mass ratios (0-4%) of carbonized apple branches beforehand. Soil samples were collected after 120 days of transplanting, genomic DNA was extracted, and PCR amplification was made to establish libraries. In this study, the 16S rRNA genes V3+V4 regions of soil bacteria and fungal ITS1 regions were sequenced by Illumina high-throughput sequencing technology on Miseq platform, and related biological analysis was conducted to explore the changes of soil bacterial and fungal abundances, diversities and structures.【Result】A total of 16 656 bacterial operational taxonomic units (OTUs) and 435 fungal OTUs were obtained from 15 apple root-zone soil samples, among them, Proteobacteria, Bacteroidetes and Acidobacteria were the dominant bacteria which the total relative abundance was 70.68%-72.80%, and Basidiomycota, Ascomycota and Zygomycota were dominant fungi which the total relative abundance was 68.00%-75.14%. The richness indices of Chao and Ace showed that 1% (w/w) carbonized apple branches increased the abundance of bacteria by 15.42% and 3.89% compared with the control, respectively. 0.5% (w/w) carbonized apple branches increased the richness of fungi by 2.80% and 3.61%, respectively. Simpson and Shannon diversity index analysis showed that 0.5%-4% (w/w) carbonized apple branches reduced the diversity of soil bacteria, increased the diversity of soil fungi; bacteria Shannon diversity index was the lowest at 1% carbonized apple branches and fungi Shannon diversity index was the highest at 0.5% carbonized apple branches. Application of 1%, 2% and 4% carbonized apple branches to the soil, the relative abundance of Proteobacteria, Acidobacteria and Basidiomycota all decreased and the relative abundance of Bacteroidetes and Zygomycota all increased in apple root-zone soil at different degrees. The relative abundance of Hymenochaetaceae (31.99%-46.74%) was the highest in Basidiomycota. 1%, 2% and 4% carbonized apple branches all made it decrease. Carbonized apple branches at 0.5%-4% dosage could increase the number of bacteria unique OTUs significantly and affect the bacteria groups, wherein the number of bacterial unique OTU was one to three times of the common OTU numbers, but they had no significant effect on the fungal groups.【Conclusion】The 0.5%-4% (w/w) carbonized apple branch applied to the soil of apple root-zone, the abundance and diversity of soil bacteria and fungi had obviously changed, and the specific bacterial species under each dosage increased too. The soil bacterial richness increased significantly in root-zone applied 1% carbonized apple branches.

carbonized apple branches; root-zone soil; Illumina high-throughput sequencing; soil bacteria; soil fungi

2016-01-31；接受日期：2016-04-19

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2014BAD16B02）、國家自然科學(xué)基金（31372016）

聯(lián)系方式：曹輝，E-mail：caohui716@163.com。通信作者楊洪強(qiáng)，E-mail：hqyang@sdau.edu.cn, labft@sdau.edu.cn