嬰幼兒米粉復(fù)合酶解技術(shù)研究

陸東和， 陳 慎， 黃穎穎， 楊成龍*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003)

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嬰幼兒米粉復(fù)合酶解技術(shù)研究

陸東和1,2， 陳 慎1,2， 黃穎穎1,2， 楊成龍1,2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003)

[目的]研究生物酶解法在嬰幼兒米粉加工過(guò)程中的應(yīng)用，以提高直鏈淀粉含量而抑制淀粉回生。[方法]選取適宜的復(fù)合酶對(duì)米粉進(jìn)行酶解，通過(guò)酶種類的篩選、復(fù)合酶配比優(yōu)化，酶解pH、酶作用溫度、酶添加量及酶作用時(shí)間等條件單因素分析及Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到了復(fù)合酶解技術(shù)延緩米粉回生過(guò)程的工藝條件。[結(jié)果]考慮實(shí)際操作，得到最優(yōu)酶解條件如下：酶解pH 5.9，酶解溫度56 ℃，復(fù)合酶總添加量0.70 μg/g，酶解時(shí)間120 min。該條件下得到實(shí)際的直鏈淀粉含量可達(dá)26.28%。經(jīng)方差及回歸方程分析得到各個(gè)條件及它們之間的交互作用對(duì)于米粉直鏈淀粉含量影響顯著。[結(jié)論]通過(guò)該試驗(yàn)分析法優(yōu)化得到的復(fù)合酶解技術(shù)可顯著抑制淀粉回生，所得到的工藝條件可用于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

嬰幼兒米粉；直鏈淀粉；酶解；最佳條件

嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉是根據(jù)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)而研制，在母乳或嬰兒配方食品不能滿足嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)需要時(shí)，作為補(bǔ)充嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)的輔助食品。它是以大米為主要原料，以糖、肉類、蛋類、蔬菜、水果、大豆、小米等為選擇性配料，并加入鈣、鐵等礦物質(zhì)及維生素等加工制成[1]。歐美國(guó)家的嬰幼兒輔食發(fā)展較快，大都具有明確的針對(duì)性，營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽詳盡，膳食調(diào)配指導(dǎo)完善[2]。國(guó)內(nèi)當(dāng)前嬰幼兒食品傳統(tǒng)加工工藝存在沖調(diào)時(shí)用水量大，不易攪拌均勻，存在團(tuán)塊及入口后黏度大等缺點(diǎn)。因此，提升國(guó)內(nèi)市場(chǎng)嬰幼兒食品整體品質(zhì)具有重要意義。

大米不容易引起過(guò)敏且易于消化吸收，因此由大米加工成的米粉是嬰兒輔食的首選[3]。淀粉的水解度與回生程度對(duì)米粉產(chǎn)品的品質(zhì)具有顯著影響，因此嬰幼兒米粉的品質(zhì)及口感與淀粉的性質(zhì)有重要關(guān)系。淀粉通過(guò)蒸煮、焙烤等加熱過(guò)程而被糊化，在儲(chǔ)存過(guò)程中，糊化的淀粉發(fā)生老化(亦稱回生)，從而使食品的質(zhì)構(gòu)與消化性劣化。因此，抑制回生是改善米粉口感及延長(zhǎng)貨架期的重要手段。淀粉的回生包括直鏈分子螺旋結(jié)構(gòu)的形成及其堆積、支鏈淀粉外支鏈間雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成與雙螺旋之間的有序堆積[4]。研究表明，直鏈淀粉分子長(zhǎng)短及直、支鏈的比例與回生速率呈高度相關(guān)，抑制淀粉類食品的回生可由消除或抑制支鏈淀粉分子結(jié)晶的形成來(lái)達(dá)到[5]。目前，抑制淀粉回生的主要方法有基因修飾、酶法修飾、化學(xué)修飾、物理修飾[6]。

淀粉的生物酶解法能通過(guò)改變鏈長(zhǎng)，增強(qiáng)分子鏈排列的無(wú)序性而達(dá)到明顯的延緩回生、抗老化和改善穩(wěn)定性的效果。如通過(guò)在饅頭、面包和米粉等的制作過(guò)程中添加淀粉酶，可有效延長(zhǎng)面制品的保鮮時(shí)間，是一種具有廣闊前景的方法[7]。筆者針對(duì)米粉傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的缺陷，選取α-淀粉酶、β-淀粉酶及環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)進(jìn)行復(fù)配，采用酶解技術(shù)解決米粉沖調(diào)性的缺陷，延緩米粉中淀粉的回生過(guò)程，重點(diǎn)解決嬰幼兒米粉加工成品口感較差的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料 原料與主要試劑：大米(市售)，α-淀粉酶(分析純)，β-淀粉酶(分析純)，環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)(分析純)。

主要儀器設(shè)備：雙螺桿膨化機(jī)，低速臺(tái)式離心機(jī)，植物粉碎機(jī)，數(shù)顯恒溫水浴鍋，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程。大米→粉碎→調(diào)水分→酶解→鈍化→擠壓膨化→烘干→粉碎→篩分→輔料調(diào)配→混勻→包裝。

1.2.2 酶的篩選。選用α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶3種酶在其各自最優(yōu)條件下對(duì)米粉進(jìn)行水解，通過(guò)測(cè)定直鏈淀粉含量，分析淀粉的水解程度，篩選出直鏈淀粉含量比較理想的2種酶進(jìn)行后續(xù)復(fù)配試驗(yàn)。

進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)時(shí)，選取3種酶進(jìn)行復(fù)合酶篩選試驗(yàn)，固定酶添加總量為0.50 μg/g，在各酶水解最適條件下，酶解2 h。

1.2.3 復(fù)合酶比例的確定。經(jīng)過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)確定，在固定酶總添加量0.60 μg/g、pH 8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間120 min條件下，設(shè)定9個(gè)不同水平的復(fù)配比例，研究效果較好的2種酶制劑之間量的不同配比對(duì)米粉酶解效果的影響。1.2.4 復(fù)合酶組合水解條件篩選。在確定復(fù)合酶水解粗略的水解條件之后，改變酶添加量、酶解時(shí)間、酶解pH、溫度中的1個(gè)參數(shù)，分別測(cè)定其直鏈淀粉含量，確定復(fù)合酶的較佳單因素條件。

1.2.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH、溫度、酶添加總量、酶解時(shí)間作為響應(yīng)因素，以直鏈淀粉含量作為響應(yīng)面值，通過(guò)Design Expert 8.0.1 軟件，根據(jù)Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平共29組試驗(yàn)對(duì)預(yù)處理工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到優(yōu)化后的最佳加工參數(shù)，因素水平編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶種類與配比選擇

2.1.1 復(fù)合酶種類選擇。選取α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶3種酶，在其各自最優(yōu)條件下對(duì)米粉進(jìn)行水解，之后進(jìn)行兩兩組合試驗(yàn)，并與單酶試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。由圖1可知，α-淀粉酶和β-淀粉酶組合效果最好，因此選取該組合作為后續(xù)試驗(yàn)的復(fù)合酶。

圖1 酶種類與直鏈淀粉含量的關(guān)系Fig.1 The relationship between enzyme type and amylose content

2.1.2 復(fù)合酶比例組合篩選結(jié)果。選取α-淀粉酶和β-淀粉酶作為該試驗(yàn)的復(fù)合酶，配制不同比例的復(fù)合酶，以直鏈淀粉含量為指標(biāo)，從而得出較佳的復(fù)合比例。由表2可知，2號(hào)處理組的直鏈淀粉含量最高，為25.33%。與單一酶解效果比較，復(fù)合酶中所有處理組合的直鏈淀粉含量均高于單一酶處理組，因此該試驗(yàn)采用的復(fù)合酶配比為第2處理組，即α-淀粉酶∶β-淀粉酶為4∶6。

表2 不同復(fù)合比例組合對(duì)米粉的酶解效果

Table 2 Enzymatic results of rice flour with combined enzymes at different rations

編號(hào)No.復(fù)合酶比例Ratioofcompoundenzymes(α-淀粉酶+β-淀粉酶)α-amylasc+β-amylase)直鏈淀粉含量Amylosecontent%11∶122.6824∶625.3333∶724.7842∶822.9751∶922.5666∶423.7877∶321.0188∶220.4999∶118.751010∶0 18.5811 0∶1022.57

2.2 復(fù)合酶酶解條件單因素試驗(yàn)

2.2.1 復(fù)合酶水解pH的選擇。在酶添加量0.60 μg/g、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃條件下，研究不同酶解pH對(duì)酶解效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH對(duì)直鏈淀粉含量的影響Fig.2 Effect of different pH on amylose content

pH可影響酶分子活性中心上必需基團(tuán)的解離程度，影響催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，以及底物與酶的解離程度，從而對(duì)酶與底物的結(jié)合過(guò)程造成影響[8]。由圖2可以看出，隨pH的升高，酶解液的直鏈淀粉含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在pH 5.5左右時(shí)，米粉的酶解效果最好，可知此時(shí)復(fù)合酶與米粉中淀粉結(jié)合最好，pH低于或超過(guò)了這個(gè)較適范圍，酶的活性中心構(gòu)象就會(huì)發(fā)生改變，甚至整個(gè)酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[9]，造成酶解效果的變化。因此，復(fù)合酶的最佳酶解pH為5.5。

2.2.2 復(fù)合酶水解溫度的選擇。在pH 8.0、酶添加量0.60 μg/g、酶解時(shí)間120 min條件下，研究不同酶水解溫度對(duì)酶解效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酶解溫度對(duì)直鏈淀粉含量的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis temperature on amylose content

溫度對(duì)酶的活性至關(guān)重要，其對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面當(dāng)溫度在一定范圍內(nèi)升高時(shí)，反應(yīng)物能量增加，單位時(shí)間內(nèi)有效碰撞次數(shù)增加，反應(yīng)速率加快；另一方面由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高，在超過(guò)一定范圍之后，酶蛋白會(huì)因逐漸變性而失活，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)速度下降。由圖3可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，淀粉酶的活性受到限制，酶解反應(yīng)效率較低，直鏈淀粉含量偏低，當(dāng)溫度逐漸升高，淀粉酶的活性不斷提高，帶動(dòng)酶解反應(yīng)速率增加。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，直鏈淀粉含量最高，此后隨著酶解溫度的升高酶活性受到抑制，直鏈淀粉含量降低。研究表明，α-淀粉酶的適宜溫度在60 ℃左右[10]，而β-淀粉酶的適宜溫度在40～60 ℃[11]，故選擇復(fù)合酶適宜的酶解溫度為60 ℃左右。

2.2.3 復(fù)合酶總添加量的選擇。在pH 8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間120 min條件下，研究不同酶總添加量對(duì)酶解效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同酶總添加量對(duì)直鏈淀粉含量的影響Fig.4 Effect of different addition amount of total enzymes on amylose content

在底物充足而酶用量處在較低水平時(shí)，隨著酶用量增大，反應(yīng)速率也隨之增大；當(dāng)?shù)孜锊怀渥銜r(shí)增大酶用量，反應(yīng)速率的增大會(huì)變得緩慢，甚至出現(xiàn)下降的趨勢(shì)[12]。由圖4可知，當(dāng)復(fù)合酶總添加量為0～0.60 μg/g時(shí)，酶解液直鏈淀粉含量隨復(fù)合酶添加量的增加而不斷升高，當(dāng)添加量超過(guò)0.60 μg/g后，酶解液的直鏈淀粉含量增加不再明顯，說(shuō)明酶已經(jīng)被底物飽和，再增加酶的用量對(duì)酶解效果作用不大。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的β-淀粉酶能保持直鏈淀粉的分支結(jié)構(gòu)，但縮短了直鏈淀粉的外鏈長(zhǎng)度，從而抑制淀粉的回生[13]。因此，復(fù)合酶的最適添加量確定為0.60 μg/g。

2.2.4 復(fù)合酶解時(shí)間的選擇。在pH 8.0、酶添加量0.60 μg/g、酶解溫度50 ℃條件下，研究不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同酶解時(shí)間對(duì)直鏈淀粉含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on amylose content

由圖5可知，伴隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解效果逐漸達(dá)到最佳點(diǎn)，酶解液直鏈淀粉含量逐漸上升。在30～120 min內(nèi)，淀粉得到了快速的酶解，120 min后溶液的直鏈淀粉含量增加變得緩慢。可能的原因是酶解程度達(dá)到完全之后底物被完全酶解，酶解效率開始下降，酶解效果趨于平緩。因此，以120 min為較合適的復(fù)合酶酶解時(shí)間。

2.3 最佳酶解條件優(yōu)化 由單因素試驗(yàn)可知，復(fù)合酶處理下，直鏈淀粉含量增加，而直鏈淀粉是直接影響米粉制作的最主要因素，因此在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以直鏈淀粉含量為指標(biāo)，選取復(fù)合酶總添加量、溫度、pH和時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果如表3。

利用Design Expert 8.0分析軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以pH(X1)、酶解溫度(X2)、復(fù)合酶添加總量(X3)和酶解時(shí)間(X4)為自變量，直鏈淀粉含量(Y)為因變量，建立酶解工藝參數(shù)回歸模型，回歸方程如下：Y=-419.14+42.45X1+6.02X2+357.65X3+0.47X4+0.038X1X2-30.25X1X3-0.089X1X4-2.86X2X3+0.000 8X2X4-0.12X3X4-0.99X12-0.04X22+4.54X23+0.000 132X4。

表3 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

模型的F值為84.71，P值小于0.000 1，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型顯著。而失擬項(xiàng)P=0.146 4>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)(R2=0.988 3)較高，表明有98.83%的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋。因此，該方程擬合較好，可以用此模型來(lái)預(yù)測(cè)米粉酶解工藝。由F值可以看出，顯著影響酶解的因素由大到小依次為pH、酶解溫度、復(fù)合酶添加總量和酶解時(shí)間。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)擬合后的回歸方程進(jìn)行求解，得出最優(yōu)酶解條件為：pH為5.93，酶解溫度為55.87 ℃，酶總添加量為0.69 μg/g，酶解時(shí)間120.76 min，直鏈淀粉含量可達(dá)到26.36%。考慮實(shí)際操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為：pH為5.9，酶解溫度為56 ℃，酶總添加量為0.70 μg/g，酶解時(shí)間120 min。采用優(yōu)化后的參數(shù)條件進(jìn)行試驗(yàn)，得到實(shí)際的直鏈淀粉含量為26.28%，與預(yù)測(cè)值基本相符，而且得到的結(jié)果比任何一次單因素試驗(yàn)都好，說(shuō)明模型的適用性高，以及利用響應(yīng)面分析確定2種淀粉酶最佳復(fù)配條件具有可行性。

3 結(jié)論與討論

該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到了復(fù)合酶解技術(shù)延緩米粉回生過(guò)程的工藝條件，選取α-淀粉酶和β-淀粉酶進(jìn)行復(fù)配，通過(guò)酶解pH、酶作用溫度、酶添加量及酶作用時(shí)間等條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在pH為5.9，酶解溫度為56 ℃，酶總添加量為0.70 μg/g，酶解時(shí)間120 min的條件下，直鏈淀粉含量提高至26.28%，經(jīng)方差及回歸方程分析得到各個(gè)條件及它們之間的交互作用對(duì)于米粉支鏈淀粉含量影響顯著。因此，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化的復(fù)合酶解技術(shù)抑制淀粉回生工藝條件可用于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

α-淀粉酶普遍分布在動(dòng)物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶。它以隨機(jī)作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等[14]。α-淀粉酶來(lái)源穩(wěn)定且價(jià)格便宜，酶解效果佳，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的酶制劑之一[15]。β-淀粉酶是一種外切型糖化酶，作用于淀粉時(shí)，能從α-1，4糖苷鍵的非還原性末端順次切下1個(gè)麥芽糖單位，生成麥芽糖及大分子的β-界限糊精[12]。從而通過(guò)切短支鏈淀粉外側(cè)支鏈而抑制其回生，且隨著酶解度的增加回生抑制更加明顯。因此β-淀粉酶在制備飴糖、啤酒、飲料等工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中被大量使用成糖化劑。該研究中所篩選出的2種酶均為易得穩(wěn)定、成本可控的加工原料，在大規(guī)模生產(chǎn)中都可很好地應(yīng)用，因此，該研究所得到的加工條件具有可行性[16]。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外嬰幼兒米粉加工企業(yè)中，無(wú)論是采用輥筒干燥法或擠壓膨化法，都存在一定的技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致產(chǎn)品水溶速度慢、沖調(diào)性差，米粉沖調(diào)后質(zhì)量低和口感差等一系列問(wèn)題[17]。該研究運(yùn)用酶解法在一定程度上改善了嬰幼兒米粉產(chǎn)品的品質(zhì)，但當(dāng)前嬰幼兒米粉仍然存在衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)超標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加不足、食用方便性和穩(wěn)定性差等問(wèn)題。由于米粉作為嬰幼兒必要的谷物類輔助食品，具有很大的市場(chǎng)需求和發(fā)展前景。因此，研究更符合嬰幼兒的生理及飲食特點(diǎn)，配方科學(xué)、營(yíng)養(yǎng)全面、食用方便的新型高端米粉產(chǎn)品具有重要意義。只有對(duì)米粉加工過(guò)程進(jìn)行更加詳細(xì)和全面性的研究才能從根本上解決存在的諸多問(wèn)題，促進(jìn)米粉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

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Compound Enzyme Selection and Enzymolysis Conditions Optimization for Infant Rice Paste

LU Dong-he1,2,CHEN Shen1,2,HUANG Ying-ying1,2,YANG Cheng-long1,2*

(1.Institute of Agricultural Engineering Technology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian 350003; 2.Fujian Key Laboratory of Agricultural Product (Food) Processing,Fuzhou,Fujian 350003)

[Objective] The application of enzyme hydrolysis method in production process of infant rice paste was studied,in order to improve the content of amylopectin and restrain starch retrogradation.[Method] Through enzyme selection,compound enzyme ratio optimization,single factor analysis such as pH,temperature,enzyme dosage,time,and Box-Benhnken experimental design,conditions for delay retrogradation process by complex enzymatic hydrolysis technology were optimized.[Result] Considering the actual conditions,the optimal conditions were as follows:pH 5.9,enzymolysis temperature 56 ℃,addition amount of compound enzymes 0.70 μg/g,enzymolysis time 120 min.Under this condition the content of amylose could reach to 26.28%.Through variance and regression equation analysis,each condition and their interactions had significant effects on amylose content.[Conclusion] The optimized technique can significantly restrain starch retrogradation,the obtained conditions can be used to guide the industrial production.

Infant rice paste; Amylose; Enzyme hydrolysis; Optimal condition

福建省科技廳公益類項(xiàng)目(2014R1015-2); 福建省區(qū)域重大項(xiàng)目(2015N31010018)。

陸東和(1975- )，男，福建福州人，副研究員，博士，從事食品與發(fā)酵工程研究。*通訊作者，教授級(jí)高級(jí)工程師，從事食品與發(fā)酵研究。

2016-08-18

TS 216

A

0517-6611(2016)29-0066-05