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    應(yīng)用RNAi技術(shù)探討CAP10基因在新型隱球菌感染小鼠中對Th1-Th2型免疫的影響

    2016-12-01 02:42:27吳贊藝林梨平歐啟水林東紅徐建萍
    中國人獸共患病學(xué)報 2016年10期
    關(guān)鍵詞:莢膜動物模型比率

    吳贊藝,林 旎,林梨平,歐啟水,林東紅,陳 敏,徐建萍

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    應(yīng)用RNAi技術(shù)探討CAP10基因在新型隱球菌感染小鼠中對Th1-Th2型免疫的影響

    吳贊藝1,林 旎2,林梨平2,歐啟水1,林東紅2,陳 敏2,徐建萍2

    目的 設(shè)計siRNA表達質(zhì)粒干擾CAP10基因的合成,將siRNA干擾前與干擾后的新型隱球菌菌液經(jīng)呼吸道感染小鼠分別建立動物模型,行組織病理學(xué)檢查與細(xì)胞因子檢測,探討CAP10基因?qū)h1/Th2 免疫應(yīng)答的影響。方法 建立小鼠吸入感染隱球菌模型,在感染后第7 d(急性期),PAS染色觀察小鼠肺組織病理變化,并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測小鼠血液中的Th1(IFN-γ、TNF-α)、Th2細(xì)胞因子(IL-10)水平。結(jié)果 急性期小鼠血液內(nèi)IFN-γ、TNF-α及IL-10濃度測定分別為:對照組(uninfected組)(19.24±1.31)pg/mL,(36.94±2.04)pg/mL及(18.32±3.00)pg/mL,新型隱球菌未干擾組(WT組)(14.34±1.26)pg/mL,(25.37±1.37)pg/mL及(72.96±8.83)pg/mL,新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55)pg/mL及(38.73±4.61)pg/mL。與對照組相比,WT組和siRNA-CAP10組Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明顯降低(P<0.01),Th2細(xì)胞因子IL-10水平明顯增高。WT組與siRNA-CAP10組相比,IFN-γ及TNF-α水平未見明顯增高而IL-10水平明顯增高(P<0.01)。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分別為:對照組1.08±0.21,2.07±0.34,WT組0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10組0.38±0.04,0.69±0.09。WT組和siRNA-CAP10組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率較對照組明顯減少(P<0.01);WT組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明顯低于siRNA-CAP10組(P<0.01)。結(jié)論 在新型隱球菌感染小鼠中,CAP10基因的表達與抗真菌的免疫反應(yīng)有關(guān),其下調(diào)有利于控制新型隱球菌播散,有利于Th1/Th2比率趨于平衡,在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面有重要作用,有望成為新的分子治療靶點。

    新型隱球菌;CAP10基因;siRNA;Th1 Th2 細(xì)胞因子

    新型隱球菌是臨床上重要的病原性真菌,具有顯著的嗜神經(jīng)性,能導(dǎo)致嚴(yán)重的隱球菌性腦膜炎,癥狀重、預(yù)后差、死亡率高。其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸除了宿主免疫狀態(tài)的影響,還取決于多種毒力因子,如多糖莢膜、漆酶、脲酶、黑色素等的表達差異,其中高分子量的多聚糖莢膜是最經(jīng)典的毒力因子,然而關(guān)于莢膜毒力因子與Th1/Th2 免疫應(yīng)答的關(guān)系,以及在隱球菌病的病理生理過程中的作用尚不明朗[1-2]。

    CAP10基因是莢膜形成的關(guān)鍵基因,有研究表明,野生型的新型隱球菌中敲除CAP10基因可以導(dǎo)致莢膜丟失,且在動物模型中無致病性,但重新與CAP10基因互補后菌株形成莢膜,并在動物模型中具有毒性[3]。本研究選取CAP10基因作為研究靶點,設(shè)計siRNA表達質(zhì)粒干擾CAP10基因的合成,轉(zhuǎn)染至新型隱球菌菌株(BLS71),篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性克隆,再將siRNA干擾前與干擾后的新型隱球菌制成菌懸液經(jīng)呼吸道感染小鼠建立動物模型,行組織病理學(xué)檢查與細(xì)胞因子檢測,探討CAP10基因干擾前后的病理生理變化以及對Th1/Th2 免疫應(yīng)答的影響[4]。

    1 材料與方法

    1.1 質(zhì)粒與菌株 psilencer 4.1-CMV neo 購于Invitrogen公司,新型隱球菌菌株(BLS71)購于中國醫(yī)學(xué)真菌保藏管理中心隱球菌專業(yè)實驗室,大腸埃希菌E.coliDH5α 感受態(tài)購于Tiagen 公司。

    1.2 siRNA表達載體的構(gòu)建、連接與轉(zhuǎn)化 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的cap10 基因核苷酸序列用 Ambion 公司 siRNA 在線設(shè)計軟件設(shè)計長度為21 bp的靶向序列,并帶上HindⅢ、BamHⅠ酶切黏性末端,總長55 bp。序列為:正義鏈 5′-GATCCGGGCTTTGATGAATGGTACTTCAA-GAGAGTACCATTCATCAAAGCCCTTA-3′;反義鏈 5′-AGCTTAAGGGCTTTGATGAATGGTACTCTCTTGAAGT-ACCATTCATCAAAGCCCG-3′。制備50 μL體系,將兩條單鏈由95 ℃起至45 ℃,每遞減5 ℃溫育5 min,使單鏈退火形成雙鏈,4 ℃短期保存?zhèn)溆?。用?nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ對質(zhì)粒 psilencer 4.1-CMV neo進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物,并回收線性化產(chǎn)物。取線性載體片段4 μL,單鏈退火產(chǎn)物6 μL,T4連接酶 1 μL,10×ligase buffer 2 μL,ddH2O 7 μL,16 ℃連接20 h,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)受體菌 DH5α。挑取菌落,DNA測序驗證。

    1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽性克隆的篩選 用LiAc醋酸鋰酵母轉(zhuǎn)化試劑盒對新型隱球菌進行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。酵母完全培養(yǎng)基(YPD)篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的新型隱球菌細(xì)胞,每2~3 d更換1次新鮮篩選培養(yǎng)液,10 d后,用含50 μg/mL G418 的YPD維持培養(yǎng),第14 d收獲轉(zhuǎn)染的新型隱球菌。

    1.4 動物模型的建立

    1.4.1 實驗動物 SPF級雌性C57BL/6小鼠購于福建萊科實驗動物中心,一共48只,體重在 16~22 g,隨機分為3組,每組16只,分別為新型隱球菌未干擾組即BLS71標(biāo)準(zhǔn)株(WT組),新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組),對照組為新型隱球菌未感染組(uninfected組),感染后第7 d處死。

    1.4.2 菌懸液制備 干擾組與非干擾組分別以PBS清洗,1 200 r/min離心5 min,重復(fù)3次,再用無菌雙蒸水重懸,計數(shù)板計數(shù),調(diào)定終濃度為5×106CFU/mL,配好的菌懸液當(dāng)天使用。

    1.4.3 小鼠感染新型隱球菌模型 為模擬自然感染過程,小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,迅速以移液器移出20 μL菌懸液經(jīng)小鼠單側(cè)鼻孔接種感染。對照組小鼠接種等量PBS溶液。

    1.5 小鼠取血及肺部組織病理學(xué)檢查 接種7 d后,斷頭法處死各組小鼠,立即倒置取小鼠全身血液約1~2 mL,而后取出雙肺,迅速浸泡入福爾馬林溶液中固定24 h,隨后置入TS 12C 自動脫水機中處理,60 ℃石蠟中包埋,滑動切片機上切薄片2張,常規(guī)PAS染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化、炎癥細(xì)胞趨化狀態(tài)、新型隱球菌生長與吞噬細(xì)胞相互作用情況。

    1.6 ELISA法對小鼠血液Th1、Th2細(xì)胞因子進行定量分析 采用 ELISA 雙抗體夾心法進行測定,ELISA試劑盒購于廈門泰京生物技術(shù)有限公司,檢測過程按試劑說明書嚴(yán)格操作。結(jié)果判讀:以空白孔調(diào)零,在450 nm 處酶標(biāo)儀測定各孔吸光度(OD值),畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算出相應(yīng)標(biāo)本Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及Th2細(xì)胞因子IL-10的含量。

    2 結(jié) 果

    2.1 重組質(zhì)粒測序鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)自動基因測序儀測序(Invitrogen 公司),結(jié)果與設(shè)計序列完全相符,所含目的基因序列準(zhǔn)確無誤,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 取10 μL轉(zhuǎn)染菌懸液加入10 mL不含G418的完全培養(yǎng)基中,30 ℃ 120 r/min震蕩培養(yǎng)36 h。4 000 r/min離心5 min,棄去上清,加入5 mL含100 μg/mL的G418的完全培養(yǎng)液,每2~3 d更換1次新鮮篩選培養(yǎng)液。未能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在8~10 d可全部死亡,轉(zhuǎn)入neo抗性基因的隱球菌細(xì)胞可持續(xù)存活并增殖傳代,由此獲得穩(wěn)定的陽性克隆。用含半量篩選濃度50 μg/mL的G418完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。取少量菌液,在YPD培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)獲得單菌落。

    2.3 小鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果 肺部大體標(biāo)本可見,對照組(uninfected組,1A)肺部大小形態(tài)正常,新型隱球菌未干擾組(WT組,1B)可見肺部明顯膨大水腫,新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組,1C)水腫程度低于WT組。

    肺組織病理切片可見,感染后第7 d,新型隱球菌未干擾組(WT組,2C、2D)可見大量炎性細(xì)胞浸潤,隱球菌大量分布于全肺,部分壞死灶,肉芽腫開始形成;新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組,2E、2F)可見散在分布的隱球菌,炎性細(xì)胞浸潤程度較輕,未見明顯的壞死灶。2A、2B為正常對照。

    圖1 鼠肺石蠟包埋大體標(biāo)本Fig.1 Paraffin embedding gross specimen of mouse lung

    圖2 正常鼠肺(2A、2B)、隱球菌感染后肺組織病理變化(2C、2D、2E、2F)Fig.2 Histopathological analysis of uninfected and infected lung tissue

    2.4 Th1、Th2細(xì)胞因子定量分析結(jié)果 急性期小鼠血液內(nèi)IFN-γ、TNF-α及IL-10濃度測定分別為:對照組(uninfected組)(19.24±1.31) pg/mL,(36.94±2.04) pg/mL及(18.32±3.00) pg/mL,新型隱球菌未干擾組(WT組)(14.34±1.26) pg/mL,(25.37±1.37) pg/mL及(72.96±8.83) pg/mL,新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55) pg/mL及(38.73±4.61) pg/mL。

    圖3 Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α表達量Fig.3 Expression of Th1 cytokines (IFN-γ, TNF-α) of each group

    圖4 Th2細(xì)胞因子IL-10表達量Fig.4 Expression of Th2 cytokines (IL-10) of each group

    與對照組相比,WT組和siRNA-CAP10組Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明顯降低(P<0.01),Th2細(xì)胞因子IL-10水平明顯增高(P<0.01)。WT組與siRNA-CAP10組相比,IFN-γ及TNF-α水平未見明顯增高,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而IL-10水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖3、4)。

    2.5 Th1-Th2免疫應(yīng)答方式比較 以Th1與Th2細(xì)胞因子的比率(Th1/Th2)來反應(yīng)免疫應(yīng)答方式。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分別為:對照組1.08±0.21,2.07±0.34,WT組0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10組0.38±0.04,0.69±0.09。WT組和siRNA-CAP10組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率較對照組明顯減少(P<0.01);WT組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明顯低于siRNA-CAP10組(P<0.01)。

    3 討 論

    新型隱球菌多糖莢膜是第1個明確認(rèn)為與致病力有關(guān)的隱球菌毒力因子,為致病性隱球菌的標(biāo)志之一。新型隱球菌的莢膜在多個水平調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng),抗宿主的保護效應(yīng)機制包括:改變抗原呈遞過程使抗體無應(yīng)答性、細(xì)胞因子分泌失調(diào)、抗吞噬作用、補體缺失、白細(xì)胞遷移抑制等。CAP10基因是莢膜形成的關(guān)鍵基因,Okabayashi K等在對莢膜厚度的測量值和CAP10基因的表達量的比較中,提示了莢膜厚度與CAP10基因表達存在著相關(guān)關(guān)系[5]。本研究選取CAP10基因作為研究靶點,設(shè)計siRNA表達質(zhì)粒干擾CAP10基因的合成,從而干擾莢膜形成,探討CAP10基因表達下調(diào)對新型隱球菌感染病理生理過程的影響。為了盡可能的貼近自然感染途徑,采用單側(cè)鼻孔吸入的方式感染C57BL/6小鼠建立動物模型,感染菌量1×105CFU/鼠。由于感染新型隱球菌后小鼠的死亡時間一般為2~4周,為減少感染過程中小鼠不可控死亡造成的影響,本研究選取7 d,即感染的急性期作為觀察時間點。

    感染后第7 d肺組織病理切片顯示,新型隱球菌未干擾組(WT組)可見大量炎性細(xì)胞浸潤,隱球菌大量分布于全肺,部分壞死灶,肉芽腫開始形成;新型隱球菌干擾組(siRNA-CAP10組)可見散在分布的隱球菌,炎性細(xì)胞浸潤程度較輕,未見明顯的壞死灶;提示CAP10基因與炎癥反應(yīng)有關(guān),下調(diào)其表達可使炎癥反應(yīng)減輕。新型隱球菌感染后免疫主要依賴于宿主的細(xì)胞免疫,及其激活的相應(yīng)細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ、TNF-α等。有文獻報道[6-8]向易感小鼠接種致病性隱球菌菌株后,其Th1反應(yīng)削弱而Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生增多,表明以Th2為主的免疫應(yīng)答模式是新型隱球菌逃脫宿主清除的主要方式。本研究Th1-Th2細(xì)胞因子檢查見:較對照組,WT組和siRNA-CAP10組Th1細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α水平明顯降低(P<0.01),而Th2細(xì)胞因子IL-10水平明顯增高(P<0.01),提示CAP10基因與Th1-Th2型細(xì)胞因子分泌有關(guān),Th1應(yīng)答的擴大可以增加殺傷細(xì)胞的毒性作用,是保護性免疫,而Th2應(yīng)答的擴大可導(dǎo)致免疫清除能力下降,引起疾病播散,實驗結(jié)果符合預(yù)期。WT組與siRNA-CAP10組相比,Th2細(xì)胞因子IL-10水平明顯增高(P<0.01),而Th1型因子IFN-γ及TNF-α水平未見明顯增高則可能提示CAP10基因的表達下調(diào)主要影響Th2型免疫,其表達量與Th2型細(xì)胞因子分泌成正相關(guān)。此外,細(xì)菌、病毒等微生物感染可導(dǎo)致機體Th1/Th2平衡失調(diào)即Th1/Th2漂移現(xiàn)象,因此本研究還比較了Th1-Th2免疫應(yīng)答方式在3組間的區(qū)別,較對照組,WT組和siRNA-CAP10組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率明顯低于對照組(P<0.01);WT組IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明顯低于siRNA-CAP10組(P<0.01);提示機體受到新型隱球菌攻擊時,Th1亞群功能降低而Th2亞群功能升高,出現(xiàn)Th1/Th2漂移。在WT組Th1/Th2漂移十分顯著,這有可能使得隱球菌感染后不能被吞噬細(xì)胞有效清除,菌體反而可借助“木馬機制”進一步擴散甚至感染中樞神經(jīng)系統(tǒng);較WT組,siRNA-CAP10組Th1/Th2比率明顯升高,提示經(jīng)siRNA干擾后CAP10表達下調(diào),Th1/Th2平衡有向Th1型保護性免疫轉(zhuǎn)換的趨勢,可能有利于菌株被快速清除[9-11]。

    本研究闡明了新型隱球菌感染小鼠后急性期免疫應(yīng)答方式與CAP10基因的關(guān)系,CAP10基因的表達量變化能影響Th2型細(xì)胞因子的分泌,其下調(diào)有利于Th1-Th2比率趨向于平衡狀態(tài),有利于控制新型隱球菌播散,可影響新型隱球菌的預(yù)后、轉(zhuǎn)歸,有望成為新的分子治療靶點,為臨床調(diào)整Th1-Th2失衡提供新的線索。

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    [2]Teresa R, O’Meara J, Alspaugh A. TheCryptococcusneoformanscapsule: a sword and a shield[J]. Clin Microbiol Rev, 2012, 25(3): 387-408. DOI: 10.1128/CMR.00001-12

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    [11] Alanio A, Desnos-Ollivier M, Dromer F. Dynamics ofCryptococcusneoformans-macrophage interactions reveal that fungal background influences outcome during cryptococcal meningoencephalitis in humans[J]. mBio, 2011, 2(4): e00158-00111. DOI: 10.1128/mBio.00158-11

    RNAi technology application for evaluating effect of CAP10 gene in Th1-Th2 immune of mice infection withCryptococcusneoformans

    WU Zan-yi1, LIN Ni2, LIN Li-ping2, OU Qi-shui1, LIN Dong-hong2, CHEN Min2, XU Jian-ping2

    (1.TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

    In this study, we designed a siRNA-plasmid to lower the expression of CAP10 gene. A mouse model ofCryptococcusneoformansinfection was established by inhalation ofCryptococcusneoformansthrough one nostril. On day 7 after inoculation (acute phase), the infected lung were observed by histopathological analysis. Th1-Th2 cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-10) were detected by ELISA. In acute phase, the levels of these cytokines were (19.24±1.31)pg/mL, (36.94±2.04)pg/mL, (18.32±3.00) pg/mL in control, (14.34±1.26)pg/mL, (25.37±1.37)pg/mL, (72.96±8.83)pg/mL in Wild-Type(WT), (14.63±0.95)pg/mL, (26.22±1.55)pg/mL, (38.73±4.61)pg/mL in siRNA-CAP10 respectively. The level of IFN-γ and TNF-α were significantly lower in WT and siRNA-CAP10 groups than those in control mice, while the level of IL-10 was significantly higher in WT and siRNA-CAP10 groups than in control mice (P<0.01). Compared to siRNA-CAP10 groups, the level of IL-10 were significantly higher in WT (P<0.01), while the level of IFN-γ and TNF-α were not statistically significant difference. Using the ratio of Th1/Th2 to evaluate the status of immune response, the ratios of IFN-γ/IL-10 and TNF-α/IL-10 were 1.08±0.21, 2.07±0.34 in control, 0.20±0.03, 0.35±0.05 in WT, and 0.38±0.04, 0.69±0.09 in

    Cryptococcusneoformans; CAP10 gene; siRNA; Th1 Th2 cytokines

    Lin Ni, Email: ssytnx@126.com

    10.3969/j.issn.1002-2694.2016.10.009

    福建省自然科學(xué)基金項目(No.2013J01317);福建醫(yī)科大學(xué)苗圃基金(No.2014mp019)

    林 旎,Email:ssytnx@126.com

    1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福州 350004;

    2.福建醫(yī)科大學(xué),福州 350004

    R379.5

    A

    1002-2694(2016)10-0618-05-0893-05

    2016-02-01;

    2016-06-20

    siRNA-CAP10. The level of IFN-γ/IL-10 and TNF-α/IL-10 were significantly lower in WT and siRNA-CAP10 groups than in control mice, and the level of IFN-γ/IL-10 and TNF-α/IL-10 were significantly lower in WT than in siRNA-CAP10 mice (P<0.01). Results showed CAP10 gene expression related to antifungal immune response inCryptococcusneoformansinfection in mice. The down-regulation of CAP10 gene may control the spread ofCryptococcusneoformansand turned the ratio of Th1/Th2 back to balance. CAP10 gene played a very important role in regulating inflammatory response, which may became new molecular targets for treatment.

    Supported by the Fujian Province Natural Science Fund (No. 2013J01317), and the MP Science Fund of the Fujian Medical University (No. 2014mp019)

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