隱球菌莢膜體內(nèi)生長(zhǎng)機(jī)制研究進(jìn)展

陳敏 潘煒華 廖萬(wàn)清

(上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏管理中心隱球菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

隱球菌 (CryptococcusneoformansandCryptococcus gattii)最常侵犯人類或哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起致命的隱球菌性腦膜腦炎(Cryptococcal meningitis)，已是目前臨床上最重要的致病真菌之一［1］。近20 a來(lái)，生物醫(yī)學(xué)很多領(lǐng)域都取得重要進(jìn)展，而隱球菌病的發(fā)病率及病死率卻沒(méi)有下降，即使在醫(yī)學(xué)發(fā)達(dá)國(guó)家隱球菌性腦膜腦炎3個(gè)月內(nèi)死亡率亦達(dá)20%［2］;而艾滋病患者并發(fā)隱球菌病出現(xiàn)臨床癥狀后，若不及時(shí)接受高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 (highly active antiretroviral therapy，HARRT)及抗真菌治療，2周內(nèi)死亡率達(dá)100%［3］，這與其確切的致病機(jī)制還未揭示密切相關(guān)。莢膜是隱球菌最顯著的形態(tài)學(xué)特征性結(jié)構(gòu)，是其維持菌體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、適應(yīng)環(huán)境壓力及抵御宿主免疫細(xì)胞吞噬的第一道屏障，也是隱球菌最重要的毒性因子［4］。近年來(lái)，隱球菌莢膜表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)真菌學(xué)研究領(lǐng)域的前沿與熱點(diǎn)［1，4-5］。本文現(xiàn)就隱球菌莢膜相關(guān)致病分子機(jī)制研究進(jìn)展及其前沿性工作做一綜述。

1 隱球菌莢膜主要結(jié)構(gòu)組分

隱球菌莢膜的主要組分是葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖 (GalXM)和甘露糖蛋白(MP)，其中GXM是新生隱球菌莢膜中含量最多的多糖 (90% ～95%)，其次是GalXM(5% ～ 8%)及MP(1%)［4］。

作為隱球菌最重要的毒性因子，莢膜具有高度的親水性［6］。GXM縱貫分布于整個(gè)多糖莢膜，是構(gòu)成莢膜毒性因子的主要因素［4，7］。GXM 由一個(gè) α-(1，3)-甘露聚糖主鏈結(jié)合β-(1，2)-葡萄糖醛酸殘基和數(shù)量不定的6-○-乙?；鶚?gòu)成，其中甘露糖、葡萄糖醛酸及木糖是合成GXM的前體，不同比例的甘露糖、葡萄糖醛酸及木糖殘基可構(gòu)成不同亞型的GXM，由此根據(jù)免疫學(xué)方法將隱球菌劃分為多種血清學(xué)分型［8］。然而，迄今為止利用GXM相關(guān)熒光抗體對(duì)隱球菌多糖莢膜的物理結(jié)構(gòu)的研究卻顯示隱球菌多糖莢膜的結(jié)構(gòu)是一種復(fù)雜的、多變的、人類還沒(méi)有完全了解的多糖結(jié)構(gòu)［9-10］。與GXM不同，GalXM在莢膜中的確切位置及功能目前還不明確［4］，但有研究顯示半乳糖、甘露糖、半乳聚糖及呋喃半乳糖是合成GalXM的前體。GalXM的相對(duì)分子質(zhì)量 (1.01×105)比GXM的相對(duì)分子質(zhì)量 (1.7×106)小得多，但莢膜中的GalXM摩爾數(shù)含量比GXM要多［11］。MP是隱球菌莢膜組成中含量最少的組分，最早由人們利用13C-NMR(核磁共振碳譜)分析去除了GXM及GalXM的隱球菌培養(yǎng)上清液而發(fā)現(xiàn)［12］，對(duì)其相關(guān)研究甚少，僅有的研究結(jié)果認(rèn)為其位于莢膜最里層［13］。

2 隱球菌莢膜致病機(jī)制

一般認(rèn)為隱球菌由宿主回到自然環(huán)境中后，會(huì)通過(guò)有性繁殖的方式產(chǎn)生孢子，或芽殖產(chǎn)生莢膜包被較差的子代隱球菌 (直徑約1～3 μm)，較小的體積有利于被呼吸道吸入并迅速穿越肺泡間隔而入血，隨后其莢膜便開始迅速生長(zhǎng)增大 (直徑約4～10 μm)以抵御巨噬細(xì)胞的吞噬［4，5］。另外，隱球菌老化的莢膜組織還會(huì)脫落，其除了抑制宿主巨噬細(xì)胞的趨化作用外，還可增加腦脊液的黏稠度、降低其流動(dòng)性，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高［5］。目前，細(xì)胞免疫被認(rèn)為是人體抵御隱球菌侵襲的主要免疫方式，而單核/巨噬細(xì)胞則是人體細(xì)胞免疫系統(tǒng)抵御隱球菌侵染最主要的效應(yīng)細(xì)胞，而莢膜的主要成分-GXM起主要的抗吞噬作用［14-15］，研究顯示大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)隱球菌的吞噬效率與其莢膜的大小呈負(fù)相關(guān)［16］。2009 年，F(xiàn)rases等［17］利用動(dòng)態(tài)散射的技術(shù)(dynamic light scattering，LS)首次發(fā)現(xiàn)了隱球菌體內(nèi)抵御巨噬細(xì)胞吞噬的機(jī)制，隱球菌進(jìn)入人體后，多糖莢膜會(huì)將越來(lái)越多的糖類分子聚集在其邊緣，形成巨大的多糖結(jié)構(gòu)分子，使外膜沿著軸線向外擴(kuò)張，隱球菌莢膜增大到一定程度，巨噬細(xì)胞便無(wú)法將其吞噬。然而，人類對(duì)隱球菌侵入人體后是如何利用宿主環(huán)境中的葡萄糖等糖類分子合成新的莢膜組織還知之甚少［4，7，17］。

3 影響隱球菌莢膜表型轉(zhuǎn)化的理化因素

除了宿主體內(nèi)的隱球菌莢膜會(huì)主動(dòng)增長(zhǎng)外，微環(huán)境中理化因素的改變也可誘使新生隱球菌莢膜生長(zhǎng)、增大。5%CO2可誘使培養(yǎng)基中的隱球菌莢膜明顯生長(zhǎng)、增大，后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)也證明莢膜不相應(yīng)增大的菌株毒力較低［18］。缺乏鐵元素也被證明是促使隱球菌莢膜明顯增長(zhǎng)的一個(gè)影響因素［19］。位于不同器官的隱球菌其莢膜增大程度也有所不同，肺部的隱球菌莢膜增大最明顯［20］，可能與肺組織中低鐵、高CO2的微環(huán)境有關(guān)。值得注意的是，鐵元素是酵母真菌生長(zhǎng)發(fā)育所必須的微量元素，隱球菌在缺鐵微環(huán)境中莢膜生長(zhǎng)增大的現(xiàn)象可能是其通過(guò)此種方式增加與外界的接觸，以便更有效的吸收鐵元素適應(yīng)環(huán)境變化。稀釋后的沙氏培養(yǎng)基也能誘使隱球菌莢膜明顯生長(zhǎng)增大［21］。最近有研究發(fā)現(xiàn)二價(jià)金屬離子濃度，如Ca2+濃度可影響隱球菌莢膜增大的趨勢(shì)，適當(dāng)濃度的Ca2+可以促進(jìn)莢膜增大［22］，這與二價(jià)金屬離子可能影響侵襲態(tài)時(shí)新生隱球菌多糖莢膜GXM片段的聚集有關(guān)。微堿性的環(huán)境亦可誘使隱球菌莢膜生長(zhǎng)增大［21］，這可能與隱球菌莢膜生長(zhǎng)需要離子態(tài)的葡萄糖醛酸有關(guān)。然而，以上研究發(fā)現(xiàn)莢膜生長(zhǎng)增大的同時(shí)，隱球菌芽殖的比例卻明顯降低［4］，此現(xiàn)象提示隱球菌莢膜生長(zhǎng)增大還可能是其對(duì)惡劣生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)。另外，高鹽或高糖(10%葡萄糖)的微環(huán)境可顯著縮小隱球菌的莢膜［21］。由于多糖莢膜的增大是不可逆的，隱球菌通過(guò)芽殖產(chǎn)生適當(dāng)大小莢膜的子代，親代莢膜仍維持原來(lái)大?。?3］。

研究顯示，莢膜生長(zhǎng)增大時(shí)需要大量的原料物質(zhì)運(yùn)至莢膜表面，莢膜生長(zhǎng)配流程中GXM可能在細(xì)胞內(nèi)合成并通過(guò)小囊泡運(yùn)送至細(xì)胞外圍［24-25］，以保證能包繞迅速增長(zhǎng)的體積和表面積［4］。Gates等［26］誘導(dǎo)莢膜增大后發(fā)現(xiàn)莢膜內(nèi)出現(xiàn)密度差，最致密的區(qū)域出現(xiàn)于靠近細(xì)胞壁部分，然后向外逐漸減低，莢膜內(nèi)層密度比外層高近6倍。然而Zaragoza等［27］對(duì)C3補(bǔ)體成分標(biāo)記的莢膜生長(zhǎng)研究顯示，在莢膜增大期間其并沒(méi)有遷移，這個(gè)結(jié)果提示這種新的多糖是外來(lái)加入到C3位置上去的，實(shí)驗(yàn)中以代謝性放射標(biāo)記莢膜多糖，結(jié)果是外層莢膜隨著γ射線移動(dòng)，C3補(bǔ)體成分通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合莢膜多糖，和大多數(shù)放射性標(biāo)記物在莢膜外側(cè)結(jié)合對(duì)比，暗示其正在莢膜邊緣生長(zhǎng)發(fā)育，莢膜生長(zhǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也觀察到新的抗原決定簇出現(xiàn)于莢膜邊緣［10］，這與 Frases等［17］的研究結(jié)論一致。另外，cAMP－蛋白激酶A和MAPK等［26］信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也可以影響莢膜的生長(zhǎng)，cAMP途徑突變株莢膜不增大，其毒力亦降低，而使莢膜過(guò)度生長(zhǎng)的突變株則毒力較高［28］。

4 隱球菌莢膜表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制

隱球菌莢膜的主要結(jié)構(gòu)組成已經(jīng)明晰，但其在宿主體內(nèi)迅速生長(zhǎng)增大的分子機(jī)制人類卻還未揭示。過(guò)去十年來(lái)，人類試圖從影響隱球菌宿主體內(nèi)莢膜生長(zhǎng)的多糖合成代謝途徑及其關(guān)鍵調(diào)控基因或蛋白質(zhì)群的角度解析該現(xiàn)象，雖然取得了一些有意義的成果，但總體而言仍是任重道遠(yuǎn)。根據(jù)隱球菌全基因組信息分析，估計(jì)至少有30余個(gè)基因參與莢膜的合成及調(diào)控［29］。自隱球菌第一個(gè)莢膜合成必須基因CAP59被鑒定之后，CAP64、CAP10及CAP60等4種莢膜合成必須基因都先后被克隆出來(lái)，但其編碼產(chǎn)物確切的分子機(jī)制目前仍不清楚［30-31］。CAP59已知的功能是編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)從菌體內(nèi)向外輸送GXM等［30-33］。另外還有10余種基因參與莢膜合成及結(jié)構(gòu)重塑，如CAS1及CAS3基因參與GXM的乙?；{(diào)控;而UXS1、UGD1、CAS31、CAS32、CAS33、CAS34及CAS35基因則參與GXM木糖基化的調(diào)控［7］。而從酶的角度來(lái)講，隱球菌莢膜生長(zhǎng)過(guò)程中從單糖分子到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的GXM等多糖分子必然需要大量糖基轉(zhuǎn)移酶的參與，然而目前人類只明確了其中的一種，即木糖基轉(zhuǎn)移酶1(Cxt1p)［34］。因此，隱球菌莢膜生長(zhǎng)增大相關(guān)多糖合成代謝分子機(jī)制領(lǐng)域還迫切需要繼續(xù)研究探討。

5 總結(jié)及展望

進(jìn)入宿主體內(nèi)后，莢膜生長(zhǎng)增大是隱球菌適應(yīng)人體內(nèi)環(huán)境壓力、抵御免疫系統(tǒng)殺傷的最主要策略之一，也是一個(gè)復(fù)雜的、精確調(diào)控的多糖合成代謝及耗能的過(guò)程。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析開展隱球菌未知功能基因的研究，尤其是莢膜侵襲態(tài)生長(zhǎng)增大分子機(jī)制的研究，有著巨大的可探索空間，對(duì)提高隱球菌病臨床診治水平，維護(hù)人民生命健康具有重要意義。

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