基因沉默整合素連接酶對胰腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

魏洪吉

【摘要】 目的 探討基因沉默整合素連接酶（ILK）對胰腺癌細(xì)胞（Panc-1）上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法 培養(yǎng)Panc-1細(xì)胞， 構(gòu)建ILK-specific-shRNA慢病毒載體后， 再行轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞， 通過Western-blot技術(shù)驗證感染基因的有效性， 同時比較Panc-1細(xì)胞上皮向EMT轉(zhuǎn)化標(biāo)志性蛋白E-鈣連蛋白（E-cadherin）表達(dá)情況。結(jié)果 ①基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.572， P<0.01）。②SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電脈法（SDS-PAGE）結(jié)果：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.942， P<0.01）。結(jié)論 基因沉默ILK轉(zhuǎn)染后， 明顯抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力， 顯著上調(diào)E-cadherin 表達(dá)， 逆轉(zhuǎn)了EMT 的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 基因沉默；整合素連接酶；胰腺癌細(xì)胞；上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194

胰腺癌發(fā)病率占常見惡性腫瘤的1%～2%， 死亡率高[1]。由于多數(shù)患者在確診時己發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移， 無法進(jìn)行胰腺切除手術(shù)， 只能采用化療、放療等姑息治療手段， 隨之產(chǎn)生的副作用嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。尋找新的治療思路迫在眉睫。ILK是一種細(xì)胞內(nèi)信號蛋白， 是多種致瘤相關(guān)因素的上游交叉點， 與腫瘤的形成、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此， 研究ILK對胰腺癌細(xì)胞EMT的影響可能是一種新的治療思路。

1 材料與方法

1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；兔E-cadherin抗體、ILK多克隆抗體、BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑、PVDF膜等購自武漢博士德生物工程有限公司；低溫高速離心機(jī)購自德國Heraeus公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)膜電泳槽購自美國 Bio-Rad 公司；PCR儀（PE2400）購自美國Perking Elmer公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 針對目的基因序列， 采用siSearch和sFold兩種在線設(shè)計軟件設(shè)計核苷酸序列[3]。將自行合成的含干擾序列的雙鏈DNAoligo兩端含酶切位點的粘端連入酶切后的RNA干擾載體上， 再轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞， 對長出的克隆先進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定， 測序比對， 鑒定陽性即構(gòu)建成功。

1. 2. 2 感受態(tài)細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)染 人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株常規(guī)接種于高糖杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液中[4]（含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）， 于5%二氧化碳飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng)， 每2天換液1次。將一個上述培養(yǎng)基中的單菌落轉(zhuǎn)到SOB培養(yǎng)基中， 37℃劇烈振搖3 h， 然后轉(zhuǎn)移到無菌預(yù)冷的丙烯管中， 冷卻至0℃， 以4000 r/min離心10 min回收細(xì)胞。以0.1 mol/L CaCl2重懸， 4℃下， 4000 r/min離心10 min回收細(xì)胞， 連接反應(yīng)制備克隆連接液， 轉(zhuǎn)化。正常目的細(xì)胞在6孔板上分為三組：①空白組：未感染任何病毒；②陰性組：加陰性對照病毒感染；③陽性組：加RNAi靶點病毒感染。感染4 d后行PCR檢測。

1. 2. 3 Western blot 檢測 提取目的細(xì)胞中的蛋白， 蛋白定量法（BCA法）對蛋白進(jìn)行定量測定。再取適量蛋白樣品， 95℃加熱變性， 以SDS-PAGE分離， 每孔上樣量為100 μg。常規(guī)處理后轉(zhuǎn)至PVDF膜， 5%脫脂牛奶封閉40 min， 倒掉封閉液， 加一抗4℃孵育過夜， TBST洗膜3次， 分別加入相應(yīng)的二抗孵育1 h后TBST洗膜3次， 最后化學(xué)發(fā)光法顯影， 暗室曝光， 使用凝膠掃描儀掃描分析， 以Quantity One軟件對條帶進(jìn)行分析。

1. 2. 4 細(xì)胞遷移與侵襲實驗 細(xì)胞侵襲實驗操作如下：鑷子經(jīng)乙醇消毒后， 置于培養(yǎng)箱中達(dá)到室溫， 然后以其處理侵襲室內(nèi)的嵌入物， 加入300 μl無血清培養(yǎng)基。各組細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基重懸， 以血球計數(shù)板計數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞密度約為5×108個。取200 μl細(xì)胞懸液加入侵襲室上室嵌入物， 下室加入500 μl 胎牛血清（FBS）高于侵襲室的培養(yǎng)基， 于組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。去除培養(yǎng)基， 以棉拭子拭去非侵襲細(xì)胞， 于每孔嵌入物中加入500 μl染色液染色， 浸泡20 min， 再反復(fù)沖洗， 空氣中晾干， 以10%醋酸溶解， A570檢測。細(xì)胞遷移實驗步驟同侵襲實驗， 但下室所加FBS濃度為30%。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對Panc-1遷移和侵襲的影響 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.572， P<0.01）。

2. 2 siRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染 Panc-1 細(xì)胞后E-cadherin 表達(dá)情況 SDS-PAGE結(jié)果：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.942， P<0.01）。

3 討論

胰腺癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一， 由于胰腺癌早期診斷困難， 且易發(fā)生血液或淋巴轉(zhuǎn)移， 一般確診后生存期平均≤6個月， 5年內(nèi)生存率<5%[5]， 給社會和患者家庭造成極大負(fù)擔(dān)。癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是目前臨床研究的熱點。ILK作為整合素和生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個重要效應(yīng)物， 調(diào)節(jié)著細(xì)胞的豁附、生存、分化和凋亡， 對腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等發(fā)揮著重要作用[6]。莊翔等[7]研究顯示， ILK在人類神經(jīng)源性腫瘤、胃癌、卵巢腫瘤、黑色素瘤、肺癌中ILK表達(dá)明顯增高。上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。正常情況下EMT的發(fā)生受到嚴(yán)密調(diào)控， 但腫瘤發(fā)展過程中， EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要途徑。ILK作為EMT的誘導(dǎo)因子， 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中有與癌基因類似的效應(yīng)， 因此有效的抑制ILK的表達(dá)或降低其生物學(xué)活性是抗腫瘤治療的關(guān)鍵。E-cadherin為EMT的標(biāo)志性蛋白， ILK的過度表達(dá)則會導(dǎo)致E-cadherin的減少或缺失， 檢測E-cadherin 蛋白表達(dá)情況可反映ILK對EMT的影響。

研究顯示， 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=23.572， P<0.01）。同時， SDS-PAGE結(jié)果顯示：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）（t=28.942， P<0.01）。表明ILK可通過抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力、上調(diào)E-cadherin 表達(dá)抑制EMT發(fā)生， 可作為胰腺癌臨床治療的重要思路。

綜上所述， 基因沉默ILK可明顯抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力， 上調(diào)E-cadherin 表達(dá)， 逆轉(zhuǎn)EMT 的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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[7] 莊翔， 朱軍， 呂夢欣， 等. 特異性ILK siRNA對膀胱癌EJ細(xì)胞EMT及移植瘤生長的影響. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床， 2016， 36（2）：191-198.

[收稿日期：2016-07-26]