乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)狀態(tài)及臨床病理意義

崔 剛，張娜娜，閻 艷，鄧寶國，胡業(yè)佳，王鴻雁，王一理

(1.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，陜西 西安，710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安，710061)

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乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA
表達(dá)狀態(tài)及臨床病理意義

崔 剛1，張娜娜1，閻 艷1，鄧寶國1，胡業(yè)佳1，王鴻雁2，王一理1

(1.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所，陜西 西安，710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安，710061)

目的 研究乳腺癌局部微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ、白介素(IL)-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β mRNA表達(dá)的狀況，并與臨床病理特征相比較，探討其意義。方法 48例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)切除標(biāo)本，根據(jù)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為兩組，采用地高辛末端標(biāo)記的寡核苷酸探針，以原位雜交技術(shù)檢測腫瘤浸潤單個核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞IFN-γ、IL-10和TGF-β mRNA的表達(dá)狀況。結(jié)果 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組乳腺癌細(xì)胞TGF-β和IL-10 mRNA表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(TGF-β [%/積分指數(shù)]：46.25±12.88/0.49±0.27 vs 19.33±7.69/0.28±0.18; IL-10[%/積分指數(shù)]: 39.08±17.49/ 0.42±0.19 vs 22.58±7.87/0.33±0.17,t=4.330,P<0.01;t=2.962,P<0.05)，TGF-β mRNA在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的差別更為明顯。未檢出IFN-γ mRNA陽性腫瘤細(xì)胞。腫瘤間質(zhì)浸潤的單個核細(xì)胞中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組IFN-γ mRNA陽性細(xì)胞明顯低于TGF-β、IL-10 mRNA陽性細(xì)胞(TGF-β:35.58±13.62/0.40±0.25, IL-10:40.83±15.49/0.47±0.22 , IFN-γ:18.17±8.41/0.18±0.08,t= 3.005,P<0.05;t=4.390,P<0.01;t=3.563,P<0.01)。結(jié)論 乳腺癌組織局部微環(huán)境中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和Th2免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)明顯占優(yōu)勢，使得腫瘤免疫微環(huán)境趨于抗瘤免疫反應(yīng)抑制狀態(tài)。

乳腺癌；細(xì)胞因子；原位雜交；信使核糖核酸(mRNA)

腫瘤免疫微環(huán)境影響荷瘤宿主的抗瘤免疫反應(yīng)已得到共識[1]。已知腫瘤局部免疫微環(huán)境主要由影響免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子所決定，Th1型(T help type 1)細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，而Th2型(T help type 2) 細(xì)胞因子有利于體液免疫，調(diào)節(jié)T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的狀態(tài)，可反映調(diào)節(jié)T細(xì)胞的狀態(tài)。分析腫瘤局部不同細(xì)胞因子的狀態(tài)，能夠反映腫瘤免疫微環(huán)境是有利于抗瘤免疫擬或偏向于抑制抗瘤免疫反應(yīng)[2]。乳腺癌組織中浸潤淋巴細(xì)胞的程度與患者的預(yù)后相關(guān)，乳腺癌局部引流淋巴結(jié)的組織學(xué)反應(yīng)亦很早就受到人們的關(guān)注[3]。而對于腫瘤局部浸潤灶中單個核細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌模式，以及腫瘤細(xì)胞分泌免疫相關(guān)細(xì)胞因子的模式報道較少，然而腫瘤組織中單個核細(xì)胞的功能在很大程度上取決于所處的細(xì)胞因子微環(huán)境，因而分析乳腺癌表達(dá)特定免疫相關(guān)細(xì)胞因子的腫瘤局部浸潤灶中單個核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞狀況，更能明確其臨床病理意義。本研究采用原位雜交技術(shù)檢測了48例手術(shù)切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其淋巴結(jié)干擾素(IFN-γ,Interferon-γ)、(IL-10,Interleukin-10 )、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF- 1，Transforming growth factor- 1) 3種細(xì)胞因子mRNA表達(dá), 比較其差異并進(jìn)行半定量分析，探討細(xì)胞因子表達(dá)與腫瘤病理分期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1組織樣本與探針標(biāo)記

有48例手術(shù)切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其淋巴結(jié)標(biāo)本，均來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，患者均為女性，年齡30～72歲, 中位年齡51歲。術(shù)前均未接收放化療。依據(jù)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將標(biāo)本分為兩組，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組。探針設(shè)計則根據(jù)Genebank中人IFN-γ、IL-10和TGF-β基因序列，利用Primer 6軟件輔助設(shè)計引物如下： IFN-5′-TCA GTT ACC GAA TAA TTA GTC AGC TTT-3′，IL-105′-AGG CTT CTA TGT AGT TGA TGA AGA TGT-3′，TGF-15′-CCA AGG TGC TCA ATA AAT AGA TCT AAC-3′。3種細(xì)胞因子寡核苷酸探針由上海博亞生物技術(shù)公司合成。寡核苷酸地高辛標(biāo)記試劑盒購自德國羅氏公司(Roche, Mannheim, Germany )。探針標(biāo)記依據(jù)試劑盒操作流程進(jìn)行。

1.2 mRNA原位雜交

細(xì)胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA石蠟切片原位雜交操作過程，均在無RNA酶的環(huán)境中按常規(guī)操作進(jìn)行。切片經(jīng)脫蠟、消化和再固定，并經(jīng)梯度酒精脫水后，DEPC處理15分鐘。在42℃預(yù)雜交2h，然后在42℃下雜交22h。以梯度檸檬酸鈉鹽溶液(SSC)充分洗滌后，加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體于37℃作用2h，用NBT/BCIP底物顯色18h，甲基綠復(fù)染。結(jié)果判定：光鏡下細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)紫藍(lán)色沉淀者為陽性雜交信號。在裝有網(wǎng)格目鏡的高倍鏡下，每張切片隨機(jī)取5個高倍視野，計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，并根據(jù)細(xì)胞中陽性顆粒數(shù)的多少及顏色的深淺分為：陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)并分別記為0、1、2、3分，將陽性細(xì)胞的百分率與染色強(qiáng)度積分的乘積作為積分指數(shù)。檢測TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA在乳腺癌組織以及在腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β和白介素-10 mRNA的表達(dá)

免疫相關(guān)細(xì)胞因子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，在癌巢中呈現(xiàn)IL-10 mRNA陽性腫瘤細(xì)胞(見圖1)，TGF-β mRNA陽性細(xì)胞的分布與IL-10 mRNA陽性癌細(xì)胞相似。分別計數(shù)兩類細(xì)胞因子陽性癌細(xì)胞，顯示局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)癌組織中陽性細(xì)胞明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，見表1。引人注意的是，在癌細(xì)胞中未檢出IFN-γ mRNA陽性癌細(xì)胞。

表1 TGF-β和IL-10 mRNA陽性癌細(xì)胞分布狀態(tài)

圖1 代表性乳腺癌組織中IL-10 mRNA表達(dá)陽性癌細(xì)胞，腫瘤浸潤單個核細(xì)胞(標(biāo)尺50μm)

Fig.1 IL-10 mRNA positive cancerous cells and tumor infiltrating mononuclear cells in representative breast cancer tissues (scale 50μm)

2.2乳腺癌組織浸潤單個核細(xì)胞中免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

腫瘤浸潤單個核細(xì)胞中可見3種細(xì)胞因子mRNA陽性細(xì)胞分布，而IFN-γ mRNA陽性信號僅見于浸潤的單個核細(xì)胞(見圖2)?？傮w來說，TGF-β mRNA和IL-10 mRNA陽性細(xì)胞多于IFN-γ mRNA陽性細(xì)胞，在淋巴結(jié)受累組，TGF-β mRNA和IL-10 mRNA陽性細(xì)胞明顯多于淋巴結(jié)未受累組；即便IFN-γ mRNA陽性細(xì)胞少于其他兩種細(xì)胞因子陽性細(xì)胞，但仍可看到淋巴結(jié)未受累組IFN-γ mRNA陽性細(xì)胞多于淋巴結(jié)受累組，見表2。

表2 乳腺癌浸潤單個核細(xì)胞中免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)狀態(tài)±S)

圖2 代表性乳腺癌組織中IFN-γ mRNA表達(dá)陽性腫瘤浸潤單個核細(xì)胞(標(biāo)尺50μm)

Fig.2 IFN-γ mRNA positive tumor infiltrating mononuclear cells in representative breast cancer tissues (scale 50μm)

3討論

已經(jīng)明確，腫瘤局部是宿主免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞直接相互作用的場所，而腫瘤浸潤單個核細(xì)胞是抵抗腫瘤擬或抑制抗瘤免疫反應(yīng)最終取決于局部微環(huán)境的狀況，影響腫瘤免疫微環(huán)境的主要因素就是免疫相關(guān)細(xì)胞因子的狀態(tài)[4]。Th2型細(xì)胞因子有助于體液免疫反應(yīng)，而Th1型細(xì)胞因子則使得免疫反應(yīng)向細(xì)胞免疫偏移，有利于抗瘤免疫反應(yīng)的形成。目前已經(jīng)認(rèn)識到，TGF-β作為重要的調(diào)節(jié)T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子，在抑制抗瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。

本研究利用細(xì)胞因子特異性探針，原位雜交方法，在乳腺癌組織局部檢測TGF-β、IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-10、TGF-β等免疫抑制性細(xì)胞因子，而腫瘤浸潤單個核細(xì)胞雖然產(chǎn)生IFN-γ，但仍以IL-10、TGF-β為主，腫瘤免疫微環(huán)境顯示抗瘤免疫抑制狀態(tài)。

3.1乳腺癌細(xì)胞表達(dá)免疫抑制性細(xì)胞因子

腫瘤免疫逃逸是抗瘤免疫反應(yīng)不能奏效的主要原因，腫瘤局部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，除了腫瘤浸潤炎性細(xì)胞的影響外，與腫瘤細(xì)胞本身營造免疫抑制狀態(tài)密不可分。腫瘤細(xì)胞本身可表達(dá)免疫抑制分子，如PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞相互作用，直接作用于局部浸潤的免疫潛能細(xì)胞，從而抑制抗瘤免疫反應(yīng)[6]。另一方面，腫瘤細(xì)胞還可以分泌多種免疫抑制因子，影響腫瘤浸潤單個核細(xì)胞的分化和功能[7]，涉及腫瘤血管形成，侵襲以及免疫抑制，包括血管內(nèi)皮生長因子，TGF-β，巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)等。TGF-β作為多功能性細(xì)胞因子，可抑制免疫反應(yīng)，刺激腫瘤血管和腫瘤基質(zhì)的形成。抑制淋巴細(xì)胞的分化、增殖和功能啟動，從而使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤組織的轉(zhuǎn)移[8-9]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞可明顯產(chǎn)生IL-10、TGF-β等免疫抑制因子。無論是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組或淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，這種免疫微環(huán)境有利于調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化和體液免疫反應(yīng)偏移，也反映了乳腺癌組織自主的免疫抑制微環(huán)境營造能力。

3.2腫瘤浸潤單個核細(xì)胞主要表達(dá)免疫抑制性細(xì)胞因子

腫瘤浸潤單個核細(xì)胞是荷瘤宿主對腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的有力證據(jù)，但免疫反應(yīng)是否奏效則取決于浸潤細(xì)胞的種類和局部免疫微環(huán)境。細(xì)胞因子的變化在腫瘤局部免疫微環(huán)境中所起的作用越來越受到人們的重視。過去認(rèn)為大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為弱免疫原性，不能激活宿主的免疫系統(tǒng)。近來發(fā)現(xiàn)，所謂不具免疫原性持續(xù)生長的腫瘤能夠活化腫瘤特異性T細(xì)胞，但這些腫瘤抗原特異性T細(xì)胞分泌Ⅱ型細(xì)胞因子(如IL-10和TGF- β)。相反，具有免疫原性的腫瘤能誘發(fā)Ⅰ型免疫應(yīng)答，分泌大量腫瘤特異性IFN-γ 。這些實(shí)驗表明，所謂的不具免疫原性和具有免疫原性的腫瘤都能引起免疫應(yīng)答，但其所誘發(fā)的免疫應(yīng)答類型與腫瘤的結(jié)局緊密相關(guān)。誘發(fā)Ⅰ型應(yīng)答的腫瘤可以被排斥，而誘發(fā)Ⅱ型應(yīng)答的腫瘤則持續(xù)生長[10]。因此，腫瘤在體內(nèi)持續(xù)生長的原因也許并非是不能被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，而是主要刺激Th2細(xì)胞反應(yīng)，腫瘤局部微環(huán)境中參與免疫抑制的Ⅱ型細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位。本實(shí)驗結(jié)果顯示，乳腺癌組織浸潤的單個核細(xì)胞中，IL-10和TGF-β陽性細(xì)胞占主導(dǎo)地位，而IFN- 陽性細(xì)胞明顯少于前兩者，隨著腫瘤進(jìn)展，這種現(xiàn)象愈加明顯。IL-10和TGF- β為典型的Ⅱ型細(xì)胞因子，通過影響機(jī)體免疫的多種途徑抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，如抑制抗原提呈，抑制抗原特異性T細(xì)胞分化和Ⅰ型細(xì)胞因子產(chǎn)生，對形成乳腺癌患者的免疫抑制狀態(tài)起著十分關(guān)鍵的作用，也是重要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子[11]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的抗瘤免疫抑制作用已被廣泛認(rèn)可，雖然本實(shí)驗未對腫瘤浸潤單個核細(xì)胞進(jìn)行分類，但通過檢測免疫抑制性細(xì)胞因子陽性細(xì)胞，也能夠揭示腫瘤組織中浸潤免疫潛能細(xì)胞的功能狀態(tài)。

毫無疑問，腫瘤局部微環(huán)境的變化是復(fù)雜的，僅僅分析數(shù)種免疫相關(guān)細(xì)胞因子難以全面闡明乳腺癌的免疫微環(huán)境，但TGF-β、IL-10和IFN-γ這3種代表性的細(xì)胞因子的變化趨勢，在一定程度上反映了乳腺癌局部微環(huán)境免疫抑制的狀態(tài)。

[1]Kline J, Zhang L, Battaglia L,etal. Cellular and molecular requirements for rejection of B16 melanoma in the setting of regulatory T cell depletion and homeostatic proliferation[J]. Immunol,2012,188(6):2630-2642.

[2]Dennis K L, Blatner N R, Gounari F,etal.Current status of interleukin-10 and regulatory T-cells in cancer[J].Curr Opin Oncol,2013,25(6): 637-645.

[3]Bierie B, Moses H L.Transforming growth factor beta (TGF-beta) and inflammation in cancer[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2010, 21(1): 49-59.

[4]劉镕,趙琴平,董惠芬,等.TGF-β信號傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能[J].中國病原生物學(xué)雜志，2014,9(1):77-83.

[5]Katz L H, Li Y, Chen J S,etal.Targeting TGF-β signaling in cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2013,17(7):743-760.

[6]Kim J R,Moon Y J,Kwon K S,etal.Tumor infiltrating PD1-positive lymphocytes and the expression of PD-L1 predict poor prognosis of soft tissue sarcomas[J].PLoS One,2013,8(12):e82870.

[7]Lievense L A,Cornelissen R,Bezemer K,etal.Pleural Effusion of Patients with Malignant Mesothelioma Induces Macrophage-Mediated T Cell Suppression[J].J Thorac Oncol,2016,11(10):1755-1764.

[8]Furuta C, Miyamoto T, Takagi T,etal.Transforming growth factor-β signaling enhancement by long-term exposure to hypoxia in a tumor microenvironment composed of Lewis lung carcinoma cells[J].Cancer Sci, 2015,106(11):1524-1533.

[9]Hassuneh M R, Nagarkatti M, Nagarkatti P S.Role of interleukin-10 in the regulation of tumorigenicity of a T cell lymphoma[J].Leuk Lymphoma,2013,54(4):827-834.

[10]Tanikawa T, Wilke C M, Kryczek I,etal.Interleukin-10 ablation promotes tumor development, growth, and metastasis[J].Cancer Res,2012,72(2):420-429.

[11]Matise L A, Palmer T D, Ashby W J,etal.Lack of transforming growth factor-β signaling promotes collective cancer cell invasion through tumor-stromal crosstalk[J].Breast Cancer Res,2012,14(4):R98.

[專業(yè)責(zé)任編輯：張冠軍]

Expression status of immune related cytokines mRNA in local microenvironment of breast cancer and its clinicopathologic significance

CUI Gang1, ZHANG Na-na1, YAN Yan1, DENG Bao-guo1, HU Ye-jia1, WANG Hong-yan2, WANG Yi-li1

(1.Institute of Cancer Research, School of Basic Medical Sciences, Xi’an Jiaotong University,Shaanxi Xi’an 710061, China;2.Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the expression status of immune related cytokines IFN-γ, IL-10 and TGF-β mRNA in breast cancerous microenvironment and make comparison with clinicopathologic features to explore its significance. Methods Forty-eight samples of breast cancer with excised axillary lymph nodes were included. The samples were divided into two groups according to lymph node metastatic status. Digoxin-labeled oligonucleotide probes and in situ hybridization technique were used to detect the expressions of IFN-γ, IL-10 and TGF-β mRNA in breast cancer cells and the tumor infiltrating mononuclear cells. Results The expressions of TGF-β and IL-10 mRNA in breast cancerous cells were significantly higher in node metastatic group compared to those of non-metastatic group (TGF-β[%/accumulative index]:46.25±12.88/0.49±0.27 vs 19.33±7.69/0.28±0.18; IL-10[%/accumulative index]: 39.08±17.49/0.42±0.19 vs 22.58±7.87/0.33±0.17,t=4.330,P<0.01;t=2.962,P<0.05). The difference in expression of TGF-β mRNA in breast cancer cells was more significant. IFN-γ mRNA positive cancer cell was not detected. In tumor infiltrating mononuclear cells, the IFN-γ mRNA positive cells in node metastatic group were significantly less than TGF-β and IL-10 mRNA positive cell (TGF-β:35.58±13.62/0.40±0.25, IL-10:40.83±15.49/0.47±0.22, IFN-γ:18.17±8.41/0.18±0.08,t=3.005,P<0.05;t=4.390,P<0.01;t=3.563,P<0.01).Conclusion Treg and Th2 related cytokines are predominated in local microenvironment of breast cancer and the microenvironments of breast cancer demonstrate an immunoinhibitory status in terms of anticancer immune response.

breast cancer; cytokine; in situ hybridization; mRNA

2016-07-12

崔 剛(1963-)，男，副教授，碩士，主要從事腫瘤病理的研究。

王一理，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.014

R737.9

A

1673-5293(2016)10-1207-03