MTHFR和MTRR的SNP多態(tài)性與漢族孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析

王開(kāi)林

(昆山市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 昆山 215331)

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MTHFR和MTRR的SNP多態(tài)性與漢族孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析

王開(kāi)林

(昆山市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 昆山 215331)

目的 探究MTHFR和MTRR的SNP多態(tài)性與漢族孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。方法 選取2012年1月至2015年2月無(wú)明確原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)而至昆山市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的非妊娠婦女190例歸為觀察組，另外選取同時(shí)間段進(jìn)行體檢的健康非妊娠婦女180例為對(duì)照組，比較兩組婦女MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。結(jié)果 觀察組婦女MTHFR基因C677TT等位基因分布頻率為32.11%，對(duì)照組為21.94%，觀察組顯著高于對(duì)照組(χ2=9.647，P=0.002)。觀察組婦女MTHFR基因A1298C等位基因分布頻率為34.47%，對(duì)照組為30.83%，兩組比較無(wú)顯著性差異(χ2=1.113，P=0.291)。觀察組婦女MTRR基因A66GG等位基因分布頻率為32.37%，對(duì)照組為15.28%，觀察組顯著高于對(duì)照組(χ2=29.558，P=0.000)。結(jié)論 MTHFR基因C677T位點(diǎn)、MTRR基因A66G位點(diǎn)的多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)。

MTHFR；MTRR；SNP；漢族孕婦；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；相關(guān)性

美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)定義為孕20周前出現(xiàn)2次及以上的流產(chǎn)，引發(fā)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的因素較多，主要包括生殖器官畸形、染色體異常、內(nèi)分泌及免疫功能紊亂、遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)不良和環(huán)境因素等，還有約45%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因尚不明確，醫(yī)學(xué)上稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)妊娠結(jié)局與孕婦體內(nèi)葉酸含量關(guān)系密切，體內(nèi)葉酸水平較低可增加子癇前期、胎盤早剝、神經(jīng)管畸形及復(fù)發(fā)性流暢等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，而亞甲基四氫葉酸還原酶基因(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)及甲硫氨酸合成還原酶基因(methyltransferase reductase，MTRR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，而且這兩種酶在不同國(guó)家地區(qū)及不同民族中呈多態(tài)性分布[2]。我國(guó)對(duì)此相關(guān)研究較少，故本研究深入探討了MTHFR和MTRR的基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與漢族孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性，以期為臨床診治復(fù)發(fā)性流暢提供新的思路和數(shù)據(jù)參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月至2015年2月無(wú)明確原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)而至昆山市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的非妊娠婦女190例歸為觀察組，年齡21～40歲，平均年齡(29.8±6.9)歲；另外選取同時(shí)間段于昆山市第四人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康非妊娠婦女180例歸為對(duì)照組，年齡21～40歲，平均年齡(29.8±6.9)歲。

1.2病例納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)

①觀察組需為流產(chǎn)2次或2次以上的婦女，對(duì)照組婦女為健康無(wú)妊娠史或成功妊娠1次者；②夫妻雙方染色體檢查結(jié)果正常或結(jié)構(gòu)正常，且均無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)遺傳史；③輸卵管、子宮影像學(xué)檢查生殖器正常；④月經(jīng)周期、血糖、甲狀腺功能及甲狀腺激素水平等內(nèi)分泌指標(biāo)正常；⑤知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)

①支原體、巨細(xì)胞病毒等細(xì)菌、病毒感染者；②近期(3個(gè)月)內(nèi)接受過(guò)維生素補(bǔ)充治療的婦女；③患有嚴(yán)重肝、腎等臟器疾病者；④妊高癥或?qū)m內(nèi)胎兒死亡病史者；⑤有靜脈血管栓塞史者。

1.3樣本DNA采集

由婦產(chǎn)科醫(yī)師采集樣本，應(yīng)用專業(yè)口腔黏膜上皮細(xì)胞采樣刷于受檢者口腔內(nèi)側(cè)上下刮拭5余次，注意刮拭力量為略鼓起最佳，用柱式抽提試劑瓶抽提待檢者樣本DNA。

1.4基因檢測(cè)

應(yīng)用Taqman-MGB 技術(shù)對(duì)MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢查，相關(guān)試劑、儀器均購(gòu)于美國(guó)ABI公司，Taqman Uneiversal Master Mix貨號(hào)4326701。熒光定量PCR反應(yīng)用于MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG的定量測(cè)定。各個(gè)反應(yīng)體系總體積為10μL，包括2×Taqman Uneiversal Master Mix 5μL，20ng/μL的DNA模板1μL，去離子水3.5μL，20×Taqman-MGB 探針0.5μL。以10min 95℃為反應(yīng)條件，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(15s，92℃；1min，60℃)，隨后30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(15s，80℃；90s，60℃)，反應(yīng)結(jié)束于4℃條件下保存。在熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI700)上讀取樣品孔終點(diǎn)熒光，分析各樣本基因分型結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)雙人錄入后，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用例或百分率表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組年齡的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，兩組各位點(diǎn)基因頻率的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05記為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組婦女亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T位點(diǎn)基因頻率比較

觀察組婦女MTHFR的C677TT基因頻率(15.26%)明顯高于對(duì)照組婦女(1.11%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；觀察組婦女MTHFR的C677TT等位基因分布頻率(32.11%)明顯高于對(duì)照組(21.94%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)表1。

表1 兩組婦女MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因頻率比較[n(%)]

2.2兩組婦女甲基四氫葉酸還原酶基因A1298C位點(diǎn)基因頻率比較

觀察組婦女MTHFR的A1298C基因分布頻率與等位基因分布頻率和對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組婦女MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因頻率比較[n(%)]

2.3兩組婦女甲硫氨酸合成還原酶基因A66GG位點(diǎn)基因頻率比較

觀察組婦女MTRR的A66GG基因頻率(12.11%)明顯高于對(duì)照組婦女(4.44%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)；觀察組婦女MTRR的A66GG等位基因分布頻率(32.37%)明顯高于對(duì)照組(15.28%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見(jiàn)表3。

表3 兩組婦女MTRR基因A66GG位點(diǎn)基因頻率比較 [n(%)]

3討論

3.1復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病與凝血機(jī)制的關(guān)系

現(xiàn)階段復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病與凝血機(jī)制的研究關(guān)注度日趨升高，凝血機(jī)制變化因素主要分為遺傳性凝血及獲得性凝血。李秀娟[3]的研究發(fā)現(xiàn)遺傳性凝血機(jī)制與基因的多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)性，葉酸的關(guān)鍵酶MTHFR及MTRR可通過(guò)影響葉酸的代謝而使血液發(fā)生高凝。MTHFR可催化亞甲基四氫葉酸生成N5-甲基四氫葉酸參與到嘌呤及胸腺嘧啶的合成過(guò)程中，進(jìn)而影響DNA的修復(fù)合成[4]。此外，N5、N10亞甲基四氫葉酸形成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)，而SAM為重要的甲基供體，與甲硫氨酸代謝過(guò)程中的半胱氨酸(homocysteine，Hcy)關(guān)系密切[5]。MTHFR及MTRR出現(xiàn)基因突變后可改變酶的熱穩(wěn)定性及活性，進(jìn)而影響葉酸的代謝及合成，降低機(jī)體N5-甲基四氫葉酸水平，造成SAM及甲硫氨酸的合成障礙，DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶活性下降可造成S-腺苷同型半胱氨酸及Hcy沉積，引發(fā)高同型半胱氨酸血癥，而高同型半胱氨酸血癥可影響DNA的甲基化水平及合成、修復(fù)，是導(dǎo)致胎兒出生缺陷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。

3.2基因多態(tài)性的作用機(jī)制

MTHFR及MTRR呈多基因多態(tài)性(SNP)分布，其中以MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性研究最多，據(jù)研究顯示上述基因的多態(tài)性對(duì)血清、紅細(xì)胞葉酸濃度及編碼酶活性影響顯著[7]。而我國(guó)對(duì)上述基因的多態(tài)性相關(guān)研究較少，故此本研究深入探討了MTHFR和MTRR的SNP多態(tài)性與漢族孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性，以期為臨床診治復(fù)發(fā)性流暢提供新的思路和數(shù)據(jù)參考。

有研究報(bào)道：MTHFR C677T突變可能是早期妊娠丟失的遺傳易感性因素，與CC基因型個(gè)體相比，TT基因型的個(gè)體發(fā)生早期妊娠丟失的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)3.596倍[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)觀察組婦女MTHFR基因C677TT等位基因分布頻率明顯高于對(duì)照組婦女，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；觀察組婦女MTHFR基因A1298C等位基因分布頻率與對(duì)照組婦女相比無(wú)顯著性差別，比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組婦女MTRR基因A66GG等位基因分布頻率明顯高于對(duì)照組婦女，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果提示MTHFR基因C677TT及MTRR基因A66GG的基因多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生具有相關(guān)性。

MTHFR基因長(zhǎng)19.2kb，mRNA長(zhǎng)7 009bp，位于染色體的1p36.3處。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是第677位點(diǎn)，常在此區(qū)域發(fā)生C→T堿基替換，編碼蛋白質(zhì)可由丙氨酸轉(zhuǎn)為纈氨酸。此外，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)第1 298位點(diǎn)也常發(fā)現(xiàn)基因突變。MTHFR共含12個(gè)外顯子，C6777T處于第5個(gè)外顯子，可使Ala轉(zhuǎn)變?yōu)閂al，降低MTHFR的酶熱穩(wěn)定性及活性。較677CC基因型，TT基因型的酶活性可下降20%以上[9]。A1298C處于第8個(gè)外顯子，可使Glu轉(zhuǎn)變?yōu)锳la，降低MTHFR的酶熱穩(wěn)定性及活性。Hou 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者M(jìn)YHFR的677T的等位基因頻率明顯高于正常組，證實(shí)T等位基因是引發(fā)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的高危因素，與本研究結(jié)果相符。 MTRR可催化半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，是半胱氨酸第66位點(diǎn)的A堿基向G堿基突變，因而編碼蛋白質(zhì)由蛋氨酸轉(zhuǎn)變成異亮氨酸，降低了MTRR的酶活性。吳文慶等[11]研究發(fā)現(xiàn),MTRR66發(fā)生純合突變成GG基因型的女性血漿中半胱氨酸含量下降但是葉酸含量升高，具體機(jī)制尚不明確，人群中MTRR活性cDNA序列的G等位基因頻率為0.53，當(dāng)女性出現(xiàn)MTHFR突變或鈷胺素水平下降時(shí)，可增加不良孕產(chǎn)的危險(xiǎn)性。

本文經(jīng)過(guò)研究認(rèn)為對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)孕婦且葉酸基因出現(xiàn)突變患者，可通過(guò)補(bǔ)給大劑量葉酸降低流產(chǎn)率，但最佳劑量的多少及是否可以長(zhǎng)期服用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點(diǎn)、MTRR基因A66GG位點(diǎn)的多態(tài)性可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因，這對(duì)孕期指導(dǎo)補(bǔ)充劑檢測(cè)葉酸，降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)率具有重要意義。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Correlation analysis of SNP polymorphisms of MTHFR and MTRR with recurrent miscarriage of Han Chinese pregnant women

WANG Kai-lin

(Department of Gynecology and Obstetrics, Kunshan NO.4 People’s Hospital，Jiangsu Kunshan 215331, China)

Objective To explore the correlation of Single nucleotide polymorphisms (SNP) polymorphism of MTHFR and MTRR with recurrent miscarriage of Han Chinese pregnant women. Methods Between January 2012 and February 2015 190 non pregnant women with no clear cause of recurrent abortion visiting Kunshan NO.4 People’s Hospital were selected in observation group, and 180 healthy non pregnant women taking medical examination at the same period were selected in control group. SNP in C677T and A1298C loci of MTHFR gene and A66G locus of MTRR gene were compared between two groups. Results In the observation group frequency distribution of C677T allele in MTHFR gene was significantly higher than in the control group (32.11% vs 21.94%), and the difference was statistically significant (χ2=9.647,P=0.002). Frequency distribution of A1298C allele in MTHFR gene was 34.47% in the observation group and 30.83% in the control group, and the difference was not significant (χ2=1.113,P=0.291). In the observation group frequency distribution of A66G allele in MTRR gene was significantly higher than in the control group with statistical significance (32.37% vs 15.28%,χ2=29.558,P=0.000).Conclusion The polymorphism of C677T locus of MTHFR gene and A66G locus of MTRR gene is closely related to recurrent abortion.

methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)；methyltransferase reductase (MTRR)；single nucleotide polymorphisms (SNP)；Han Chinese pregnant women; recurrent abortion; correlation

2016-06-23

王開(kāi)林(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.010

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1195-03