子宮腺肌病小鼠的藥物療效及其疼痛機(jī)制

李清，王杰玉，張曉丹，張旭垠，馮煒煒，華克勤

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200090)

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子宮腺肌病小鼠的藥物療效及其疼痛機(jī)制

李清，王杰玉，張曉丹，張旭垠，馮煒煒，華克勤*

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200090)

目的 了解腺肌病小鼠藥物治療療效及疼痛機(jī)制。方法 他莫昔芬法建模。以不同藥物治療后，監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)情周期，檢測(cè)5-HT、GnRH-R、NGF、NF的水平。結(jié)果 對(duì)照組5-HT水平明顯高于造模組。GnRH-R及NGF在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜的表達(dá)顯著低于異位內(nèi)膜。NF在正常內(nèi)膜的表達(dá)顯著低于在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜。結(jié)論 與全量抑那通相似，半量抑那通可減緩腺肌病進(jìn)展，但對(duì)動(dòng)情周期影響無明顯優(yōu)勢(shì)。全量抑那通后使用達(dá)英-35可鞏固療效。5-HT可能在腺肌病疼痛機(jī)制中發(fā)揮作用。

子宮腺肌??；ICR小鼠；模型；疼痛；治療

子宮腺肌病是一種常見的婦科疾病，在手術(shù)切除的子宮標(biāo)本中，6%～40%有子宮腺肌病[1]。臨床上GnRH-a(gonadotropin-releasing hormone agonist，促性腺激素釋放激素類似物)可有效緩解癥狀，但長(zhǎng)期應(yīng)用易出現(xiàn)圍絕經(jīng)期癥狀；低劑量GnRH-a可應(yīng)用于子宮肌瘤及體重較輕的腺肌病患者，改善癥狀同時(shí)降低圍絕經(jīng)期癥狀，但應(yīng)用尚不普遍。研究指出，疼痛可能通過5-HT(5-hydroxytryptamine，5-羥色胺)和其他神經(jīng)元系統(tǒng)起作用。而5-HT的代謝產(chǎn)物-褪黑素，可用來減輕內(nèi)異癥患者的疼痛。本文擬構(gòu)造腺肌病小鼠模型，并以褪黑素、GnRH-a、達(dá)英-35等處理小鼠，檢測(cè)與疼痛密切相關(guān)的抗體NGF(nerve growth factor，神經(jīng)生長(zhǎng)因子)，NF(neurofilament，神經(jīng)纖絲)的表達(dá)，并檢測(cè)小鼠血清中5-HT水平及小鼠子宮GnRH-R(gonadotropin-releasing hormone receptor，促性腺激素釋放激素受體)，從而了解子宮腺肌病小鼠不同藥物治療方法及疼痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制作

SPF級(jí)ICR雌性小鼠70只，體重1.8～2.2 g，來源于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]。無菌術(shù)在復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK(滬)2014-0029]進(jìn)行并按3R原則給予人道關(guān)懷。隨機(jī)分為造模組與對(duì)照組(各35只)。造模組小鼠于2～5 d ( day, 日齡)滴喂5 μL/g的花生油/卵磷脂/煉乳混合液(體積比2∶0.2∶3)，并加入2.7 μmol/kg的他莫昔芬( Sigma，T5648-100MG)。所有小鼠每天光照12 h，1～21 d均由母鼠哺乳飼養(yǎng)，22 d起與母鼠分籠，自由攝食飲水。

1.2 動(dòng)物分組及藥物處理

造模組(M)及對(duì)照組(C)按照藥物處理的不同各分為7個(gè)亞組，每亞組5只小鼠。①模型驗(yàn)證組(M1,C1)：49 d處死，驗(yàn)證造模是否成功。②褪黑素組(M2,C2)：小鼠50 d起予褪黑素(上海源葉生物，Z01022LA13)100 μg灌胃，共10 d。③全量抑那通組(M3,C3)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林(上海源葉生物，TL0249-25MG)20 μg皮注處理，51～71 d予生理鹽水75 μg灌胃。④全量抑那通后達(dá)英組(M4,C4)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林20 μg皮注處理，51～71 d予達(dá)英-35 75 μg灌胃。⑤半量抑那通組(M5,C5)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林10 μg皮注處理， 51～71 d予生理鹽水75 μg灌胃。⑥半量抑那通后達(dá)英組(M6,C6)：小鼠50 d，予醋酸亮丙瑞林10 μg皮注處理，51～71 d予達(dá)英-35 75 μg灌胃。⑦空白組(M7,C7)：小鼠50 d時(shí)，予生理鹽水每只20 μg皮注處理。

1.3 動(dòng)情周期檢測(cè)

隨機(jī)選擇造模組與對(duì)照組各組10只小鼠，于42、70 d，連續(xù)5 d行陰道脫落細(xì)胞法以瑞氏染液染色觀察其動(dòng)情周期。

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

M1、C1組于49 d、余亞組于75 d摘除雙側(cè)眼球取血后處死，取小鼠子宮石蠟包埋后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肌層是否出現(xiàn)內(nèi)膜成分浸潤(rùn)并拍照。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)5-HT值

采用雙抗體夾心ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法檢測(cè)小鼠血清中5-HT水平。比色法測(cè)定A(optical density，光密度)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度( ng/L)。試劑盒(北京城林生物，E-20434)。

1.6 免疫組化法檢測(cè)小鼠子宮NGF，NF，GnRH-R的表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)小鼠子宮NGF ( Ab6199, 1∶100)，NF ( Ab24574, 1∶100)，GnRH-R ( Ab183079, 1∶30) 的表達(dá)，抗體均購(gòu)自Abcam公司。兩位研究者雙盲閱片，讀取400倍視野中PP值(percentage of positive cells，陽性細(xì)胞百分比)(0：0%～25%；1：26%～50%；2：51%～75%；3：>75%)及SI值(staining intensity，染色強(qiáng)度)(0=陰性，1=弱陽性，2=中陽性，3=強(qiáng)陽性)，對(duì)于胞核表達(dá)指標(biāo)，計(jì)算PP與SI乘積，采用IRS(immunoreactive score，免疫反應(yīng)積分法)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分；對(duì)于胞質(zhì)表達(dá)指標(biāo)，根據(jù)SI得出IHC-score(immunohistochemical score,免疫組化評(píng)分)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠建模情況

70只小鼠中，M5組死亡1只，M7組死亡1只，病檢未及明顯異常，余小鼠無死傷。各組小鼠子宮外形未見明顯異常。以腺體或間質(zhì)成分侵入子宮肌層診斷為小鼠子宮腺肌病。不同疾病進(jìn)展的HE染色結(jié)果如圖1所示，A、B、C、D分別提示無腺肌病，輕、中、重度腺肌病。對(duì)照組35只小鼠均未發(fā)展為腺肌病。造模組中，M1組5只小鼠均發(fā)展為腺肌病(輕度1，中度4)，造模成功率100%。隨著時(shí)間推移，M7組小鼠腺肌病進(jìn)展，4只小鼠均為重度腺肌病。經(jīng)不同藥物治療后，M2-M6組小鼠腺肌病病情較M7組均有所緩解，甚至M4組中一只小鼠達(dá)到病理性治愈。具體造模情況為：M2組(輕度1，中度3，重度1)，M3組(輕度1，中度4)，M4組(無病1，輕度1，中度1，重度2)，M5組(輕度1，重度3)，M6組(輕度1，中度3，重度1)。

2.2 小鼠動(dòng)情周期

小鼠動(dòng)情周期為4～6 d。本文連續(xù)5 d檢測(cè)小鼠動(dòng)情周期，以5 d內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)及以下相為異常。統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，42 d，對(duì)照組動(dòng)情周期異常比例為0%，造模組異常比例為20%；70 d，對(duì)照組異常比例為50%，造模組異常比例為30%。42 d，全量抑那通組異常比例為0%，半量抑那通組為50%；70 d，異常比例分別為25%，50%。兩組差異無顯著性。

2.3 小鼠血清5-HT水平

由圖2可見，對(duì)照組5-HT水平明顯高于造模組(P<0.001)。經(jīng)藥物處理后，C2組5-HT水平高于C7組，M2組5-HT水平高于M7組，但差異無顯著性。

2.4 小鼠子宮NGF、NF、GnRH-R表達(dá)情況

三個(gè)指標(biāo)在在小鼠內(nèi)膜及病灶的免疫組化半定量分析如圖3所示，GnRH-R在正常內(nèi)膜(P<0.001)、在位內(nèi)膜(P<0.001)的表達(dá)水平顯著低于異位內(nèi)膜。NGF在正常內(nèi)膜(P<0.05)、在位內(nèi)膜(P<0.01)的表達(dá)水平顯著低于異位內(nèi)膜。NF在正常內(nèi)膜的表達(dá)水平顯著低于在位內(nèi)膜(P<0.01)、異位內(nèi)膜(P<0.001)。進(jìn)一步分析各亞組表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)抑那通治療后，M3、M4、M5、M6組小鼠在異位內(nèi)膜NGF、NF的表達(dá)水平低于M7組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)褪黑素治療后M2組小鼠在異位內(nèi)膜NF的表達(dá)水平低于M7組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注：縱坐標(biāo)：免疫組化得分/免疫反應(yīng)積分；A.對(duì)照組正常內(nèi)膜；B.造模組在位內(nèi)膜；C.造模組異位內(nèi)膜； *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001。GnRH-R在造模組異位內(nèi)膜免疫組化評(píng)分明顯高于對(duì)照組正常內(nèi)膜及造模組在位內(nèi)膜；NGF在造模組異位內(nèi)膜免疫組化評(píng)分明顯高于對(duì)照組正常內(nèi)膜及造模組在位內(nèi)膜；NF在對(duì)照組正常內(nèi)膜免疫反應(yīng)積分明顯低于造模組在位內(nèi)膜及造模組異位內(nèi)膜。差異具有顯著性。圖3 GnRH-R、NGF及NF三個(gè)指標(biāo)在小鼠內(nèi)膜及病灶的免疫組化半定量分析Note. A. Control (normal endometrium); B. Model (eutopic endometrium); C. Model (ectopic endometrium); Ordinate scale: immunohistochemical score/ immunoreactive score; *, P<0.05; ** , P<0.01; *** , P<0.001. IHC-score for GnRH-R in group C was higher than in group A and group B; IHC-score for NGF in group C was higher than in group A and group B; IRS for NF in group A was higher than in group B and group C.Fig.3 Semi-quantitative immunohistochemical analysis of GnRH-R, NGF and NF in endometrium and lesions in the mice

3 討論

3.1 動(dòng)物模型

目前國(guó)際上主要以小鼠作為腺肌病模型動(dòng)物。SHN小鼠腺肌病自發(fā)率高，通過垂體-宮腔移植可顯著縮短發(fā)病時(shí)間，加重疾病進(jìn)展，故常用SHN小鼠作為模型動(dòng)物[2]。Suzuki[3]則將臨床患者腺肌病組織通過腹腔注射移植到裸鼠體內(nèi)構(gòu)造腺肌病小鼠模型。2001年，Parrott利用他莫昔芬誘導(dǎo)新生CD1小鼠構(gòu)造腺肌病模型。2005年，Green[4]首次使用ICR小鼠構(gòu)造腺肌病模型。因SHN系小鼠引進(jìn)困難，并發(fā)癥多，利用垂體移植術(shù)增加造模難度及小感染概率。故以他莫昔芬誘導(dǎo)新生ICR小鼠構(gòu)造腺肌病這一模型在國(guó)內(nèi)得以普及[5]。本文于ICR小鼠49 d時(shí)已成功構(gòu)造腺肌病小鼠模型，75 d小鼠腺肌病程度進(jìn)展；對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)內(nèi)膜成分侵入肌層。故本文利用他莫昔芬造模成功，腺肌病嚴(yán)重程度與造模后時(shí)間有關(guān)。M2-M6組小鼠腺肌病程度不一，內(nèi)膜成分侵入肌層程度均低于M7組，其中M4組中一只小鼠子宮肌層完全無內(nèi)膜成分侵入，提示藥物作用后，腺肌病內(nèi)膜入侵程度得到緩解，甚至病理上治愈。此外，42 d，對(duì)照組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為0%，造模組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為20%；70 d，對(duì)照組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為50%，造模組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為30%。提示腺肌病造模后，小鼠出現(xiàn)一定程度動(dòng)情周期異常。而70 d對(duì)照組與造模組均出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，考慮藥物應(yīng)用所致。

3.2 5-HT與褪黑素

5-HT是調(diào)節(jié)疼痛的重要神經(jīng)遞質(zhì)，隨著疼痛的增加，表達(dá)水平下降[6]。國(guó)內(nèi)學(xué)者龔萍等[7]發(fā)現(xiàn)痛經(jīng)可能系激素與大腦雌孕激素受體結(jié)合，引起邊緣系統(tǒng)5-HT水平下降。而5-HT的代謝產(chǎn)物褪黑素，經(jīng)Schwertner[8]研究發(fā)現(xiàn)，可用來減輕內(nèi)異癥患者的疼痛。本文首次研究了腺肌病小鼠5-HT的表達(dá)水平，并使用褪黑素治療。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠5-HT水平明顯高于造模組。經(jīng)褪黑素治療小鼠(C2、M2組)的5-HT水平高于空白組(C7、M7)，但其水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與樣本較小有關(guān)。相比空白組(M7)，經(jīng)褪黑素處理的小鼠，腺肌病嚴(yán)重程度較輕(見表1)，疼痛緩解，M2組在異位內(nèi)膜NF的表達(dá)水平低于M7組(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。本文大膽推測(cè)，5-HT低表達(dá)與腺肌病疼痛密切相關(guān)，其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用可提高5-HT水平，抑制腺肌病疾病進(jìn)展，減緩疼痛。

3.3 NGF、NF

NGF本身是一種疼痛介質(zhì),隨著腺肌病疼痛程度的加重，其表達(dá)水平不斷升高[9-11]。研究表明，NGF可增加靶器官對(duì)疼痛的敏感性，可營(yíng)養(yǎng)交感神經(jīng)結(jié)神經(jīng)元，營(yíng)養(yǎng)小感覺神經(jīng)纖維，介導(dǎo)疼痛發(fā)生[12]。此外NGF能夠誘導(dǎo)NF等的表達(dá)，可作為疼痛評(píng)估指標(biāo)之一[13-15]。目前，有關(guān)腺肌病NGF、NF的研究較少。本研究檢測(cè)了造模組與對(duì)照組小鼠用藥后NGF、NF的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)：NGF、NF在腺肌病異位內(nèi)膜中呈高表達(dá)，在正常內(nèi)膜中呈低表達(dá)，而在腺肌病在位內(nèi)膜中，NGF呈低表達(dá)，NF呈高表達(dá)。Yang[16]實(shí)驗(yàn)得出，脂質(zhì)體介導(dǎo)的NGF基因轉(zhuǎn)染僅能增加磷酸化的神經(jīng)纖絲水平，并不能增加其蛋白總量?？紤]NGF、NF兩者在腺肌病在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜的疼痛機(jī)制可能不同。子宮腺肌病在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的分離提純存在技術(shù)難關(guān)，目前相關(guān)文獻(xiàn)仍以免疫組化為主半定量分析蛋白表達(dá)，故其疼痛的具體機(jī)制、通路，有待進(jìn)一步探索。

3.4 GnRH-R

GnRH-R在在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜的表達(dá)，提示GnRH可直接作用并影響靶器官。本文發(fā)現(xiàn)，腺肌病小鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜均有GnRH-R的表達(dá)，與文獻(xiàn)相符[17]，其在異位內(nèi)膜的表達(dá)水平明顯高于在位內(nèi)膜，提示腺肌病疾病的進(jìn)展伴隨GnRH-R表達(dá)水平的改變。在抑那通治療后，M3、M4組小鼠疾病緩解，在經(jīng)達(dá)英-35后續(xù)處理后，M4組中有一只小鼠甚至達(dá)到病理治愈。M3、M4組小鼠子宮異位內(nèi)膜NF的表達(dá)水平低于M7組(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，提示GnRH可一定程度上緩解腺肌病進(jìn)展。臨床上GnRH-a應(yīng)用廣泛，可以有效緩解子宮腺肌病相關(guān)癥狀，但長(zhǎng)期應(yīng)用易出現(xiàn)更年期等副反應(yīng)。在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜均存在GnRH-R，這為低劑量GnRH-a的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。在低劑量抑那通治療后，M5、M6組小鼠疾病得到一定程度控制，M5、M6組小鼠子宮異位內(nèi)膜NF的表達(dá)水平低于M7組(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，提示半量抑那通可也緩解腺肌病進(jìn)展。鑒于小鼠卵巢較小本文未行卵巢切除及相關(guān)功能檢查，且處死小鼠時(shí)無法保證所有小鼠處于動(dòng)情間期，故未對(duì)其內(nèi)分泌水平進(jìn)行檢測(cè)。本文隨機(jī)抽取對(duì)照組與造模組各10只小鼠，檢測(cè)其5 d動(dòng)情周期的變化，發(fā)現(xiàn)70 d M3、M4組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為25%，而M5、M6組出現(xiàn)動(dòng)情周期異常比例為50%。并未能提示半量抑那通對(duì)動(dòng)情周期影響小，可能與樣本量相關(guān)。是否能夠有效控制腺肌病癥狀，同時(shí)減少副反應(yīng)，有待進(jìn)一步推廣研究。

總之，本文利用他莫昔芬法成功建立腺肌病小鼠模型，該法易于操作，成功率高。與全量抑那通相似，半量抑那通可一定程度上減緩腺肌病進(jìn)展，改善小鼠疼痛，但對(duì)動(dòng)情周期的影響無明顯優(yōu)勢(shì)。全量抑那通后序貫使用達(dá)英-35可鞏固其療效，甚至達(dá)到病理性治愈。5-HT在腺肌病疼痛機(jī)制中可能發(fā)揮一定作用，其代謝產(chǎn)物褪黑素可在一定程度上改善疼痛，減緩疾病進(jìn)展。

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Drug therapy and mechanism of pain in mice with induced adenomyosis

LI Qing, WANG Jie-yu, ZHANG Xiao-dan, ZHANG Xu-yin,FENG Wei-wei, HUA Ke-qin*

(Obstetrics and Gynecology Hospital, Fudan University, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate the effects of different drugs and to explore the mechanism of pain in mice with adenomyosis (ADM). Methods The mouse model of adenomyosis was induced by oral administration of tamoxifen. The vaginal smear was examined by cytology, and serum levels of 5-HT, GnRH-R, NGF and NF were determined. Results Higher level of 5-HT was detected in the controls compared with the models. The expression of GnRH-R and NGF in normal endometrium and eutopic endometrium were significantly lower than those in ectopic endometrium. The expression on NF in normal endometrium was significantly lower than that in the eutopic and ectopic endometria. Conclusions Similar with regular dose of GnRH-a, half dose of GnRH-a can slow down the progress of ADM as well as reducing pain. Combination of regular dose of GnRH-a and Diane-35 could consolidate the therapeutic effect and even achieve pathological cure. 5-HT may take an active part in the mechanism of pain in ADM.

Adenomyosis; ICR mice; Model; Pain; Treatment

HUA Ke-qin， E-mail: huakeqin@126.com

李清(1991-)，女，博士研究生，專業(yè)：臨床技能。Email: liqing11@fudan.edu.cn

華克勤(1962-)，女，主任醫(yī)師，博導(dǎo)，主要從事婦產(chǎn)科研究。Email: huakeqin@126.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0516-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.014

2016-04-11