營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備新方法的建立

廖偉偉 （遼寧省錦州市動物疫病預(yù)防控制中心 121000）

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備新方法的建立

廖偉偉 （遼寧省錦州市動物疫病預(yù)防控制中心 121000）

為探討營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備新方法。通用的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基制備程序分為配料、加熱溶解、滅菌、矯正pH、分裝、檢定、保存等7個步驟。通過實(shí)踐，筆者發(fā)現(xiàn)在這些步驟中，加熱溶解和滅菌可以合二為一，提高培養(yǎng)基制備速度，具備9大優(yōu)點(diǎn)。用兩種方法制備出來的培養(yǎng)基平板，進(jìn)行平行藥敏試驗(yàn)，觀察新方法制備的培養(yǎng)基質(zhì)量和使用效果。結(jié)果：培養(yǎng)基快速制備方法能夠在提高效率的同時，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，能夠運(yùn)用到實(shí)踐工作中。

瓊脂培養(yǎng)基；制備；新方法；優(yōu)點(diǎn)；試驗(yàn)

在獸醫(yī)診療工作中，常常需要運(yùn)用到藥敏試驗(yàn)。就錦州市動物疫病預(yù)防控制中心禽病門診為例，天天都有用到培養(yǎng)基平板做藥敏試驗(yàn)。由于需要大量的藥敏培養(yǎng)基平板，在長期的實(shí)踐工作中，筆者探索出了新的培養(yǎng)基制備方法?，F(xiàn)將試驗(yàn)過程總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 器材與試劑

立式壓力蒸汽滅菌器 （YXQ-LS-30SⅡ（，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。恒溫培養(yǎng)箱 （JKDP.360（，廈門醫(yī)療電子儀器廠產(chǎn)品。生物安全柜 （NU-437-400E（，美國Nuaire。試驗(yàn)室pH計 （PHSJ-3F（，上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。營養(yǎng)瓊脂粉 （批號20151005（，北京奧博星產(chǎn)品。冰箱、250ml生理鹽水玻璃瓶 （以下簡稱玻璃瓶（、棉繩、注射器針頭、無菌培養(yǎng)皿、封口塑料膜、天平、250ml量筒、自制藥敏片、蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

同時用傳統(tǒng)方法和新方法各制備10個培養(yǎng)基平板。傳統(tǒng)方法制備的培養(yǎng)基平板編號為A，新方法制備的培養(yǎng)基編平板號為B。同時進(jìn)行大腸桿菌藥敏試驗(yàn)。

2 培養(yǎng)基制備新方法

2.1 配料

按照營養(yǎng)瓊脂粉說明書給出的比例稱量出干粉倒入250ml玻璃瓶中，倒入相應(yīng)比例的純化水。然后蓋上瓶塞，再用塑料膜包裹整個玻璃瓶瓶口部分，用棉繩綁緊。最后劇烈震蕩，充分混合。瓶中的液體不要超過220ml，如果需要的量大，可以多配幾瓶。

2.2 加熱溶解與滅菌

（1（把玻璃瓶放入立式壓力蒸汽滅菌器中。用注射器6號針頭扎穿封口膜與瓶塞，針頭保留其中，使瓶中壓力與蒸汽滅菌器中的壓力同步。

（2（高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，因此必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時間，并且不可重復(fù)滅菌[1]。在立式壓力蒸汽滅菌器中121.3℃滅菌15～20min。這個濕熱滅菌的過程包含了傳統(tǒng)的培養(yǎng)基加熱溶解的步驟。

（3（滅菌15～20min后，滅菌器自動停止加熱。這時候拔除電源，讓滅菌器自然冷卻減壓。1～2h后，壓力儀表顯示為0時可以打開放氣閥，排出殘余蒸汽，使滅菌器內(nèi)外壓力一致時，帶棉布手套取出玻璃瓶，拔除注射器針頭。瓶中的培養(yǎng)基已經(jīng)完全溶解，這時候需要注意反復(fù)倒置輕搖玻璃瓶20次，使里面的液態(tài)培養(yǎng)基充分均勻透明。

2.3 矯正pH值

培養(yǎng)基配方要求的pH值為滅菌或者消毒后的pH值，即培養(yǎng)基使用前的pH值[2]。把玻璃瓶轉(zhuǎn)移到無菌操作臺或者生物安全柜中，緩慢的打開瓶塞，用試驗(yàn)室pH計進(jìn)行測量，然后用無菌的1mol/L NaOH或1mol/L HCl矯正。

2.4 分裝

待矯正后的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右就可以在無菌操作臺或生物安全柜中向培養(yǎng)皿中傾倒培養(yǎng)基了。倒入培養(yǎng)皿中的液態(tài)培養(yǎng)基要全部自然覆蓋培養(yǎng)皿的底部，厚度為3～5mm。

2.5 檢定

每批培養(yǎng)基平板制成后須經(jīng)檢定方可使用，新制成的平板培養(yǎng)基，含水量較多，不利于藥敏試驗(yàn)，應(yīng)將冷卻凝固后的平皿倒扣擱置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。24h后培養(yǎng)基平板沒有長菌才可以使用。

2.6 保存

檢定合格的培養(yǎng)基要轉(zhuǎn)移到無菌濕盒中保存，正面朝上擺放，然后一起放入2～8℃冰箱里保存。

3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)

附表 A、B培養(yǎng)基平板藥敏試驗(yàn)比較

在禽病門診采取10戶10只大腸桿菌病雞的肝臟，每份肝臟分別涂抹A、B培養(yǎng)基平板，貼上同樣的藥敏片，進(jìn)行37℃培養(yǎng)24h。觀察A、B平板大腸桿菌生長情況。觀察同類型藥敏片在A、B平板上的抑菌效果。

4 結(jié)果

4.1 新方法制作的培養(yǎng)基

新方法制作的培養(yǎng)基淡茶色透明，質(zhì)地均勻，無絮狀物或沉淀。藥敏試驗(yàn)中培養(yǎng)基平板軟硬度適中不易劃破。細(xì)菌生長方面與傳統(tǒng)方法制作的培養(yǎng)基相比較無明顯差異。

4.2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

兩種方法制備的培養(yǎng)基均能讓大腸桿菌正常生長，并且不同的藥敏片在A、B兩種培養(yǎng)基平板上的抑菌效果差別不明顯，見附表。

5 討論

本文通過培養(yǎng)基平板藥敏試驗(yàn)檢驗(yàn)了培養(yǎng)基制備新方法的可行性，從而證明在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備方法可以運(yùn)用該新方法。培養(yǎng)基制備新方法較傳統(tǒng)方法有九處優(yōu)點(diǎn)，一是縮短了制備時間；二是減少了制備器材 （電爐、石棉網(wǎng)等（；三是有效防止加熱溶解過程中的燒焦和外溢事故；四是縮短了高溫時間，減少了高溫過程對培養(yǎng)基的營養(yǎng)破壞；五是可以批量制備，不像傳統(tǒng)方法一次只能加熱溶解一個燒杯；六是實(shí)現(xiàn)了儀器標(biāo)準(zhǔn)化，不會因人的技能水平差異或者個人行為的偶然性而導(dǎo)致不同批次的培養(yǎng)基質(zhì)量差異；七是防止水分散失導(dǎo)致濃度變化；八是節(jié)省能源；九是防止電爐引起的燙傷甚至火災(zāi)。

[1]劉榮華.微生物檢測中培養(yǎng)基的制備及注意事項[J].當(dāng)代臨床醫(yī)刊,2015(1):1236.

[2]馬莉.淺談微生物試驗(yàn)室培養(yǎng)基制備[J].現(xiàn)代測量與試驗(yàn)室管理,2011(3):35-36.