川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

蔣德菊+夏荃+羅藝

【摘要】 目的：探討川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）分化為心肌細(xì)胞的特征，建立簡(jiǎn)便、高效的定向誘導(dǎo)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的體系。方法：觀察川芎含藥血清作用下ES細(xì)胞活性，誘導(dǎo)第3天起可見自發(fā)性、有節(jié)律跳動(dòng)的類胚體出現(xiàn)，第5天達(dá)到高峰，約有70%的擬胚體產(chǎn)生跳動(dòng)。用RT-PCR法在跳動(dòng)的擬胚體中檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物β-MHC的表達(dá)。結(jié)果：川芎含藥血清培養(yǎng)下的細(xì)胞β-MHC的表達(dá)水平和分化率均明顯升高，與大鼠血清組和胎牛血清組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：川芎含藥血清可明顯提高體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效率。

【關(guān)鍵詞】 川芎； 胚胎干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 心肌細(xì)胞

【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Chuanxiong containing serum significantly improved the efficiency of embryonic stem cells differentiation to cardiomyocyte in vitro.

【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte

First-authors address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005

心肌細(xì)胞移植在臨床中已經(jīng)廣泛使用，移植細(xì)胞包括多種，其中最適合于移植的細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞，主要是由于其具有較強(qiáng)的分化能力和增殖能力。胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞是研究心肌細(xì)胞分化機(jī)制的良好平臺(tái)和模型[1-2]。隨著現(xiàn)代藥學(xué)的發(fā)展，人們更加重視中藥的應(yīng)用，中藥歷史悠久，很多中藥均具有較好的活性，可用于疾病的治療，其中保護(hù)心肌功能的中藥應(yīng)用也較為廣泛，具有保護(hù)心肌、改善機(jī)體免疫功能、促進(jìn)蛋白增長(zhǎng)及防治細(xì)胞凋亡等特點(diǎn)[3-4]。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥品相比，中藥具有安全有效、價(jià)格便宜等特點(diǎn)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)利用胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 中藥川芎含藥血清的制備 選取健康未交配過的SD雄鼠30只[許可證編號(hào)：syxk（粵）2013-0085，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心]，個(gè)體質(zhì)量（200±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量組及高劑量組，每組10只。給予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎飲片置容器中，加水沒過藥面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，過濾，濃縮至含生藥1 g/mL備用），低劑量組的劑量約為正常用量（0.8 g/kg）的5倍，為4 g/kg，2次/d，連續(xù)3 d；而高劑量組則為正常用量的30倍，為24 g/kg，

2 次/d，連續(xù)3 d，空白對(duì)照組灌生理鹽水（4 mL/kg）。人與大鼠動(dòng)物等效劑量系數(shù)由《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》可知為6.3。每次給藥10 min后，對(duì)其進(jìn)行取血，將血液靜置2 h后離心（離心條件：3000 r/min，離心10 min），離心后取上清液56 ℃加熱30 min，過濾，保存于-20 ℃。體外含藥血清按20%計(jì)算[7-10]。

1.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 來源與試劑 小鼠胚胎干細(xì)胞選自中科院生化細(xì)胞研究所[11-12]；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明膠、β-巰基乙醇（β-ME）、絲裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）購(gòu)自法國(guó)Millipore公司。

1.2.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 將凍存在液氮罐中的胚胎干細(xì)胞取出，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至10 mL的ep管中，加入適量的培養(yǎng)基，采用300 rcf，10 min離心，去除上清液，加入1 mL培養(yǎng)基吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。培養(yǎng)液分四組，即：川芎血清低劑量組、川芎血清高劑量組、大鼠血清組、胎牛血清組，將收集到的川芎含藥血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL備用，各組培養(yǎng)液終濃度為20%。（1）懸滴培養(yǎng)：ES細(xì)胞中加入20%川芎含藥血清（低劑量組和高劑量組）的分化培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度設(shè)置為3.75×104/mL。細(xì)胞培養(yǎng)在6 cm培養(yǎng)皿中，取1.6 mL細(xì)胞置于10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，將內(nèi)蓋翻轉(zhuǎn)使其生長(zhǎng)，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，控制細(xì)胞懸滴液中細(xì)胞個(gè)數(shù)為1，第2天于倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)懸滴內(nèi)均含有1個(gè)，吸去PBS，加入分化培養(yǎng)基，移至6 cm中培養(yǎng)，孵育2 h。（3）貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)，大約為10個(gè)，接種至4孔板，第3天時(shí)肉眼觀察每個(gè)培養(yǎng)皿中均可見數(shù)十個(gè)EBs。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，每孔中加入2 mL分化培養(yǎng)液。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分四組，即川芎血清低劑量組，川芎血清高劑量組，大鼠血清組和胎牛血清組，每組6孔。提取總RNA并測(cè)定濃度，分析其完整性，進(jìn)而合成cDNA，β-MHC Forward：5-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3，Reverse：5-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3；GAPDH Forward：5-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3Reverse：5-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3[4-5]。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL樣品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下加熱60 s，進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循環(huán)40次。擴(kuò)增后的產(chǎn)物主要是采用熒光檢測(cè)，用ABI 7500 Software v2.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，繪制曲線表，計(jì)算Ct值，對(duì)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理后可以得出不同濃度對(duì)于細(xì)胞分化的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化 細(xì)胞培養(yǎng)2 d后呈密集狀態(tài)，一般為圓形，細(xì)胞界限和形態(tài)不明顯（圖1）；體外細(xì)胞個(gè)頭小，但生長(zhǎng)速度快（圖1～2）。川芎分化液培養(yǎng)3 d的胚胎干細(xì)胞會(huì)收縮配體，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間增加，收縮越明顯，則時(shí)間越長(zhǎng)。自發(fā)節(jié)律性收縮區(qū)域較大，且細(xì)胞形態(tài)較單一（圖3～4）。于細(xì)胞培養(yǎng)的第3 d可見零星EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動(dòng)，5 d時(shí)約有70%的EB球出現(xiàn)節(jié)律性跳動(dòng)，低、高劑量川芎血清組（圖3～4）EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞數(shù)量明顯多于胎牛血清（圖1）和大鼠血清組（圖2）。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 川芎低、高劑量含藥血清組β-MHC表達(dá)量均明顯高于胎牛血清組和大鼠血清組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；川芎低劑量組β-MHC分化率明顯高于高劑量組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3 討論

隨著人們生活水平的進(jìn)步，大部分人均處于亞健康狀態(tài)，心血管疾病是臨床上常見的疾病。心血管疾病的臨床突破主要來自胚胎干細(xì)胞的發(fā)展，胚胎干細(xì)胞會(huì)根據(jù)誘導(dǎo)自發(fā)分化成多種細(xì)胞，如心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等[13-15]。心肌細(xì)胞對(duì)于恢復(fù)正常供血、免疫功能均有重要的意義[16-17]。一般情況下，胚胎干細(xì)胞能夠自然分化，但分化率低，因此提高分化率顯得至關(guān)重要。臨床上對(duì)于胚胎干細(xì)胞的研究較為廣泛，但是研究方向各不相同，關(guān)于中藥的研究更是鳳毛麟角，因?yàn)樯婕叭梭w、細(xì)胞、動(dòng)物等各個(gè)方面，給研究工作帶來了一定的困難，但也有部分學(xué)者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向?yàn)閷⒓?xì)胞采用不同密度制成懸浮液，采用不同的方法和改變環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，分析其分化成心肌細(xì)胞的分化率。最后對(duì)具有促進(jìn)分化功能的中藥進(jìn)行相關(guān)的安全性評(píng)價(jià)，致力應(yīng)用于臨床。川芎是傘形科藁本屬植物，經(jīng)研究表明，其具有多種臨床功效，如使血管擴(kuò)張、增加腦部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本課題組在研究川芎含藥血清的胚胎毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)川芎含藥血清對(duì)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞有促進(jìn)作用（P<0.05），而且尤以低劑量組為明顯，遂建立川芎誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方法，可以提高胚胎干細(xì)胞的分化率，有利于體外獲得相關(guān)的大量心肌細(xì)胞，將其應(yīng)用于臨床研究以及藥物的研發(fā)和篩選。

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（收稿日期：2016-07-28） （本文編輯：李穎）