利用酶法制備菲律賓蛤仔抗腫瘤肽的研究

蔡康鵬， 吳靖娜， 蔡水淋， 潘 南， 蘇永昌， 劉智禹， 肖美添

(1華僑大學(xué)生物化工學(xué)院，福建 廈門(mén)，361021；2福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén)，361013)

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利用酶法制備菲律賓蛤仔抗腫瘤肽的研究

蔡康鵬1， 吳靖娜2， 蔡水淋2， 潘 南2， 蘇永昌2， 劉智禹2， 肖美添1

(1華僑大學(xué)生物化工學(xué)院，福建 廈門(mén)，361021；2福建省水產(chǎn)研究所，國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén)，361013)

為確定酶解法提取菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)抗腫瘤活性多肽的最佳工藝條件，選用5種蛋白酶在相同的料液比、酶解時(shí)間和酶添加量、各自最適溫度和pH的條件下酶解菲律賓蛤仔。通過(guò)甲醛電位滴定法和Cell counting kit-8(CCK-8)方法分別測(cè)定了菲律賓蛤仔酶解液氨基態(tài)氮含量和酶解多肽的抗腫瘤活性，分析了氨基態(tài)氮含量與A549抑制率之間的相關(guān)性。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以人非小細(xì)胞肺癌A549抑制率為指標(biāo)，正交分析優(yōu)化酶解工藝條件。結(jié)果顯示，菲律賓蛤仔的5種酶解產(chǎn)物中，風(fēng)味蛋白酶的酶解液中氨基態(tài)氮含量最高，而胃蛋白酶獲得的酶解多肽抗腫瘤活性最高。胃蛋白酶酶解菲律賓蛤仔正交實(shí)驗(yàn)確定酶解最佳工藝條件為：料液比(w/w)1∶1，pH 2.0，酶解時(shí)間1 h，酶添加量2 000 U/g，酶解溫度37 ℃。當(dāng)設(shè)定最佳酶解工藝獲得的酶解多肽濃度為20 mg/mL時(shí)，其對(duì)A549的抑制率為99.83%。研究表明，酶的種類(lèi)對(duì)菲律賓蛤仔酶解液氨基態(tài)氮含量和酶解多肽的抗腫瘤活性有較大影響，菲律賓蛤仔酶解液中氨基態(tài)氮含量與A549抑制率沒(méi)有直接的正相關(guān)性。

菲律賓蛤仔；酶解多肽；A549；抗腫瘤活性

非小肺癌目前的發(fā)病率較高[1-4]。近年來(lái)，隨著生物分離純化技術(shù)的發(fā)展，人們不斷發(fā)現(xiàn)具有抑制非小肺癌增殖的天然化合物。如：黃大川等[5]從僧帽牡蠣中提取出一種具有抑制A549細(xì)胞增殖作用的低分子活性肽BPO-L；孟翠麗等[6]發(fā)現(xiàn)雷氏大疣蛛毒素具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可直接殺死A549細(xì)胞而發(fā)揮抗癌作用。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)，俗稱(chēng)雜色蛤，廣泛分布于我國(guó)沿海地區(qū)，是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之一[7]，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖和人體必需的微量元素，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的海洋貝類(lèi)[8-10]。研究表明，菲律賓蛤仔提取物具有多種生物活性[11]。近年來(lái)有關(guān)菲律賓蛤仔提取物的研究主要集中于抗氧化、增強(qiáng)免疫力和降血壓等方面[12-15]，而對(duì)抗腫瘤的研究較少。因此，本研究采用酶解技術(shù)獲取菲律賓蛤仔酶解多肽，研究其體外抑制A549細(xì)胞增殖的作用，以期為菲律賓蛤仔抗腫瘤活性多肽制備研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菲律賓蛤仔購(gòu)于廈門(mén)某超市，吐沙1 d，洗凈、去殼、取肉、勻漿，-20 ℃保存?zhèn)溆?。人非小?xì)胞肺癌(A549)細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。試劑及其來(lái)源：中性蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(1.5萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶(5萬(wàn)U/g)和堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；Trypsin-EDTA，美國(guó)BBI Life Sciences公司；胃蛋白酶(250萬(wàn)U/g)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，北京索萊寶科技有限公司；McCoy’s 5A培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)，德國(guó)PAN Biotech公司；青霉素-鏈霉素溶液，美國(guó)HyClone公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；PB-10 pH計(jì)、電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司；Gl54DWS高壓滅菌鍋，美國(guó)Zealway公司；Class II Type B2型生物安全柜，德國(guó)ESCO公司；BPN-80CRH二氧化碳培養(yǎng)箱，昆山一恒儀器有限公司；Infinite M200 PRQ酶標(biāo)儀，瑞士NanoQuant公司；XDS-IA倒置生物顯微鏡，上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解法制備菲律賓蛤仔多肽

選用胃蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶，以料液比(w/w)1∶1、酶添加量1 000 U/g、酶解時(shí)間8 h、在最適溫度和pH的條件下酶解菲律賓蛤仔。酶解結(jié)束后，沸水浴10 min滅酶；冷卻至4 ℃，8 000 r/min離心10 min；取上清液測(cè)定氨基態(tài)氮(ANN)含量，并將上清液冷凍干燥；以無(wú)血清培養(yǎng)基溶解干燥粉末，配置成濃度20 mg/mL的溶液，過(guò)0.22 μm濾膜除菌后，測(cè)定其對(duì)A549的抑制率。

1.3.2 菲律賓蛤仔基本成分及氨基態(tài)氮含量測(cè)定

菲律賓蛤仔蛤肉中的水分、粗蛋白、灰分和粗脂肪含量均參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB5009系列[16]中的測(cè)定方法。氨基態(tài)氮(ANN)含量測(cè)定采用甲醛電位滴定法[17]。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用[18]。選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，按照2.5×104mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)17 h后棄培養(yǎng)基。設(shè)置對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基+細(xì)胞)、加藥組(20 mg/mL藥物+細(xì)胞)和空白組(無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞)。每孔100 μL，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后棄96孔板中液體，加入PBS清洗兩次，棄PBS。加入100 μLCCK-8溶液(CCK-8原液：無(wú)血清培養(yǎng)基=1∶10)，5% CO2，37 ℃條件下孵育3 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率(簡(jiǎn)稱(chēng)A549抑制率)，每組試驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。

B=(A1-A2)/ (A1-A3)×100

式中：B—為A549抑制率，%；A1—為對(duì)照組的OD值；A2—為加藥組的OD值；A3—為空白組的OD值。

1.3.4 正交分析優(yōu)化酶解條件

在初步確定酶解條件的基礎(chǔ)上，以A549抑制率為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳酶解條件。各因素水平見(jiàn)表1。表中：A—酶解時(shí)間；B—酶添加量；C—酶解溫度。

表1 菲律賓蛤仔酶解L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The level of L9 (34) orthogonal test for the enzymatic hydrolysis of Manila clam

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔基本成分

通過(guò)對(duì)菲律賓蛤仔蛤肉(濕樣)基本成分的測(cè)定可知，其水分含量(83.93±0.25)%，粗蛋白含量(9.44±0.05)%，灰分含量(1.73±0.01)%，粗脂肪含量(0.44±0.01)%。徐律等[19]測(cè)得浙江菲律賓蛤仔蛤肉(濕樣)中水分含量84.5%，粗蛋白含量10.7%，灰分含量2.1%，粗脂肪含量0.5%。董輝等[8]測(cè)得山東菲律賓蛤仔蛤肉(濕樣)中水分含量82.7%，粗蛋白含量9.63%，灰分含量2.63%，粗脂肪含量0.54%。造成菲律賓蛤仔蛤肉中水分、粗蛋白、灰分和粗脂肪含量差異的可能原因是產(chǎn)地及捕撈月份的不同。菲律賓蛤仔蛤肉濕樣中粗蛋白含量9%～11%，由此可見(jiàn)，菲律賓蛤仔是一種高蛋白的海洋貝類(lèi)，可作為獲取生物活性肽的重要資源。

2.2 不同蛋白酶酶解菲律賓蛤仔效果的比較

根據(jù)表2，不同蛋白酶水解菲律賓蛤仔所獲得的酶解液中ANN含量不同(風(fēng)味蛋白酶>胰蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶>胃蛋白酶)。其中，胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解能力順序與徐律等[18]的試驗(yàn)結(jié)果相同；風(fēng)味蛋白酶酶解液中的ANN含量最高，胃蛋白酶最低。由此推測(cè)，菲律賓蛤仔中可能含有較多的風(fēng)味蛋白酶酶切位點(diǎn)，含有較少的胃蛋白酶酶切位點(diǎn)，也可能是由于風(fēng)味酶專(zhuān)一性不強(qiáng)，其可從蛋白質(zhì)的N端或C端進(jìn)行隨機(jī)酶切，因此，風(fēng)味蛋白酶酶解菲律賓蛤仔酶解液中含有較多的游離氨基酸[20]。同時(shí)，5種蛋白酶所獲得的酶解多肽對(duì)A549細(xì)胞增殖均具有抑制作用。在20mg/mL濃度下，胃蛋白酶酶解多肽對(duì)A549抑制率高達(dá)99.22%，胰蛋白酶最低，抑制率僅51.39%。雖然中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解液中ANN含量均比胃蛋白酶高，但其對(duì)A549抑制率遠(yuǎn)低于胃蛋白酶(P<0.05)。綜合考慮ANN含量和A549抑制率，最終選用胃蛋白酶進(jìn)行下一步試驗(yàn)研究。

表2 不同蛋白酶對(duì)菲律賓蛤仔酶解效果的比較Tab.2 Comparison of the effects of different proteaseson the enzymatic hydrolysis of Manila clam

注：同列不同小寫(xiě)字母數(shù)值間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 胃蛋白酶單因素試驗(yàn)

2.3.1 時(shí)間因素

在胃蛋白酶添加量1 000 U/g、酶解溫度37 ℃、料液比(w/w)1∶1、pH 2.0的條件下考察不同的酶解時(shí)間對(duì)菲律賓蛤仔的酶解效果的影響(圖1)。

由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中ANN含量逐漸升高，且這6個(gè)時(shí)間段的酶解多肽對(duì)A549均有明顯抑制作用，抑制率均高于95%。經(jīng)方差分析，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h和8 h時(shí)，酶解多肽的A549抑制率具有顯著差異(P<0.05)。菲律賓蛤仔酶解液對(duì)A549的抑制作用并不是隨ANN含量升高而逐漸增大，酶解液中ANN含量與A549抑制率沒(méi)有直接的正相關(guān)性。楊詠芳[21]等通過(guò)研究紫貽貝酶解多肽體外抗腫瘤活性亦證明了這一點(diǎn)?？紤]蛋白自身營(yíng)養(yǎng)特性，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易滋生有害微生物，因此選用2 h作為最佳酶解時(shí)間。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)菲律賓蛤仔酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the enzymatic hydrolysis of Manila clam

2.3.2 加酶量因素

當(dāng)酶解時(shí)間2 h、酶解溫度37 ℃、料液比(w/w)1∶1、pH 2.0時(shí)，考察不同胃蛋白酶添加量對(duì)菲律賓蛤仔的酶解效果的影響(圖2)。

圖2 酶添加量對(duì)菲律賓蛤仔酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the enzymatic hydrolysis of Manila clam

由圖可知，酶添加量在500～2 000 U/g范圍時(shí)，ANN含量隨酶添加量的增加而迅速增長(zhǎng)；酶添加量高于2 000 U/g時(shí)，ANN含量增長(zhǎng)隨酶添加量的增加而緩慢增長(zhǎng)。這是因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度不斷降低，蛋白酶與底物的碰撞機(jī)率降低，使得酶解液中ANN 含量增長(zhǎng)緩慢[22]。酶添加量為2 000 U/g時(shí)，酶解多肽對(duì)A549的抑制率最高，達(dá)到96.14%，與500 U/g、1 000 U/g酶添加量水平下酶解多肽的A549抑制率具有顯著差異(P<0.05)。綜合考慮兩個(gè)因素，選擇酶添加量2 000 U/g進(jìn)行下一步研究。

2.3.3 溫度因素

當(dāng)酶解時(shí)間2 h、酶添加量2 000 U/g、料液比(w/w)1∶1、pH 2.0時(shí)，考察不同酶解溫度對(duì)菲律賓蛤仔的酶解效果的影響(圖3)。

圖3 酶解溫度對(duì)菲律賓蛤仔酶解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the enzymatic hydrolysis of Manila clam

酶解溫度是影響蛋白酶活性最主要的因素之一。由于蛋白酶分子具有特定的空間結(jié)構(gòu)，如果酶解溫度過(guò)高，蛋白酶分子的空間結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破環(huán)，使蛋白酶活性降低或失活；溫度過(guò)低，分子運(yùn)動(dòng)不夠劇烈，會(huì)降低酶解反應(yīng)速度[23]。由圖3可知，酶解液中的ANN含量先增后減，在37 ℃時(shí)達(dá)到最高。這可能是溫度超過(guò)37 ℃后，胃蛋白酶分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，致使其活性降低，使得胃蛋白酶與底物的反應(yīng)程度降低。這5個(gè)酶解溫度條件下的酶解多肽對(duì)A549均有明顯的抑制作用，且抑制率均高于95%。經(jīng)方差分析，酶解溫度為40 ℃和43 ℃時(shí)，酶解多肽的A549抑制率具有顯著差異(P<0.05)。綜合考慮ANN含量和A549抑制率，最終選用37 ℃作為最佳酶解溫度。

2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶解時(shí)間(A)、酶添加量(B)和酶解溫度(C)這3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。由極差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A、B和C對(duì)A549抑制作用的影響大小依次為B>C>A，其中誤差列的Rj值較小，說(shuō)明這3個(gè)因素之外的其他因素對(duì)A549抑制作用的影響較小，因素的最佳組合為A1B2C2。

對(duì)菲律賓蛤仔酶解正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表4)，結(jié)果表明，在對(duì)A549抑制作用的影響中，酶添加量對(duì)A549抑制率影響最顯著。在料液比和pH固定的情況下，最終確定菲律賓蛤仔酶解最佳工藝為：料液比(w/w)1∶1，pH 2.0，酶解時(shí)間1 h，酶添加量2 000 U/g，酶解溫度37 ℃。此時(shí)，菲律賓蛤仔酶解多肽對(duì)A549的抑制率達(dá)99.83%，ANN含量為0.147 0 g/100 mL。

表3 菲律賓蛤仔酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test of the enzymatic hydrolysis of Manila clam

表4 菲律賓蛤仔酶解正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.4 Variance analysis of the orthogonal test results of the enzymatic hydrolysis of Manila clam

3 結(jié)論

菲律賓蛤仔的5種酶解產(chǎn)物中，風(fēng)味蛋白酶酶解菲律賓蛤仔酶解液中氨基態(tài)氮含量最高；而當(dāng)設(shè)定酶解多肽濃度為20 mg/mL時(shí)，胃蛋白酶獲得的酶解多肽抗腫瘤活性最高，其A549抑制率高達(dá)99.22%，表明酶的種類(lèi)對(duì)菲律賓蛤仔酶解液ANN含量和酶解多肽的抗腫瘤活性有較大影響。在考察胃蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)菲律賓蛤仔的酶解效果的影響中，酶解液對(duì)A549的抑制作用并不是隨ANN含量升高而逐漸增大或先增后減。其原因可能是菲律賓蛤仔酶解液中ANN含量與A549抑制率沒(méi)有直接的正相關(guān)性。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交分析法優(yōu)化菲律賓蛤仔抗腫瘤活性多肽制備工藝，從而確定最佳酶解條件為：胃蛋白酶添加量2 000 U/g，料液比(w/w)1∶1，pH 2.0，酶解時(shí)間1 h，酶解溫度37 ℃，此時(shí)，菲律賓蛤仔酶解多肽對(duì)A549的抑制率達(dá)99.83%。研究表明，胃蛋白酶酶解菲律賓蛤仔獲得的酶解多肽對(duì)A549細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。

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Study on preparation of antitumor peptides fromRuditapesphilippinarumby enzymatic method

CAI Kangpeng1,WU Jingna2,CAI Shuilin2,PAN Nan2,SU Yongchang2,LIU Zhiyu2,XIAO Meitian1

(1CollegeofChemicalEngineering,HuaqiaoUniversity,Xiamen361021,China;2FisheriesResearchInstituteofFujian,NationalResearchandDevelopmentCenterforMarineFishProcessing,KeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince,FujianCollaborativeInnovationCenterforExploitationandUtilizationofMarineBiologicalResources,Xiamen361013,China)

In order to develop the optimum process of anti-cancer peptides preparation from Ruditapes philippinarum,five proteases were selected to hydrolyze the clams under the same solid-liquid ratio,reaction time,enzyme dosage,optimum temperature and pH conditions.The amino nitrogen content and antitumor activity were measured using formaldehyde potentiometric titration and Cell counting kit-8(CCK-8) methods,respectively,and the correlation between the two indexes was analyzed.Enzymolysis conditions were optimized using single factor experiment and orthogonal design.The results showed that the enzymatic peptides of flavored protease had the highest content of amino nitrogen; whereas the enzymatic peptides of pepsin had the highest antitumor activity.Optimal hydrolysis conditions of pepsin were confirmed as:solid-liquid ratio 1∶1(w/w),pH value 2.0,reaction time 1 h,enzyme in solid matter 2 000 U/g,and,enzymolysis temperature 37 ℃.At the dose of 20 mg/mL,the enzymatic peptides that were obtained under the optimal conditions had an inhibition rate of 99.83% on A549.Thus the types of enzymes exert significant influence on the antitumor activity of enzymatic peptides,and there was no direct positive correlation between the content of amino nitrogen and the inhibition rate on A549 in the enzymolysis solution ofRuditapesphilippinarum.

Ruditapesphilippinarum; enzymolysis polypeptides; A549; anticancer activity

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.05.009

2016-08-26

2016-09-28

福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014NZ0001-1)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)([2013] 014)；依托平臺(tái)福建省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目 (2014FJPT01);廈門(mén)南方海洋研究中心項(xiàng)目(14PZY017NF17)：海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)

蔡康鵬(1992—)，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)工程。E-mail:1360116792@qq.com

劉智禹(1972—)，男，教授級(jí)高工，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail:negr@163.com

肖美添(1968—)，男，教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail:mtxiao@hqu.edu.cn

R965；R282.74

A

1007-9580(2016)05-047-06