2型糖尿病肝纖維化大鼠中microRNA-29b的表達(dá)變化

汪麗娜，葉華山，鄭 敏，尋亞慧

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院)

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2型糖尿病肝纖維化大鼠中microRNA-29b的表達(dá)變化

汪麗娜1，葉華山2*，鄭 敏2，尋亞慧1

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院)

目的 觀察2型糖尿病大鼠成模前后肝組織中microRNA-29b的表達(dá)，探討?；撬岷蚼icroRNA-29b在小鼠肝纖維化中的作用機(jī)制。方法 將65只大鼠處理后分為正常組、糖尿病模型組和給藥組(?；撬?00mg/kg)。給藥兩個(gè)月后，稱重，測(cè)血糖；取樣稱量肝重，計(jì)算肝臟系數(shù)；肝臟組織切片進(jìn)行HE和Masson染色法；熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(THF-β1)和miRNA-29b的表達(dá)變化。結(jié)果 與正常組比較，模型組肝臟系數(shù)增加，肝組織中TGF-β1水平升高，染色結(jié)果明顯，miRNA-29b含量顯著降低(P均<0.05)；與模型組比較，給藥組肝臟系數(shù)降低(P<0.05)，大鼠肝組織中TGF-β1水平降低，miRNA-29b上調(diào)明顯，纖維化較模型組減輕。結(jié)論 2型糖尿病小鼠肝纖維化可通過牛磺酸上調(diào)microRNA-29b起到一定的抑制作用。

2型糖尿病；肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；牛磺酸

肝臟纖維化主要是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，尤其是在慢性病過程中容易引起肝臟纖維化病變，2型糖尿病是慢性病之一，其主要特征是血糖高，而高血糖明顯促進(jìn)肝纖維化發(fā)展[1]。天然?；撬峥梢詼p少過氧化物含量，增強(qiáng)SOD活性，對(duì)肝細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，對(duì)肝纖維化有保護(hù)作用[2]。四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型經(jīng)?；撬崽幚砗螅瑹o纖維組織沉積，能夠抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和TβRI，明顯抑制肝臟纖維化[3]，本研究就2型糖尿病大鼠肝纖維化模型中microRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)?；撬嵋种聘卫w維化機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 ?；撬豳?gòu)自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司(Origin:USA，批號(hào):15031809)；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司；Trizol購(gòu)自Aidlab(Lot:252250AX)；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體(1∶50)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):18978-1-ap)；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):PV-9000)；濃縮型DAB試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):DA1010)；三諾血糖儀和三諾血糖試紙購(gòu)自長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，全部雄鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供[SPF級(jí)，許可證編號(hào)SYXK(鄂)2013-0071]。

1.3 方法

1.3.1 造模和給藥 65只SD大鼠隨機(jī)抽取17只作為正常組，其余作為糖尿病造模組。正常組大鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液對(duì)照，灌服等量生理鹽水。糖尿病模型組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料，禁食12 h后，腹腔注射小劑量STZ (30 mg/kg，以pH 4.4的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配)，注射第3d，禁食1晚，次日早8點(diǎn)尾尖取血，測(cè)血糖，選擇血糖值大于11.1mmol/L的動(dòng)物(30只)為造模成功的2型糖尿病大鼠模型(剔除死亡的和不成功的)。模型組和給藥組(400mg/kg)，每組15只，兩組持續(xù)喂飼高脂飼料。牛磺酸用生理鹽水配制成混懸液，每天灌服1次，正常組與模型組灌服等量生理鹽水，給藥2個(gè)月。末次給藥后，正常組死亡2只，剩余15只，取6只進(jìn)行檢測(cè)；模型組剩余5只，全部檢測(cè)；給藥組剩余8只，全部檢測(cè)。動(dòng)物禁食過夜，自由飲水，稱重，10%水合氯醛(3.33mL/kg)麻醉大鼠，取肝組織稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)(肝重/體質(zhì)量)。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)和試驗(yàn)方法 使用相關(guān)試劑盒檢測(cè)肝臟組織中microRNA-29b和TGF-β1mRNA水平，將剩余肝臟組織浸于4%的多聚甲醛溶液中固定，制備肝臟組織切片經(jīng)HE染色、Masson染色。熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA時(shí)以GAPDH為參照物，而microRNA-29b以U6為參照物。

熒光定量PCR引物序列表

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血糖、體質(zhì)量和肝臟系數(shù) 2型糖尿病大鼠造模成功后，經(jīng)高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)2個(gè)月，取樣時(shí)每組動(dòng)物例數(shù)，血糖和肝臟系數(shù)明顯升高，體質(zhì)量明顯降低，應(yīng)用牛磺酸治療后禁食血糖較模型組略有降低，體質(zhì)量較模型組有所下降，對(duì)肝臟系數(shù)未見明顯影響，見表1。

表1 各組大鼠的血糖，體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的比較±s)

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 肝臟組織HE染色和Masson染色 肝組織切片經(jīng)HE染色和masson染色后，在顯微鏡下可見隨肝組織不同程度纖維化，紅色肝細(xì)胞中有不同量的藍(lán)色纖維出現(xiàn)。正常組未見明顯纖維化，肝細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠膠原纖維組織明顯增加，增多的膠原纖維形成纖維間隔，分割肝細(xì)胞，使排列整齊的肝細(xì)胞混亂，肝組織纖維化明顯；給藥組可見部分組織染藍(lán)，局部纖維化，與模型組相比，藍(lán)色減少，纖維化減輕，見圖1(封二)。

Masson染色后，從每個(gè)樣本的高倍鏡視野采集圖像隨機(jī)選擇5個(gè)，觀察肝臟纖維變化程度，將纖維化程度分為5級(jí)。0級(jí)：肝組織結(jié)構(gòu)無異常；1級(jí)：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化；2級(jí)：匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；3級(jí)：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；4級(jí)：早期肝硬化[4]。下列表格表示每組肝臟染色后在纖維化程度級(jí)別下的樣本量。可以很直觀的看出每組肝纖維化程度的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。見表2。

表2 Masson染色肝組織纖維化程度[n(%)]

2.3 肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá) 熒光定量PCR結(jié)果見圖2(a)、(b)，模型組較正常對(duì)照組相比TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；給藥組較模型組相比TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖2 (a)、(b)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織中TGF-β1 mRNA

(c)、(d)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織中miRNA-29b

與正常組比較，**P<0.01、*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 肝組織中microRNA-29b的表達(dá) 分別檢測(cè)各組大鼠肝臟中miRNA-29b的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2(c)、(d)所示，與正常組相比，miR-29b在模型組肝臟中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，給藥組與模型組比較miRNA-29b表達(dá)上調(diào)明顯(P<0.05)。

3 討 論

肝星狀細(xì)胞在葡萄糖的刺激下可加快纖維膠原的增生，明顯促進(jìn)肝纖維化的形成，星狀細(xì)胞激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子，加快細(xì)胞外基質(zhì)的累積[5-6]。TGF-β是組織纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，在纖維化中發(fā)揮重要作用[7]。microRNA通過調(diào)控目的基因參與各種生理病理過程，參與了肝組織纖維化的過程，上調(diào)miR-29b和下調(diào)TGF-β1相對(duì)地參與肝星狀細(xì)胞的肝纖維化，且上調(diào)miR-29能夠抑制PDGF-B和TGF-β旁路調(diào)控膠原纖維的生成[8-9]。

有研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸對(duì)纖維化的防治作用，例如?；撬峥赏ㄟ^下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路，減少ECM合成，增加ECM降解、減少促纖維化因子產(chǎn)生等，抑制結(jié)腸纖維化[10]。利用?；撬峥蓽p少膠原纖維I、Ⅲ的形成，改善異丙腎上腺素引起的大鼠心肌纖維化[11]。?；撬峥梢种平M織脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,對(duì)二氧化硅引起的大鼠矽肺纖維化有一定的防治作用[12]，而且?；撬嵩?型糖尿病模型中可改善成人血糖[13]，?；撬嵩诮笛欠矫嬉部赡馨l(fā)揮一定的作用。

綜上所述，從病理學(xué)角度觀察到2型糖尿病肝纖維化模型建成后，其血糖升高，肝臟纖維化明顯，HE及Masson染色結(jié)果明顯出現(xiàn)肝纖維化病變。應(yīng)用牛磺酸治療2個(gè)月，禁食血糖較模型組略有降低，病理學(xué)檢查顯示肝組織膠原纖維減少，纖維化病變程度明顯減輕。2型糖尿病大鼠肝臟TGF-β1表達(dá)較正常組增加，miRNA-29b的表達(dá)減少，應(yīng)用?；撬嶂委?個(gè)月后可見TGF-β1的含量顯著降低，相應(yīng)的，miRNA-29b的含量明顯增加，肝纖維化的病變程度減輕。其機(jī)制可能是?；撬嵩诟闻K中能增加microRNA-29b的水平從而降低TGF-β1的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的堆積和膠原的形成，同時(shí)還可能促進(jìn)膠原和基質(zhì)的降解，減輕肝臟纖維化病變。

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The Expression of MicroRNA-29b in Rats with Hepatic Fibrosis in Type 2 Diabetic Mellitus

WANG Li-na，YE Hua-shan，ZHENG Min，et al

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective The aim of this study was to survey the expression of microRNA-29b on the formation of hepatic in type 2 diabetic rats and explore the effect of microRNA and taurine on liver fibrosis.Methods 65 SD rats were divided into normal group,type 2 diabetes mellitus group and taurine group (400mg/kg).After the treatment of Taurine for two months,body weight,the liver weight,fasting blood glucose and the liver index were determined，HE and Masson staining were used to observe the degree of liver fibrosis,fluorescence quantitative PCR were employed to detect transforming growth factor beta1(TGF-β1) and the expression of microRNA-29b in liver tissue of rat.Results Compared with normal group,the liver coefficient and levels of TGF-β1 of liver tissue increased in model group(P<0.05).Dyeing results show that the fat cavitation and fibrosis of liver tissue of model group increased significantly.The result of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of miRNA-29b decreased markedly(P<0.05).Compared with model group，the liver coefficient of taurine group was decreased(P<0.05) and the level of TGF--1 in liver tissue of rats was decreased.microRNA-29b was increased significantly and the fibrosis was reduced.Conclusion The results suggest taurine may alleviate the formation of hepatic fibrosis to a certain extent in type 2 diabetes mellitus by up-regulating microRNA-29b.

Type 2 diabetes mellitus;Hepatic fibrosis;Transforming growth factor-β1;Taurine

，E-mail：yehuashan@126.com

R587.1

A

2095-4646(2016)05-0375-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.05.0375

2016-04-05)