白細胞介素-6受體基因啟動子區(qū)-183A/G和外顯子9Asp358Ala多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性

張 明 王春萍 劉一帆 張 濤 馬芙蓉 田林紅 何麗蓉

(蘭州大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，甘肅 蘭州 730030)

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白細胞介素-6受體基因啟動子區(qū)-183A/G和外顯子9Asp358Ala多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性

張 明 王春萍1劉一帆 張 濤 馬芙蓉 田林紅 何麗蓉

(蘭州大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，甘肅 蘭州 730030)

目的 探討白細胞介素(IL)-6受體基因啟動子-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性。方法 肥胖組268例，對照組219例，以聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法分析IL-6受體基因型，并進行臨床生化檢測。結(jié)果 對照組Asp358Ala的三種基因型頻率和等位基因頻率分別為AA 28%、AC 45%、CC 27%、A 52%、C 48%，肥胖組相應(yīng)為43%、46%、11%、66%、34%，肥胖組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于對照組(P<0.01)。-183A/G三種基因型頻率和等位基因頻率兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。攜帶A等位基因的患者發(fā)生肥胖的風險是C等位基因的1.809倍(P<0.01)。結(jié)論 IL-6受體基因Asp358Ala多態(tài)性可能與中國人肥胖相關(guān)。

白細胞介素6受體；基因多態(tài)性；肥胖

脂肪能分泌數(shù)十種脂肪細胞因子、激素或其他調(diào)節(jié)物，在機體代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。白細胞介素(IL)-6是一種重要的炎性調(diào)節(jié)因子，具有多種重要的生理功能，參與糖代謝和脂代謝。而IL-6的生物學作用是通過與白細胞介素6受體(IL-6R)相結(jié)合來完成的。對IL-6R基因的掃描發(fā)現(xiàn)，在啟動子區(qū)-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)。SNP是一種不基于假設(shè)的無偏倚的分析方法，因而有最大可能找出疾病的易感基因〔1，2〕。近年來，在不同人種中關(guān)于IL-6R基因多態(tài)性與糖尿病、肥胖、代謝綜合征(MS)之間的研究結(jié)論不一，甚至相互矛盾。本研究探討IL-6R基因啟動子區(qū)-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 肥胖組268例，男142例，女126例，平均年齡(66.2±4.2)歲，彼此之間無親緣關(guān)系，來自2005年6月至2013年9月門診和住院的患者，均符合WHO的肥胖診斷標準；對照組219例，男110例，女109例，平均年齡(64.8±3.1)歲，為同期我院進行健康體檢者；以上人群彼此無親緣關(guān)系且排除2型糖尿病、糖耐量異常、空腹血糖受損或糖耐量異常合并空腹血糖受損者，無2型糖尿病家族史，無冠心病、高血壓、腎病等。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 均測量血壓，脫鞋及穿內(nèi)衣于相同條件下測身高及體重，計算體重指數(shù)(BMI)，平臍測腰圍(WC)?？崭?0 h后于清晨抽取靜脈血，測定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，空腹胰島素(FINS)采用放免法測定(北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司，批內(nèi)CV<10%，批間CV<15%)。對照組與肥胖組在性別構(gòu)成比、年齡、收縮壓〔SBP，(122.7±16.5) vs (124.4±13.1)mmHg〕、舒張壓〔DBP，(78.4±9.5) vs (79.6±12.2)mmHg〕、FPG〔(4.5±0.5) vs (4.6±0.6)mmol/L〕、TC〔(4.10±0.85) vs (4.65±1.05)mmol/L〕無統(tǒng)計學意義。而肥胖組的WC、BMI、TG、LDL-C、FINS均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，HDL-C低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般臨床資料±s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

1.2.2 試劑 DNA抽提試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、引物、限制性內(nèi)切酶BcnⅠ和HinfⅠ，以上試劑均購自北京博大泰克公司。

1.2.3 IL-6R基因啟動子和外顯子多態(tài)性的檢測 ①分離外周血白細胞，經(jīng)細胞裂解液裂解，嚴格按照說明書提取外周血基因組DNA，-20℃?zhèn)溆?。②目的基因的擴增：啟動子-183(A/G)上游引物：5′CGCAGGAGCCCGGCTCTCTACACA3′，下游引物：5′CCATCCGCTCCGGCTTTCGTAACC3′；外顯子9 Asp358Ala上游引物：5′CAGAGGAGCGTTCCGAAGG3′，下游引物：5′GTTAAGCTTGTCAAATGGCCTGTT3′。反應(yīng)體系25 μl，包含10 ng(1 μl)基因組DNA，10×PCR緩沖液2.5 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，0.5 μmol/L引物各1 μl，5 U/μl TaqDNA酶0.2 μl，用18.8 μl雙蒸水補足反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)。72℃終末循環(huán)8 min，置4℃終止反應(yīng)(PCR反應(yīng)儀：美國ABI公司GeneAMP2700)。③鑒定基因型：取PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，各取10 μl，分別以限制性內(nèi)切酶BcnⅠ、HinfⅠ在37℃酶解過夜。2%瓊脂糖于80 V電壓電泳10 min，溴乙啶染色后在紫外燈下觀察基因型。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，組間比較進行t和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 IL-6R基因-183(G/A)和Asp358Ala多態(tài)性位點等位基因和基因型頻率分布 PCR酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下可看到：在啟動子-183(A/G)多態(tài)性檢測時，AA純合子為208 bp和11 bp兩條帶；GG純合子為143 bp、65 bp、11 bp三條帶；AG雜合子為208 bp、143 bp、65 bp、11 bp四條帶；在外顯子9Asp358Ala多態(tài)性檢測時，AA純合子為188 bp和70 bp兩條帶；CC純合子不能被切開，只有258 bp一條帶；AC雜合子為258 bp、188 bp、70 bp三條帶。啟動子區(qū)-183G/A(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)的基因型和等位基因頻率分布在對照中均符合Hardy-Weinberg平衡(P值分別為0.35和0.12)。-183(G/A)基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組和對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而Asp358Ala的基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組中AA基因型明顯多于對照組(P<0.01)。等位基因分布分析提示，A等位基因頻率在肥胖組中多見(P<0.01)。在等位基因頻率的比較中，OR值為1.809 (95%CI1.397 ～2.344)，即攜帶有A等位基因發(fā)生肥胖的風險是C的1.809倍。見表2。

表2 兩組IL-6R基因Asp358Ala和-183(G-A)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.2 IL-6R基因Asp358Ala各基因型與WC和BMI的相關(guān)性 Asp358Ala不同基因型(AA、AC、CC)間比較，WC〔(92.3±9.8)，(87.9±8.9)和(85.8±9.4)cm，P<0.01〕和BMI〔(30.5±5.3)，(28.5±4.7)和(26.1±3.8)kg/m2，P<0.01〕差異有統(tǒng)計學意義。外顯子9的Asp358等位基因純合子的WC和BMI高于其他基因型攜帶者。

3 討 論

IL-6是多功能細胞因子，通過對多種靶細胞的作用，對細胞的生長、分化及某些基因的表達發(fā)揮調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)作用，參與糖代謝和脂代謝〔3〕。IL-6與肥胖的關(guān)系非常密切，IL-6R基因位于染色體1q21.3，-183G/A(rs4845617)是位于IL6R基因啟動子區(qū)的變異，該位點是核因子(NF)-1的結(jié)合位點，NF-1對IL-6R基因有激活和阻遏作用，從而影響IL-6R基因的轉(zhuǎn)錄和表達〔4〕，推測可能會影響糖代謝和脂代謝。但在本研究中-183G/A(rs4845617)的多態(tài)性和肥胖無關(guān)，說明-183A/G變異在甘肅漢族人群中對肥胖無影響。Asp358Ala(rs8192284 A/C)是位于外顯子9的A/C多態(tài)性，可引起錯義突變，引起Asp358Ala的氨基酸替代。

近年來國內(nèi)外對IL-6R基因多態(tài)性與肥胖、2型糖尿病、MS的關(guān)系的研究結(jié)論不一。有研究顯示，在Pima印第安人〔5〕中啟動子區(qū)-183G/A(rs4845617)和外顯子9 Asp358Ala(rs8192284 A/C)的多態(tài)性與肥胖相關(guān)，但在美國白人〔6〕和丹麥白人〔7〕中外顯子9的A/C多態(tài)性與肥胖無關(guān)而與2型糖尿病相關(guān)。這說明該位點多態(tài)性的影響在不同種族存在差異。即使在中國漢族人群中的研究，結(jié)論也不一致，閆彩鳳等〔8〕認為rs4845617和rs8192284多態(tài)性在北京人群中與BMI和WC相關(guān)，而Jiang等〔9〕在廣州人群中提示該多態(tài)性與肥胖不相關(guān)而與血糖和MS相關(guān)。本課題組既往在甘肅漢族人群中的研究發(fā)現(xiàn)〔10,11〕，IL-6R基因Asp358Ala與2型糖尿病和MS相關(guān)。本研究為避免糖代謝異常對IL-6R基因多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率的影響，在樣本的選擇上剔除了2型糖尿病、糖耐量異常、空腹血糖受損以及糖耐量異常合并空腹血糖受損的患者。 本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs8192284的多態(tài)性與甘肅漢族人中的肥胖有相關(guān)性，Asp等位基因攜帶者與Ala等位基因攜帶者比較，肥胖的易感性增加，說明Asp358純合子發(fā)生肥胖的危險性較高。

IL-6R基因Asp358Ala導(dǎo)致肥胖易感性增加的可能機制是基因變異影響了可溶性白細胞介素6受體(sIL-6R)水平，但是sIL-6R的減少通過哪些機制來增加肥胖的易感性，目前仍不太清楚。

總之，甘肅人群中發(fā)現(xiàn)IL6R基因外顯子9Asp358Ala和啟動子-183(A→G)存在多態(tài)性，而且外顯子9Asp358Ala多態(tài)性與肥胖易感性有關(guān)聯(lián)。但肥胖是一種多基因及環(huán)境因素聯(lián)合作用的病因復(fù)雜疾病。對于大多數(shù)的肥胖來說，是否存在一個或幾個主效基因目前尚未肯定，還需要更大樣本的深入研究。

1 賈偉平.對代謝綜合征的探索和研究在繼續(xù)〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010；26(9)：737-9.

2 朱嘯光，寧 光.2型糖尿病的全基因組關(guān)聯(lián)研究〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010；26(12)：1094-6.

3 Kershaw E，F(xiàn)lier J.Adipose tissue as an endocrine organ〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(6)：2548-56.

4 Gronostajski R.Roles of the NFI/CTF gene family in transcription and development〔J〕.Gene,2000;249(2)：31-45.

5 Wolford JK，Colligan PB，Gruber JD，etal.Variants in the interleukin 6 receptor gene are associated with obesity in Pima Indians〔J〕.Mol Genet Metab，2003;80(3)：338-43.

6 Wang H，Zhang Z，Chu W，etal.Molecular screening and association analyses of the interleukin 6 receptor gene variants with type 2 diabetes，diabetic nephropathy and insulin sensitivity〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2005;90(2)：1123-9.

7 Hamid YH，Urhammer SA，Jensen DP，etal.Variation in the interleukin-6 receptor gene associates with type 2 diabetes in Danish whites〔J〕.Diabetes，2004;53(12)：3342-5.

8 閆彩鳳，向紅丁，陳 偉，等.白細胞介素6受體基因多態(tài)性與肥胖的關(guān)聯(lián)研究〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010;26(2)：125-6.

9 Jiang QJ，Lam TH，Liu B，etal.Interleukin-6 receptor gene polymorphism modulates interleukin 6 levels and the metabolic syndrome：GBCS-CVD〔J〕.Obesity，2010;18(10)：1969-74.

10 張 明，田林紅.白細胞介素6受體基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性〔J〕.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2006;23(6)：662-4.

11 張 明，陳 慧，張 濤，等.白細胞介素6受體基因多態(tài)性與代謝綜合征的相關(guān)性研究〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2012;28(7)：572-4.

〔2015-05-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

甘肅省自然科學基金(No.1506KJZA239);蘭州市科技計劃項目(2011-2-61)；甘肅省科技支撐計劃-社會發(fā)展計劃項目(No.0708NKCA099)

王春萍(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事小兒內(nèi)分泌基礎(chǔ)與臨床研究。

張 明(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌代謝病基礎(chǔ)與臨床研究。

R589

A

1005-9202(2016)20-5021-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.036

1 蘭州市婦幼保健院兒科