復(fù)方恩諾沙星對畜禽主要病菌體外抑菌試驗(yàn)

曹志梅（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心 030800）閆芳（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系 030801）

復(fù)方恩諾沙星對畜禽主要病菌體外抑菌試驗(yàn)

曹志梅（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心 030800）閆芳（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系 030801）

采用紙片擴(kuò)散法 (K-B法)測定復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的敏感性大小，采用試管倍比稀釋法測定復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度 (MBC)。結(jié)果表明，病原性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄菌、雞巴氏桿菌、豬巴氏桿菌、鏈球菌對復(fù)方恩諾沙星可溶性粉敏感，復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.0279～3.575μg/ml，最小殺菌濃度為（MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

復(fù)方恩諾沙星；可溶性粉；化學(xué)抗菌藥；最小抑菌濃度（MIC）；最小殺菌濃度（MBC）；畜禽主要病菌；體外；抑菌試驗(yàn)

復(fù)方恩諾沙星可溶性粉主要成分為恩諾沙星和乙酰甲喹。恩諾沙星于1983年由公司合成，因其抗菌廣譜、安全性高而被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[1-3]。恩諾沙星是第一種畜禽專用的氟喹諾酮類藥物，抗菌譜廣，殺菌活性強(qiáng)，對革蘭氏陰性菌和陽性菌、細(xì)胞內(nèi)病原菌、支原體及一些耐藥菌株有很強(qiáng)的抗菌活性。其通過抑制細(xì)菌的DNA合成酶中的回旋酶達(dá)到殺菌作用，同時(shí)本品對細(xì)菌細(xì)胞膜具有損傷作用，可以使細(xì)菌的內(nèi)容物流失而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，雙重殺菌作用。乙酰甲喹又名痢菌凈，化學(xué)名稱為3-甲基-2-乙酰基-N-1，4-二氧喹噁啉，是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所研制的化學(xué)抗菌藥，具有較廣的抗菌譜和較強(qiáng)的體內(nèi)外抗菌活性。獸醫(yī)臨床上主要用于治療豬痢疾及畜禽消化道細(xì)菌感染。本實(shí)驗(yàn)通過測定恩諾沙星對畜禽主要致病菌的敏感性大小、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），擬為臨床治療疾病時(shí)制定更為合理的方案提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株種類，見表1。

1.1.2 供試藥物

復(fù)方恩諾沙星可溶性粉，山西奧福萊動物藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號040502，200g，恩諾沙星12g，乙酰甲喹20g。

1.1.3 培養(yǎng)基

MH瓊脂培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基，鮮血MH瓊脂培養(yǎng)基，血清MH肉湯培養(yǎng)基。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

定性試紙，試管，培養(yǎng)皿，打孔器，鑷子，無菌棉，酒精燈，溫箱。均由本試驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥敏紙片制備

表1 抑菌試驗(yàn)用菌株

取新華1號定性濾紙，用打孔機(jī)打成6.25mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片100片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20min高壓滅菌后，放在37℃溫箱或烘箱中1～2d，使完全干燥。在上述含有100片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.7ml，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時(shí)不能將紙片搗爛。放37℃溫箱內(nèi)干燥后即加蓋密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放備用[4-6]。

1.2.2 試驗(yàn)菌液制備

從培養(yǎng)了16～24h的斜面上挑取菌落于滅菌生理鹽水中，并將其懸液濁度調(diào)至0.5號麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管，直接用此鹽水懸液作為接種物，菌量約1×108cfu/ml[7-9]。

1.2.3 供試藥液配制

精確稱取1g藥物先加入0.1mol/L的NaOH溶液10ml，再加入pH7.2的PBS液32ml， 混勻[10]。

1.2.4 K-B紙片法

用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，并在管壁上擰壓除去多余菌液后置于培養(yǎng)基平板表面反復(fù)推涂，以保證細(xì)菌在平板表面均勻分布，蓋上平皿蓋在室溫干燥3～5min，用無菌鑷子或紙片分配器放置藥敏紙片，各紙片中心距不小于24mm，紙片據(jù)平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。貼完紙片后，在15min內(nèi)將平板反轉(zhuǎn)過來，置于溫箱中，培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果[11]。

1.2.5 試管倍比稀釋法

藥物的濃度按倍比稀釋來建立，試驗(yàn)要在無菌條件下于適宜的玻璃試管中進(jìn)行。試驗(yàn)中取10支試管排成一列，在第1管中加入1ml藥液和1ml滅菌肉湯。第2～10管均加入1ml滅菌肉湯。第1管混勻后取1ml的量加入到第2管中，混勻后從第2管中取1ml的量加入到第3管中，依次類推到第10管，混勻后取1ml的量棄掉。另取兩管分別加入1ml滅菌肉湯和而不加藥物，其中一管作為細(xì)菌生長情況對照，另一管作為空白對照。將2.2.2中制備好的試驗(yàn)菌液加入到第1～11管中，每管加入量為0.1ml，35℃培養(yǎng)16～24h后肉眼觀察，呈明顯不混濁的試管所含最小的藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）；繼續(xù)培養(yǎng)至48h，肉眼觀察呈不混濁的試管所含最小的藥物濃度為最小殺菌濃度（MBC）[12-13]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

K-B紙片法試驗(yàn)結(jié)果，見表2。最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度 (MBC)試驗(yàn)結(jié)果，見表3。

表2 K-B紙片法試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果的因素

藥敏試驗(yàn)結(jié)果易受抗菌藥物紙片含藥量、培養(yǎng)基、接種細(xì)菌菌量、培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響。

抗菌藥物紙片含藥量是影響抑菌圈大小的主要因素，而紙片含藥量又與紙片的重量、吸水性、直徑等有關(guān)，首先制備藥敏紙片應(yīng)選則合格紙片，要求所用濾紙的吸水性好，均勻，不含無關(guān)的化學(xué)物質(zhì)和色素等，直徑為6.25 mm，制備藥敏紙片時(shí)藥物應(yīng)稱量準(zhǔn)確，藥液應(yīng)搖勻，浸泡應(yīng)充分，制備好的紙片應(yīng)妥善保存，保存條件以低溫干燥為佳，最好保存于-20℃，以防藥力降低。藥敏紙片制備后立即用標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株作敏感試驗(yàn)，并記錄其抑菌圈直徑，每次用前應(yīng)復(fù)查1次。

藥敏試驗(yàn)強(qiáng)調(diào)使用專門培養(yǎng)基MHA，但考慮到本試驗(yàn)所用的試驗(yàn)菌株均來自發(fā)病畜禽體內(nèi)分離的病原菌（購自中監(jiān)所），為了能夠使多種細(xì)菌都能生長發(fā)育良好，有些細(xì)菌如沙門氏菌、巴氏桿菌和鏈球菌等特選用了鮮血MH瓊脂培養(yǎng)基，血清MH肉湯培養(yǎng)基。制備K–B法培養(yǎng)基厚度應(yīng)為4mm，平皿用直徑90mm的較好。據(jù)報(bào)道，做藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基厚度相差2mm，抑菌圈直徑最大也會相差2mm，為了防止因培養(yǎng)基厚度而造成的試驗(yàn)誤差，應(yīng)嚴(yán)格控制每個(gè)瓊脂平板的厚度，用直徑為90mm的平皿傾注約15m1普通營養(yǎng)瓊脂液體，保證瓊脂厚度為4mm。

表3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度(MBC)試驗(yàn)結(jié)果

接種菌量應(yīng)稀釋到濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，相?dāng)于1×108cfu/ml，若菌稀釋倍數(shù)偏高，菌液濃度偏低，導(dǎo)致接種菌量太少，雖然菌性不變，但抑菌圈直徑常增大，易將耐藥藥物誤判為敏感藥物，相反，若菌料稀釋倍數(shù)偏低，菌液濃度偏高，導(dǎo)致接種菌量太多，抑菌圈直徑常變小，有可能將敏感藥物誤判為耐藥藥物。

細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長，細(xì)菌能恢復(fù)生長，使抑菌圈變小，培養(yǎng)時(shí)間過短，抑菌圈還未最終形成，這都可能影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判定，有可能將敏感藥物與耐藥藥物混淆，因此測定了細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間，分別制定了不同病原菌觀察結(jié)果最佳時(shí)間。

總之，在試驗(yàn)操作的各個(gè)環(huán)節(jié)中都應(yīng)嚴(yán)格按照試驗(yàn)要求進(jìn)行，盡可能地避免系統(tǒng)誤差，減小隨機(jī)誤差，以提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。

3.2 結(jié)果分析

藥敏試驗(yàn)的目的是對抗生素臨床治療效果進(jìn)行預(yù)測，查出耐藥性，減少治療錯(cuò)誤，同時(shí)可以根據(jù)敏感、中介、耐藥的提示結(jié)合MIC可以方便地制定用藥方案。藥敏試驗(yàn)時(shí)，正確選擇病原菌顯得更為重要，本試驗(yàn)所用的試驗(yàn)菌株均來自發(fā)病畜禽體內(nèi)分離的病原菌，可以有效反映復(fù)方恩諾沙星可溶性粉的抗菌譜，結(jié)果表明其對來源于雞及豬的病原性大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄菌、雞巴氏桿菌、豬巴氏桿菌、病原性鏈球菌均敏感，對雞沙門氏菌不敏感，復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.0279～3.575μg/ml， 最小殺菌濃度為 （MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

藥敏試驗(yàn)是一種體外試驗(yàn)，細(xì)菌在體外對抗生素耐藥，在體內(nèi)也會耐藥，而在體外敏感的體內(nèi)就不一定敏感，所以耐藥是藥敏試驗(yàn)的正結(jié)果。因此，在預(yù)側(cè)體內(nèi)結(jié)果時(shí)，耐藥的結(jié)果可以確信，而敏感的應(yīng)保持懷疑。雖然藥敏試驗(yàn)是藥物在體外的抑菌試驗(yàn)，結(jié)果能否完全代表藥物在動物體內(nèi)的動力學(xué)代謝過程及藥物在動物體內(nèi)的抑菌效果有待進(jìn)一步研究，但可以從側(cè)面提供用藥的依據(jù)，指導(dǎo)生產(chǎn)及時(shí)準(zhǔn)確地控制細(xì)菌性疾病。

有條件的養(yǎng)殖場最好開展細(xì)菌耐藥性監(jiān)測。用藥物之前最好先做藥敏試驗(yàn)。用藥要科學(xué)合理，劑量要足，療程要夠，防止藥物濃度達(dá)不到殺菌濃度而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。盡量減少預(yù)防性投藥，不濫投藥，盡量交換用藥，并注意聯(lián)合用藥，防止交叉耐藥性的產(chǎn)生。搞好消毒，防止耐藥菌株的擴(kuò)散。

4 結(jié)論

復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對大腸桿菌1555、大腸桿菌216、大腸桿菌1515、綠膿桿菌2087、金黃色葡萄菌547、雞巴氏桿菌458、豬巴氏桿菌437、鏈球菌608敏感，對沙門氏菌cvcc533不敏感。

復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為 0.0279～3.575μg/ml， 最小殺菌濃度為（MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

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